Электрофоретическое разделение белков

Рис. 3-6. Электрофоретическое разделение белков плгрмы человека пятью различными методами при pH 8. а — электрофорез без носителя б — электрофорез на бумаге в — электрофорез в крахмальном геле г — электрофорез в полиакриламидном геле д — иммуноэлектрофорез (полосы прештитации к поливалентной антисыворотке человека). Стрелки показывают положение отдельных белков плазмы.

Принцип метода. Иммуноэлектрофорез представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белков с двойной диффузией и иммунопреципитацией в геле. Вслед за электрофоретическим разделением белков в агаровом геле навстречу полученным фракциям диффундирует специфическая иммунная сыворотка. Этот метод позволяет характеризовать белки не только по скорости миграции в электрическом поле, но и по антигенным свойствам. [c.137]

Для высаливания или желатинирования белков целесообразно приводить их в изоэлектрическое состояние. Этого можно достигнуть, поместив белки в буферный раствор со значением pH, равным их изоэлектрической точке. В других случаях, например при электрофоретическом разделении белков, нужно, чтобы они, наоборот, имели достаточный заряд. Для этого белковую смесь помещают в буферные растворы со значением pH, отличающимся от их изоэлектрической точки. [c.188]

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ [c.88]

Оборудование для свободного электрофореза и ультрацентрифугирования достаточно дорого и сложно по своему устройству, что ограничивает широкое применение этих методов. Поэтому возникла идея замены свободного электрофореза (электрофоретического разделения белков в растворе) электрофорезом в специальной поддерживающей среде, который основан на том же принципе, но намного проще в осуществлении. [c.10]

Студентам предлагается провести электрофоретическое разделение белков сыворотки крови. [c.92]

Разделение белков методом электрофореза на бумаге. В последнее время при исследовании белков, кроме фракционирования высаливанием, широко начали применять электрофоретическое разделение белкового комплекса, а также количественное определение отдельных фракций белков. Нередко электрофорез объединяют с хроматографией. В настоящее время есть множество приемов электрофоретического и хроматографического анализа белковых веществ, в связи с чем разработано много различных аппаратов для электрофоретического разделения белков. [c.44]

Весьма эффективным является использование микрофильтров на основе ацетатов целлюлозы в качестве стационарной фазы для электрофоретического разделения белков сыворотки крови и других высокомолекулярных веществ. Использование микрофильтров вместо бумаги в электрофоретических методах анализа позволяет в 15—20 раз ускорить проведение анализа. Их существенным преимуществом также [c.219]

НЫМ ИХ изоэлектрической точке. В других случаях, например при электрофоретическом разделении белков, нужно, чтобы они, наоборот, имели достаточный заряд. Для этого белковую смесь помещают в буферные растворы со значением pH, отличающимся от их изоэлектрической точки. [c.217]

Если по окончании электрофоретического разделения белков в агаровом геле навстречу им диффундирует специфическая иммунная сыворотка, то в местах встречи антигена и антител образуются дугообразные полосы преципитации, каждая из которых соответ- [c.20]

Электрофорез. При напряжении 120 В электрофоретическое разделение белков сыворотки крови продолжается 4—5 ч. Оптимальный градиент напряжения 3—6 В/см. В этих условиях можно проводить электрофорез без специального охлаждения и в то же время не опасаться высыхания геля. При увеличении силы тока происходит падение напряжения, поэтому необходимо несколько раз во время сеанса электрофореза проверять напряжение в цепи. [c.139]

Камеру с агаровыми пластинками закрывают крышкой и включают ток. Если напряжение, измеренное на краях агаровой пластинки, достигает 45 В, то электрофоретическое разделение белков закончится уже через 45—60 мин. [c.142]

Электрофорез на бумаге. Электрофоретическое разделение белков основано на том, что каждая фракция при определенном pH в электрическом поле движется по хроматографической бумаге с различной скоростью. [c.45]

Прибор состоит из двух электродных сосудов 1, в которых налит боратный буферный раствор 2 с pH = 8,6 (табл. 2). Сосуды вставлены в ванну 8, закрытую крышкой 9. Полоса фильтровальной хроматографической бумаги 3 размером 4 X 35 см, на которой происходит электрофоретическое разделение белков, находится в увлажненной камере 4, а концы ее погружены в электродные сосуды с боратным буфером. Выравнивание жидкости в сосудах достигается при помощи временно [c.45]

В отчет следует внести обоснование метода электрофоретического разделения белков, краткое описание работы, приложить полученную электрофореграмму и объяснить, какому белку отвечает каждая полученная окрашенная полоса. [c.126]

В последнее время установлено, что один и тот же фермент, например дегидрогеназа молочной кислоты, изомераза глюкозо-6-фосфата, амино-трансферазы и многие другие, могут существовать в различных формах, образуя так называемые семейства ферментов. Отдельные компоненты этих семейств, получившие названия изоферментов (или изоэнзимов, иначе — изозимов) незначительно отличаются друг от друга как по своему аминокислотному составу, так и по физико-химическим свойствам, например по электрофоретической подвижности, даже по активности, а также по иммунобиологическим реакциям. Различиями в значениях изоэлектрических точек и величинах электрофоретической подвижности объясняется и тот факт, что при электрофоретическом разделении белков сыворотки или плазмы крови (стр. 23) один и тот же фермент удается обнаружить в различных фракциях сывороточных белков. [c.128]

Разделение белковых фракций сыворотки можно осуществить путем высаливания (см. работу 41), отделяя каждую выпавшую фракцию фильтрованием. Более совершенным является электрофоретическое разделение белков сыворотки и применение гельфильтрации (стр. 55). [c.225]

Электрофоретическое разделение белков в водной среде основано на способности их заряженных частиц перемещаться относительно растворителя под влиянием внешнего электрического поля. Если концентрация водородных ионов в растворителе не равна изоэлектрической точке, то скорость перемещения частиц зависит от величины их свободного заряда, размера и формы. Поскольку даже близкородственные белки, например, некоторые фракции сывороточного альбумина, имеют весьма различную электрофоретическую подвижность и поскольку их подвижность изменяется неодинаково при изменениях pH и состава буферных растворов, электрофорез может быть с успехом применен для разделения белковых смесей и характеристики отдельных белков. [c.164]

I В работе Г. В. Троицкого (Биохимия, 15, 426, 1950) показано, что 3-глобулины сыворотки крови очень легко образуют соединения с каротином и витамином А, причем при электрофоретическом разделении белков как каротин, так и витамин Л остаются соединенными с 3-глобулинами.— Прим. ред. [c.177]

Четыре вышеупомянутые электролитические системы (разд. 3.3.1) применяют не только для электрофоретического разделения белков, но также с целью охарактеризовать белки, т. е. определить изоэлектрическую точку, молекулярную массу и суммарный электрический заряд при данных значениях pH и ионной силы. [c.118]

В результате электрофоретического разделения белков сыворотки крови выделяют 5-6 фракций, состав которых представлен в табл. 6. [c.44]

Предоставленный в лабораторию биоматериал должен соответствовать требованиям, которые предъявляются к биохимическому анализу. Например, для электрофоретического разделения белков нужна сыворотка, а для определения активности ренина — плазма крови. Иногда для сохранения [c.523]

Другой метод определения ИЭТ основан на электрофоретическом разделении белков в среде с градиентом pH. В этом случае каждый белок движется к той зоне градиента, в которой значение pH соответствует его ИЭТ. Этот метод носит название изоэлектрического фокусирования. Он был детально описан в гл. 1.12. [c.213]

В некоторых случаях, например когда в результате длительной очистки удается получить лишь очень малые количества материала ИЛИ при необходимости исследовать компоненты отдельных клеток, приходится прибегать к микроварианту электрофоретического разделения белков и нуклеиновых кислот. В то же время микроанализ в полиакриламидном геле сам по себе обладает рядом преимуществ. Так, более короткое время, затрачиваемое на проведение электрофореза, а также на окрашивание и обесцвечивание гелей, делает применение микроанализа целесообразньгм даже тогда, когда материала вполне достаточно для макроварианта. Микрометодика при наличии определенного опыта едва ли намного сложнее обычного диск-электрофореза, хотя требует такого специального оборудования, как микропипетки, микроманипулятор, лупа и микроденситометр. Читатели, интересующиеся деталями этого метода, могут обратиться к монографии Нейхоффа [915], в которой поми мо электрофореза освещены и другие виды работ с микроколичествами материала (гомогенизация, диализ, фотометрия, центрифугирование в капиллярах и т. д.). [c.107]

Используя моно специфическую антисыворотку, можно выделять отдельные антигены из смеси с помощью ракетного ИЭФ (гл. 6). Преимущество данного метода заключается в том, что он позволяет получить множество идентичных ракет на ОДНОЙ пластине. Необходимо соблюдать те же указания, что и для двумерного ИЭФ, однако при этом не требуется осуществлять первый этап электрофоретического разделения белков. Метол чувствителен к контаминирующим антителам в так называемой моноспецифической антисыворотке, которые реагируют с другими компонентами смеси антигенов. Поэтому убедитесь, что вы используете для иммунизации только нужную часть ракеты. [c.52]

Согласно методологической программе, изложенной в начале этой главы, удовлетворительный метод измерения генной изменчивости должен давать возможность обнаруживать большинство или все замещения аллелей в локусе и локусы должны выбираться случайно в отношении их физиологической функции и степени изменчивости. Конечно, методом электрофоретического разделения белков нельзя обнаружить все или хотя бы боль- [c.132]

Электрофоретическое разделение белков проводят как в трубочках, так и в тонком слое полиакриламидного геля (слэбе). [c.94]

Поперечносшитые полиакрилимидные гели оказались прекрасными носителями и разделительными матрицами для электрофоретического разделения белков в способах, основанных на плоском слоевом электрофорезе, таких как ДИСК-электрофорез, ДДСН-ПААГ-электрофорез или ИЭФ. Это указывает на гидрофильный характер таких гелей, которые проявляют только слабые взаимодействия с биомолекулами. В КЭ возможно также покрытие кварцевой поверхности акриламидом. [c.75]

Гомогенные гели из полиакриламида широко применяются для электрофоретического разделения белков. Гранулированные гели вполне могут служить носителями для гель-хроматографии в водных средах [11, 12]. Получают гели очень просто. В качестве окислительно-восстановительного катализатора радикальной полимеризации используют главным образом персульфат аммония, а в качестве регулятора — р-диметиламинопропионитрил. Когда слой реакционной массы не слишком велик, полимеризацию можно также инициировать путем облучения видимым светом в присутствии рибофлавина [13]. Готовый гель после лиофильной сушки измельчают в ступке, а затем просеивают или же его продавливают во влажном состоянии через сито с порами соответствующего размера (0,1—0,2 мм). Специальная аппаратура для этой цели описана Хьертеном [14]. Гранулирование можно также проводить, продавливая гель стеклянной пробкой через стальное сито (например, с отверстиями 160 мк) из обычного набора. Величина пор в готовом геле определяется прежде всего общей концентрацией мономера в реакционной массе и во вторую очередь— содержанием бифункционального мономера. Варьируя концентрацию мономера от 4 до 16% при постоянном содержании сшивки 5%, Хьертен [14] получил серию гелей с различной степенью набухания [c.35]

Из исследований в области электрохроматографии следует отметить опубликованную в 1937 г. работу Тизелиуса (электрофоретическое разделение белков) и метод изотахофореза, предложенный Константиновым и Ошурковой. [c.12]

Классической работой по электрофоретическому разделению белков мембран эритроцитов человека является исследование Фейрбанкса и соавт. (1971), в котором предложена номенклатура полипептидных полос, выявляемых в солюбилизированной с помощью додецилсульфата натрия (ДСН) мембране. Этой номенклатурой пользуется в настоящее время большинство ученых. Наличие сетчатой структуры, выстилающей внутреннюю поверхность мембраны эритроцита, было обнаружено непосредственно с помощью электронной микроскопии после обработки клеток неионным детергентом тритоном Х-100. При определенных экспериментальных условиях (в среде с высокой ионной силой и при низкой температуре) применение этого детергента позволяет полностью солюбилизировать липидный бислой и интегральные белки. При этом остается сеть белков, сохраняющая исходную форму клетки, которая представляет собой мембранный скелет (каркас) эритроцита. Он тестируется в виде двухмерной сети филаментов, длина которых зависит от особенностей приготовления препарата для микроскопии. Необходимо отметить, что белки, близкородственные компонентам цитоскелета эритроцитов, обнаружены в ряде неэритроидных клеток. В связи с универсальностью данной системы следует более подробно рассмотреть структуру и свойства некоторых цитоскелетных белков. [c.31]

В форме геля агар содержит поры различных размеров, причем средний радиус пор зависит от его концентрации [6] (рис. 18). Поры достаточно велики, поэтому при электрофоретическом разделении белков в гелях с концентрацией агара ниже 2% эффект молекулярного сита обычно ничтожен [1419]. Лишь такие крупные молекулы, как ДНК [1269] и РНК [498, 852, 1308], разделяются в агаровом геле в соответствии с их раз ме-рами, вероятно, вследствие фильтрующего эффекта геля. Было локазано [1308], что подвижность молекул РНК связана об- [c.54]

Альпер и Джонсон предложили метод, позволяющий с минимальной диффузией проводить преципитацию электрофоретически разделенных белков [27]. После завершения электрофореза в агарозном геле на его поверхность равномерно наносят соответствующую иммунную сыворотку, и гель, установленный в строго горизонтальное положение, инкубируют во влажной атмосфере в течение 2 ч. Затем гель покрывают тонким листом влажной фильтровальной бумаги, на который сверху кладут три листа толстой бумаги и стеклянную пластинку с грузом 2— [c.246]

Другой реакционноспособный краситель —ремазоловый яркий синий R (реактивный синий 19, .I. 44035) был применен> для окрашивания белков перед электрофорезом [480]. Так как-обработка белков этим красителем приводит к снижению их растворимости в отсутствие ДСН, данную методику предварительного окрашивания следует использовать лишь при электрофоретическом разделении белков в присутствии детергента [1247]. Предварительное окрашивание белков сыворотки крови этим> красителем в условиях, в которых не происходило осаждения белков, вызывало изменение их поведения при электрофорезе [277]. [c.275]

После электрофоретического разделения белков гель вымачивают в течение 1 ч в смеси 37%-ный формальдегид (фирма Fluka) — этанол — вода (15 27 63) и затем оставляют на ночь в смеси другой концентрации указанных компонент (1 25 75). [c.307]

Процесс переноса электрофоретически разделенных белков на иитроцеллюлозную подложку известен под названием блот-тинг [49]. Методы обнаружения основаны на применении амидочерного, индийских чернил и окрашивании комплексом серебра. Специфический иммуноанализ реактивных антигенов на нитроцеллюлозе впервые описан в 1979 г. [368] (см. также разд. 8.20.3). [c.311]

После электрофоретического разделения белки переносят на нитроцеллюлозный фильтр путем электроблоттинга, при этом они прочно связываются с нитроцеллюлозной основой. Затем весь фильтр инкубируют в растворе с высокой концентрацией белка (обычно это БСА, а недавно стали использовать сухое молоко), чтобы блокировать неспецифическое связывание моле- [c.357]

Основная проблема использования цельной сыворотки или плазмы в качестве иммуногена заключается в получении эффективного ответа на а-глобулины. Наилучший подход — электрофоретическое разделение белков сыворотки на горизонтальной пластине агарозного геля. Полос. геля затем можно разрезать поперек и заморозить, и компоненты собирать в ходе оттаивания. После этого можно иммунизировать овец различными фракциями в соответствии с их электрофоретической подвижностью. Можно добавить антитела к отдельным компонентам цельной сыворотки, например компонентам комплемента. На рис. 2.7 приведена электрофоре-грамма хорошо сбалансированной овечьей антисыворотки к белкам сыворотки человека, полученной данным методом. Общая схема иммунизации аналогична той, что р-екомендована для отдельных белков. [c.80]