Методы определения молекулярной массы белков

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

Рис. 4-49. ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле. Индивидуальные белки образуют комплекс с молекулами додецилсульфата натрия, несущими отрицательный заряд, и мигрируют через пористый гель полиакриламида в виде отрицательно заряженного комплекса ДСН-белок. Поскольку скорость передвижения в этих условиях тем выще. чем меньще размеры полипептида, этот метод может быть использован для определения приблизительной молекулярной массы полипептидной цепи, а также для изучения субъединичного

Метод определения молекулярной массы белков электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na завоевал себе прочную репутацию и используется очень широко. Тем не менее следует проявлять известную осторожность. Исследуемый белок может оказаться принадлежащим к той, по-видимому, сравнительно немногочисленной, категории белков, для которой количественное соотношение в комплексе с ДДС-Na существенно отличается от 1 1,4. [c.58]

ГПХ можно использовать для определения молекулярной массы и размеров белковых молекул. По методу Эндрюса [4—6] вначале на основании предварительного анализа нескольких белков с известной молекулярной массой строят калибровочную кривую, выражающую графическую зависимость удерживаемого объема Уе от молекулярной массы М. После этого молекулярную массу и стоксов радиус исследуемого белка определяют путем интерполяции. В отличие от других методов определения молекулярного веса здесь можно работать с мало-очищенными препаратами. Если исследуемый белок обладает какими-либо характерными свойствами, например ферментативной активностью или поглощением при определенной длине волны, его содержание в анализируемом препарате может быть минимальным. [c.425]

Принципиально возможно определение коэффициентов седиментации и, следовательно, приблизительных молекулярных масс даже не вполне индивидуальных белков, если имеется подходящий метод для измерения относительных концентраций белков, например путем измерения их ферментативной активности. Изучаемый образец осторожно наносится на раствор сахарозы с линейным градиентом концентрации и подвергается высокоскоростному центрифугированию в роторе с откидывающимися пробирками (в ба-кет-роторе). Обычно в качестве стандарта в раствор добавляется белок с известным коэффициентом седиментации s. Вещества с различными седиментационными свойствами отделяются в градиенте плотности друг от друга, образуя полосы. По окончании центрифугирования в нижней части центрифужной пробирки проделывают небольшое отверстие, фракции сливают и анализируют. Если фракции отбирают через различные промежутки времени центрифугирования, то временная зависимость расстояния от мениска до зоны белка, обладающего активностью, должна быть линейной. Для данного времени центрифугирования соблюдается следующая [c.130]

Для глобулярных белков и многих углеводов эта методика дает очень надежные результаты при использовании различных типов сефадекса и биогеля Р. Очень важно, что величину М можно определить на нефракционированных экстрактах клеток при условии, что анализируемый белок известен почти все другие методы требуют достаточно очищенных препаратов. Таким образом, для определения М достаточно пропустить через колонку несколько молекул с известной молекулярной массой, по полученным данным построить прямую линию, после чего М образца можно определить интерполяцией. Точность такого определения составляет около 10%. Некоторые более точные методики определения молекулярной массы будут обсуждаться в разделе, посвященном тонкослойной гель-проникающей хроматографии. [c.201]

Молекулярная масса и изоэлектрическая точка - характерные параметры белка. Однако в основе точной идентификации белковой молекулы лежит определение аминокислотной последовательности. Уже на первом этапе этого процесса, включающего расщепление белка на мелкие фрагменты, можно получить значительную информацию о данном белке. В настоящее время в продаже имеются протеолитические ферменты и химические реактивы, расщепляющие белки по определенным аминокислотным остаткам (табл. 4-10). Так, фермент трипсин отщепляет остатки лизина и аргинина со стороны карбоксильных групп химический реактив бромистый циан расщепляет пептидные связи, расположенные после остатков метионина. Поскольку такие специфические ферменты и реактивы расщепляют в белковой молекуле ограниченное количество связей, при их воздействии образуется смесь больщих пептидов. Разделив эту смесь методом электрофореза или хроматографии, можно получить пептидную карту, характеризующую исследуемый белок. Такие пептидные карты называют иногда фингерпринтами (отпечатками пальцев) белка (рис. 4-53). [c.219]

Описанные в главе методы могут быть использованы для оценки стехиометрического состава олигомеров. В свою очередь данные об относительном количестве мономеров в олигомере, их молекулярной массе и свойствах дают полезную предварительную информацию о третичной и четвертичной структурах олигомера. Однако рассмотрение закономерностей (и симметрии) структурной организации сложных олигомеров не входит в задачу данной главы [131]. Дополнительную информацию читатель может найти в специальных обзорах, посвященных четвертичной структуре белков [93], белок-белковым взаимодействиям [62], методам определения субъединичной структуры [173]. [c.15]

Некоторое распространение имеет химический метод. Супщость его заключается в количественном определении в составе белка элемента или аминокислоты, содержащихся в нем в наименьшем количестве. Затем проводят расчет минимальной молекулярной массы, исходя из того, что в молекуле белка не может быть менее одного атома элемента или одного аминокислотного остатка. Однако об истинной молекулярной массе белка этот метод не всегда дает правильное представление. Например, гемоглобин (белок крови человека и животных) содержит 0,34% железа. Так как в гемоглобине не может содержаться менее одного атома Ре, то минимальная молекулярная масса гемоглобина рассчитывается по пропорции 0,34 части Ре соответствует 100 частям белка, 56 частей Ре (один атом) соответствуют х частям белка, отсюда л =(56-100)/ 0,34 = 16 500. Истинная молекулярная масса гемоглобина равна 66 ООО—68 ООО, т. е. учетверенной минимальной молекулярной массе. Это естественно, так как молекула гемоглобина содержит. 4 атома Ре. Таким образом, химический метод определения молекулярной массы белков в определенной мере условен. [c.37]

В случае измерения скорости седиментации необходимы поля центробежных сил, обеспечивающие полное осаждение белков. Белок, находящийся в виде коллоидного раствора, обладает большей плотностью, чем растворитель. В ходе центрифугирования на молекулу белка действует значительная центробежная сила, которая, вызывая движение молекулы через среду, обеспечивает скорость перемещения, пропорциональную трению молекулы в среде. Скорость седиментации прямо пропорциональна молекулярной массе. Для определения молекулярной массы необходимы приборы со скоростью вращения ротора до 60 тыс. об/мин. Раствором белка заполняют прозрачную ячейку. Изменения концентрации, возникающие в процессе центрифугирования, могут прослеживаться с помощью оптических методов, например посредством шлирен- или интерференционной оптики, а также посредством прямого измерения абсорбции в УФ-области (сканирующая система). [c.360]

Принцип метода заключается в том, что на кинетическое движение молекул в растворе и равномерное их распределение накладываются большие центробежные силы, в результате чего белок седиментирует ко дну пробирки. Се-диментационное равновесие и скорость седиментации, которая регистрируется оптическим методом, являются функциями молекулярной массы белка. Определение молекулярной массы по скорости седиментации описывается следующим уравнением [c.44]

Набор стандартных белков разделяют с помощью электрофореза в гелях различной пористости с содержанием поперечных сшивок 5 15%. Выявляют белок, окрашивая его кумасси синим или серебром, и определяют молекулярную массу, сравнивая подвижность белка и стандарта. Особенно широкое применение этот метод нашел при определении молекулярной массы протомера сначала осуществляют денатурацию олигомера (например, кипячением в детергенте в присутствии Р-меркап-тоэтанола), а затем проводят разделение в гелях, содержащих ионный детергент додецилсуль-фат натрия. [c.51]

Для определения чистоты (или гомогенности) ферментных препаратов в настоящее время наиболее широко используются ультрацентрифугирование и диск-электрофорез. В основе первого из них лежит различная скорость седиментации в ультрацентрифуге белков с различной молекулярной массой (и различной формой молекул). Одним из ограничений данного метода является то, что разные белки могут иметь одну и ту же величину седиментации и не разделяться при ультрацентрифугировании. С другой стороны, белок в растворе может находиться в виде нескольких форм, различающихся по степени агрегации, а следовательно, и по молекулярной массе. Если эти формы не превращаются одна в другую или превращения осуществляются достаточно медленно, на седиментограмме обнаружится несколько пиков, что, однако, не будет свидетельствовать о наличии примесных белков в исследуемом препарате фермента. Недостатком метода является также его невысокая чувствительность, что не позволяет обнаруживать малые количества примесных белков. [c.205]

Электрофорез проводят в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Таким путем можно определить молекулярные массы субъединиц олигомерных белков [74 — 76]. Молекулы ДСН образуют за счет гидрофобного взаимодействия комплексы с полипептндными цепями, характеризующиеся постоянным отношением ДСН белок. Тогда электрофоретическую поднижность можно выразить как функцию молекулярной массы и сравнить с подвижностью стандартного белка. Метод отличается высоко скоростью (2 — 4 ч) и требует для одного определения, как правило, лишь 10 — 50 мкг белка. В последнее время ДСН-электрофорез проводят также на стеклянных шариках с контролируемым размером пор (120 — 200 нм). Комплекс ДСН — белок не адсорбируется на носителе, интервал определяемых молекулярных масс 3 500 — 12 ООО [77]. [c.362]

Первая стадия опре51 еления строения белка состоит в идентификации и количественном определении составляющих его аминокислот. Для этого требуется образец чистого белка, что само по себе представляет значительную проблему. Чтобы получить чистый образец, обычно применяют комбинацию методов (гл. 3), таких, как гель-электрофорез, ионообменная хроматография и центрифугирование по градиенту плотности (белки с большей молекулярной массой оседают быстрее, чем белки с меньшей молекулярной массой). Когда белок в результате применения этих методов становится однородным или когда достигнут максимум биологической активности, белок считается чистым. Тогда его гидролизуют до составляющих аминокислот горячей соляной кислотой и гидролизат анализируют. [c.267]

По трудоемкости все эти процедуры, с одной стороны, и определение величины ф/<3с, с другой стороны, примерно одинаковы. Методы коррекции особенно ценны тем, что все они указывают на избирательное связывание с белко.м именно гуанидинхлорида, а не воды. Количество связанных молекул растворителя составляет от 0,01 до 0,17 г на 1 г белка. Возможно, впрочем, что этот разброс является в значительной мере результатом низкой точности измерений количества связанной воды. Значениями молекулярных масс субъединиц после внесения поправки часто пользуются как подходящими , поскольку, например, сумма молекулярных масс субъединиц обычно хорошо совпадает с молекулярной массой соответствующего интактного белка. В то же время важно знать, что, например, молекулярные массы субъединиц альдолазы (50 000), полученные таким путем, не согласуются с данными, полученными при помощи других методов, как показали Эдельштейн и Шахман. Кроме того, по тем же данным зто пока единственный белок, который избирательно связывает воду. Возможно, основное предположение, на котором базируется описанная выше экстраполяция по Эдельштейну и Шахману (а именно что на избирательное связывание не влияет сжимаемость гуанидинхлорида), неверно. Подробное обсуждение этого вопроса читатель найдет в работе [16]. [c.221]

Итак, когда исследуется какой-либо новый белок, определение количества избирательно связанного с ним растворителя представляет лишь ограниченный интерес, если только это не является целью исследования. Наиболее точный способ устранения влияния связанного растворителя на величину молекулярной массы белка — метод Касассы и Эйзенберга. Достаточную точность дает также внесение поправки по Хейду и Тенфорду, основанное на предложенном ими соотношении [c.221]

Методы выделения и идентификации мономеров дают информацию о молекулярной массе олигомера и его субъединиц, их количестве и свойствах, позволяют получать препараты для определения первичной структуры. Если удается получить белок в виде кристаллов, изучение первичной структуры удобно вести параллельно с помощью секвенирования и физических методов (например, рентгеноструктурного анализа), поскольку сопоставление получаемой информации существенно ускоряет ход анализа [158]. Однако такая возможность представляется редко. Часто именно получение достаточно чистых препаратов белка или субъединиц, пригодных для проведения аминокислотного анализа, и составляет одну из главных проблем, поскольку исследуемый белок может присутствовать лишь в незначительных количествах в сложной смеси сопутствующих белков и продуктов их деградации или же исходная смесь может содержать белки с очень близкими свойствами. Если белок плохо растворим и требует более жестких условий для солюбилизации, гетерогенные препараты могут быть получены уже на начальном этапе выделения. Причиной появления гетерогенности можег быть, по-видимому, изменение суммарного заряда из-за дезамидирования амидных групп аспарагина и глутамина, карбами-лирование е-аминогрупп некоторых остатков лизина ионом цианата, присутствующим в растворах мочевины [38], неспецифическая модификация остатков метионина и гистидина при алкилировании цистеина. [c.16]