Аминокислотные и пептидные карты

Рассмотрим теперь метод пептидных карт. Его первый этап состоит в разрыве дисульфидных связей, далее белок денатурируют и расщепляют ферментами, например трипсином или пепсином. В результате получается набор пептидов, размер и аминокислотный состав которых характерен для каждого отдельного белка. Смесь пептидов наносят на лист хроматографической бумаги и проводят в одном направлении хроматографию, а в другом — электрофорез. Пептиды локализуются в виде отдельных пятен, образуя характерную картину ( отпечатки пальцев ), Метод пептидных карт особенно полезен для выявления малых [c.167]

Тонкие различия в первичной структуре родственных белков часто удается выявить методом отпечатков пальцев . Метод этот состоит в том, что белок подвергают частичному перевариванию с помощью одного или нескольких протеолитических ферментов, а затем разделяют продукты гидролиза и идентифицируют их, пользуясь для этого либо электрофорезом, либо хроматографией на бумаге. На фиг. 32 приведены полученные таким способом отпечатки пальцев , или пептидные карты , нормального и аномального гемоглобинов. Детальное изучение этих пептидных карт показывает, что все пептидные пятна, за исключением одного, идентичны. Таким способом генетически измененный структурный элемент выявляется очень легко, и для установления природы структурного изменения нет надобности устанавливать полную аминокислотную последовательность всей молекулы. Действительно, в ряде случаев весьма определенные указания относительно природы имеющегося замещения можно получить просто исходя из результатов анализа аминокислотного состава соответствующих пептидов, выделенных из двух белков. Но, конечно, однозначные доказательства замены одной аминокислоты на другую получают только после установления аминокислотной последовательности анализируемых пептидов. [c.96]

Пептидные карты НЬА и НЬ5, полученные таким образом, различаются очень мало — лишь положением пятна, соответствующего одному из пептидов. После накопления и очистки этого пептида была определена его аминокислотная последовательность в различных гемоглобинах [c.224]

АМИНОКИСЛОТНЫЕ И ПЕПТИДНЫЕ КАРТЫ [c.334]

Более быстрым методом разделения пептидов энзиматического гидролизата является метод пептидных карт ( отпечатка пальцев , или фингерпринта ), сочетающий высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге. С помощью этого метода возможно сопоставление пептидных смесей, получаемых при расщеплении различных белков, и выявление столь малых различий в аминокислотном составе отдельных пептидов, как замещение единичной аминокислоты какой-либо другой. Такие различия имеют большое значение при сравнительном изучении гомологичных белков различных видов растений и животных, а также прй определении генетических изменений в структуре белка, возникающих в результате точечной мутации. [c.81]

Молекулярная масса и изоэлектрическая точка - характерные параметры белка. Однако в основе точной идентификации белковой молекулы лежит определение аминокислотной последовательности. Уже на первом этапе этого процесса, включающего расщепление белка на мелкие фрагменты, можно получить значительную информацию о данном белке. В настоящее время в продаже имеются протеолитические ферменты и химические реактивы, расщепляющие белки по определенным аминокислотным остаткам (табл. 4-10). Так, фермент трипсин отщепляет остатки лизина и аргинина со стороны карбоксильных групп химический реактив бромистый циан расщепляет пептидные связи, расположенные после остатков метионина. Поскольку такие специфические ферменты и реактивы расщепляют в белковой молекуле ограниченное количество связей, при их воздействии образуется смесь больщих пептидов. Разделив эту смесь методом электрофореза или хроматографии, можно получить пептидную карту, характеризующую исследуемый белок. Такие пептидные карты называют иногда фингерпринтами (отпечатками пальцев) белка (рис. 4-53). [c.219]

Определение аминокислотного состава и N-концевой последовательности основного компонента.Фрагментация на аналитическом уровне протеазой(ами) и приготовление пептидной карты (электрофорез при pH 6,5и2,1) [c.345]

Вопрос о том, одинаковы или различны аминокислотные последовательности субъединиц, можно выяснить путем определения числа пептидов в ферментативном гидролизате белка. Наиболее широко используемый для этой цели протеолитический фермент — трипсин, гидролизующий только те пептидные связи, которые образованы карбоксильными группами лизина или аргинина. По суммарному содержанию лизина и аргинина в белке можно примерно предсказать число триптических пептидов, которые должны образоваться при полном гидролизе трипсином. Для белка, состоящего из одной полипептидной цепи, число триптических пептидов равно числу остатков лизина и аргинина в молекуле плюс 1. Вдвое меньшее число пептидов образуется из белка, содержащего две субъединицы с одинаковой аминокислотной последовательностью. Пептиды разделяют на бумаге или других подходящих носителях (гл. 5), используя обычно электрофорез в одном направлении и хроматографию в другом с последующим обнаружением пептидов по реакции с нингидрином. Чрезвычайно маловероятно, чтобы два триптических пептида с различной аминокислотной последовательностью обнаружились в виде одного пятна. Более серьезные возможные осложнения обусловлены тем, что значительная часть триптических пептидов оказывается нерастворимой и не проявляется на пептидных картах, как это иногда случается при исследовании крупных белков. Обычно же число обнаруживаемых пептидов довольно близко к ожидаемому. Следовательно, метод пептидных карт в сочетании с определением молекулярной массы достаточен для того, чтобы выяснить, являются ли аминокислотные последовательности субъединиц одинаковыми или различными. [c.172]

Доказательство того, что белок А является продуктом расщепления большего белка Б. Если на пептидной карте белка А имеются все те же пятна, что и на пептидной карте белка Б, весьма вероятно, что белок А является частью аминокислотной последовательности белка Б. Следовательно, либо белок Б происходит из белка А путем добавления аминокислот, либо белок А получается [c.186]

Получение пептидных карт выявление аминокислотной замены в гемоглобине серповидных клеток [c.92]

Получаемые в результате пептидные карты дают очень наглядный результат. После окрашивания нингидрином пятна пептидов становятся ясно видны. Сравнение карт гемоглобина А и гемоглобина 8 показало, что все их пептидные пятна идентичны, за исключением одного. Это пятно элюировали с каждой из пептидной карт и определили, что в обоих случаях оно соответствует пептиду из 8 аминокислот. При последующем аминокислотном анализе обнаружилось, что пептид гемоглобина 8 отличается от пептида гемоглобина А лишь по одной аминокислоте. [c.93]

В дальнейшем изложении будет показано, что формы основной цепи фрагмента могут быть разделены на отдельные типы, которые иною названы шейпами пептидного скелета. В основе разделения форм по шейпам лежит дипептидный структурный элемент. Формы одного шейпа имеют аналогичный ход пептидной цепи и подобное взаимное расположение боковых цепей и звеньев основной цепи. Следовательно, они обладают близкими возможностями в отношении средних взаимодействий Различия в этом случае связаны с энергией ближних взаимодействий и конформационной свободой форм остатков (R и В имеют меньшую энергию на карте ф-vji и большую площадь, чем L и тем более Н) (см рис. 11.10). Шейп является качественным понятием, которое не зависит от конкретной аминокислотной последовательности, а определяется лишь числом остатков. [c.224]

Валин и изолейцин в большей степени, чем какие-либо другие аминокислотные остатки, ограничивают свободу вращения пептидной цепи, поскольку разветвление бокового радикала начинается уже с атома (в этом смысле их интересно сравнить с изотактическими полимерами, у которых ветвление начинается с первого атома боковой цепи, и в результате пространственных затруднений кристаллический полимер приобретает конформацию спирали 41). В работе [12] были найдены разрешенные и запрещенные области конформационной карты дипептида для нескольких остатков, в том числе для валина (рис. 12). Пространство, занимаемое на этой карте валином (или изолейцином), совсем мало. Как мы уже говорили, все остальные остатки должны занимать промежуточное положение между аланином и валином, однако, как мы видим из рис. 13 и как мы еще увидим на примере фенилаланина, [c.123]

Итак, как мы отметили, большинство аминокислотных остатков в смысле ограничения свободы пептидной цепи (но не относительной стабильности тех или иных конформаций) подобно аланину. Действительно, детальное исследование метиламида Ы-ацетил-1-фенилаланина, проведенное в работе [92], наглядно это демонстрирует. Конформационная карта рис. 15 построена таким образом, что каждой точке этой карты соответствует оптимальная конформация бокового радикала (из девяти возможных конформаций, отвечающих локальным минимумам, в каждом случае выбиралась оптимальная). В расчете использовались параметры, предназначенные для водных растворов (см. выше). Сходство этой карты с картой рис. 8, если в последнем не принимать во внимание свернутые формы, [c.125]

Вторая часть доказательства коллинеарности между нуклеотидной последовательностью в ДНК и последовательностью аминокислот в белках включала в себя определение полной аминокислотной последовательности триптофансинтетазы и картирование пептидных фрагментов мутантных ферментов (гл. 2, разд. 3,2). Пептидные карты позволили идентифицировать дефектные пептиды и точно установить природу аминокислотных замещений в большом числе различных ауксотрр-фов по триптофану. Когда это было сделано, оказалось, что мутациям, локализованным очень близко друг к другу, соответствовали аминокислотные замещения в непосредственно (или очень близко) прилегающих друг к другу участках полипептидной цепи. [c.251]

Метод пептидных карт на одном листе бумаги сейчас следует рассматривать скорее как аналитический, чем как препаративный. При препаративном разделении пептидов в тех же условиях обычно смесь пептидов последовательно разделяется методами электрофореза и хроматографии в несколько приемов, каждый раз нанося пробу во всю ширину бумаги. После проведения электрофореза вырезают полосы бумаги таким образом, чтобы в середине и по трем краям оставались узкие полоски бумаги. После проявления этих полосок нингидрином вырезанные полосы вставляются обратно, и на них карандашом отмечаются пептидные зоны. Пептиды соответствующих зон с нескольких листов бумаги после смывания объединяются и хроматографируются опять же на полном листе (каждая объединенная зона отдельно). Подобные трудоемкие операции связаны с необходимостью иметь достаточное количество вещества для дальнейшего анализа. Повышение чувствительности методов анализа концевых групп даст возможность определять всю аминокислотную последовательность пептида после получения пептидной карты на одном листе бумаги. Для анализа К-концевых аминокислот уже разработан [8] флуоресцентный метод с 1-диметиламинонафталин-5-сульфонилхлЬри-дом, который в сто раз чувствительнее (достаточно 10 — 10" мкмоль пептида) обычно используемого метода с динитро-фторбензолом [9]. [c.237]

Если один из сравниваемых белков обладает какими-то отличиями в аминокислотной последовательности определенного участка первичной цепи, то пептидные фрагменты этого участка будут передвигаться по электрохроматографическому полю с иными скоростями (а часто и в ином направлении) по сравнению с фрагментами такого же участка другого белка. В результате первые пептиды займут особое положение на пептидных картах, тогда как фрагменты цз идентичных участков полипептидных цепей займут аналогичные места. Отличия в последовательности, таким образом, будут обнаружены в пятнах, имеющихся на одной электрохроматограмме и не появляющихся на другой. Элюция и количественный аминокислотный анализ лишних пептидных пятен позволяет далее установить наличие специфических для данного белка аминокислот, характеризующих эти фрагменты. В частности, методом пептидных карт для триптического гидролизата удалось выявить особенности структуры различных гемоглобинов. Гемоглобин 5 отличается от нормального гемоглобина А по электрофоретической подвижности и частично замещает последний у больных серповидно-клеточной анемией. Исследования методом пептидных карт позволили локализовать различие в первичной структуре между гемоглобинами А и 5 в одной точке полипептидной цепи [c.82]

Необходимо заметить, что понятие монодисперс-ный используется здесь в практическом смысле. Следующее утверждение, хотя оно и звучит слишком категорично, имеет большой смысл монодисперсность в седиментационном анализе означает, что все молекулы обладают одинаковыми седиментационными свойствами . Не следует думать, что при помощи ультрацентрифугирования можно обнаружить полидисперсность по тому или иному признаку, влияние которого на седиментацию ничтожно, такому, как степень амидирования остатков глутаминовой кислоты или аминокислотные замены. Для обнаружения полидисперсности такого типа существуют другие методы (электрофорез в геле, метод пептидных карт [1]). [c.202]

Выделение и очистку мономеров с целью определения аминокислотного состава, получения пептидных карт или секвениро-ваиия осуществляют с помощью препаративных методов химии белка. [c.37]

Белки, имеющие гомологичш те аминокислотные последовательности, но различающиеся посттрансляционпыми изменениями (тип 2), дают сходные карты, исключение составляют лишь те фрагменты, подвижность которых изменена вследствие соответствующей модификации. Аналогичная картина (совпадение части хроматограммы) наблюдается и в ситуации 4, Обнаружить любые различия в структуре с помощью одномерного электрофореза в гелях, где анализируются крупные полипептиды менее вероятно, чем с помощью пептидных карт, поскольку при небольшой молекулярной массе изменения гидрофобности или заряда сказываются на поведении пептида в значительно большей степени. [c.225]

И выбора рациональной схемы фракционирования пептидов. Например, по данным аминокислотного анализа белок содержит 15 остатков аргинина, однако при фракционировании триптического гидролизата на двумерной карте после обработки фенантренхиноном [80] обнаружено только 5 флуоресцентных пятен. Это свидетельствует или о том, что в нерастворимом коре остались нерасщепленными 10 остатков аргинина, или о том, что при гидролизе образовалось 10 крупных нерастворимых пептидов которые задержались на старте. Одна пептидная карта может быть последовательно окрашена флуорескамииом [7, 74] фенантренхиноном (остатки аргинина) [80] и, наконец, реагентом Паули (остатки гистидина и тирозина) [17]. Если белок предварительно окислен надмуравьиной кислотой, то триптофансодержащие пептиды обнаруживаются по флуоресценции при осмотре хроматограммы под ультрафиолетовой лампой до опрыскивания флуореска-мином (разд. 8.14). [c.361]

Идентификация аминокислот, вводимых с помощью различных супрессорных транспортных РНК. Некоторые мутации приводят к преждевременному обрыву цепи аминокислотной последовательности в белках. Это терминирование может быть предотвращено в присутствии молекул супрессорной тРНК, которая вводит аминокислоту по месту преждевременного обрыва цепи и тем самым позволяет продолжить синтез до естественного окончания. В получающемся при этом белке заменена лишь одна аминокислота. Пептидные карты таких белков дают возможность идентифицировать аминокислоту, вводимую каждой из известных супрессорных тРНК. [c.187]

Прежде всего эта роль определяется значением нековалентпых взаимодействий в формировании пространственной структуры белков и иуклеиновы,ч кислот. В полипептидной цепи каждый хиральный атом углерода связан простыми <т-связя-ми с группами С=0 и NH, что означает возможность заторможенного вращения с низким активационным барьером вокруг этих связей. Вращение вокруг собственно-пептидной связи затруднено, поскольку вследствие р, г-сопряжения эта связь не является строго одинарной. Таким образом, в полипептидной цепи длиной вминокислотных остатков возможно заторможенное вращение вокруг 2N связей. Если принять, естественно с некоторой степенью условности, что каждой из таких связей соответствуют три значения торсионных углов, соответствующих минимумам потенциальной энергии вращения (по аналогии с классической картинкой для вращения вокруг связи С—С в дихлорэтане), то число различных конформаций, которое может принимать полипептидная цепь, составит я Считая, опять-таки с большим элементом условности, что время отдельного поворота вокруг <г-связи имеет порядок 10 с и вращение вокруг всех связей может происходить независимо друг от друга, число поворотов в секунду можно оценить как 2УУ-101 , что для небольшого белка, состоящего всего из 100 аминокислотных остатков, составит 2-10 2. Если бы молекула белка представляла собой статистический клубок, непрерывно случайным образом изменяющий свою конформацию, то некоторую биологически значимую конформацию, необходимую для функционирования белковой молекулы, она принимала бы один раз за 10 с, что абсурдно велико не только по сравнению с временем, реально необходимым для выполнения той или иной функции, но и с временем существования Вселенной вообще. Аналогичная оценка, проведенная для такой достаточно сложной органической молекулы, как NAD, где основная цепочка атомов содержит 14 таких <т-связей, показывает, что время, необходимое для достижения некоторой определённой конформации, существенной для функционирования этой молекулы в химических превращениях и в биохимических системах, составит величину порядка 0,07 с, [c.68]

Основные черты конформационных карт дипептидов, несомненно, должны сохраняться в полипептидах разница состоит только в том, что благодаря взаимодействию пептидных единиц, находящихся в соседних витках спирали, разрешенные области несколько уменьшаются, а энергетические контуры сужаются. На рис. 25 приведена конформационная карта цолк-1-аланина [19]. Сравнение ее с аналогичной картой аланинового дипептида (рис. 7) показывает, что границы допустимых областей — в особенности для форм R и L — резко> сузились более того, полностью разрешенная область R состоит теперь уже из двух частей, и только область В осталась практически неизменной (это легко понять, ибо в области В соседние пептидные единицы максимально удалены). Как и в случае дипептидов, закономерности, наблюдающиеся на конформационных картах полиаланина, являются общими для всех аминокислотных остатков, содержащих атом СР. [c.140]

Итак, большинство аминокислотных остатков в составе пептида в смысле ограничения свободы пептидной цепи (но не по относительной стабильности тех или иных конформаций) подобны остатку аланина. Действительно, детальное исследование конформаций метиламида М-аце-тил-L-фeнилaлaнинa, проведенное в работе [56], это наглядно демонстрирует. Карта, приведенная на рис. 8.8, построена таким образом, что каждой ее точке соответствует оптимальная конформация боковой группы Я (из девяти возможных конформаций, отвечающих локальным минимумам, в каждом случае выбиралась оптимальная). В расчете использованы параметры, предназначенные для водных растворов, т. е. е = = 10 и ) = 0,5 ккал/моль. Сходство этой карты с картой, показанной на рис. 8.5 (если в последней не принимать во внимание положения свернутых форм), очевидно. Совершенно аналогичными должны быть карты метиламидов К-ацетил-1-тирозина и, вероят- [c.376]

Смотреть страницы где упоминается термин Аминокислотные и пептидные карты: [c.118] [c.370] [c.217] [c.359] [c.370] [c.224] [c.226] [c.173] [c.186] [c.81] [c.186] [c.303] [c.219] [c.102] [c.368] [c.551] [c.554] [c.563] [c.184] [c.236]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология