Концентрирование растворов белков

Концентрирование раствора белка ацетоном. После обработки бентонитом концентрируют раствор белка, медленно добавляя равный объем ацетона, охлажденного до —10° С (не допускают повышения температуры выше 0°С). Через 10 мин после добавления последней порции ацетона молочно-белый раствор центрифугируют (15 мин при 15000 ). Небольшой осадок растворяют (в 1/200—1/100 части от объема фракции 6) в 0,2 М раствора триса (pH 8,0) и подвергают диализу в течение ночи против 1000-кратного объема 0,01 М раствора фосфата натрия, pH 7,0 фракция 7). [c.235]

Вакуумную колбу соединяют с водоструйным насосом и создают разрежение. Под вакуумом происходит фильтрация растворителя через диализную мембрану внутрь колбы и начинается концентрирование раствора белка. На выходной шланг вакуумной колбы накладывают зажим, чтобы сохранить разрежение, и всю систему помещают в холодильник или в холодную комнату. Если объем концентрируемого раствора больше объема воронки, то по мере концентрирования раствор белка подливают. Когда объем раствора уменьшится до нужной степени, вакуумную колбу с диализной трубкой извлекают из холодильника, открывают зажим и вынимают трубку из колбы. Затем надрезают мембрану и переливают сконцентрированный белковый раствор в соответствующий сосуд, смыв туда же небольшим количеством буферного раствора остатки со стенок диализной трубки. [c.211]

С совершенствованием техники рентгеновской кристаллографии, а также математических и вычислительных процедур стало возможным уточнить данные о локализации молекул воды, полученные с учетом известных ограничений геометрического характера на основании знаний о химическом связывании [4]. Например, в лизоциме было идентифицировано наличие монослоя, соответствующего 150 молекулам воды [5]. Можно считать, что кристаллы белков наполовину представляют собой воду или маточный раствор и в настоящем анализе могут рассматриваться как концентрированные растворы белка. [c.160]

Ввиду того что сефадексы 0-25 0-75 способны удерживать лишь вещества с молекулярным весом до 40 ООО, они используются преимущественно для фракционирования и выделения низкомолекулярных белков, их фрагментов, а также для деминерализации и концентрирования растворов белков. [c.203]

Если денатурирование белка вызывается нагреванием, то белок остается в состоянии цвиттериона, разрыв же имевшихся солевых мостиков происходит вследствие обусловленного нагреванием усиленного движения пептидных цепей. Одновременно, однако, происходит образование новых межмолекулярных и внутримолекулярных мостиков, в результате чего белки свертываются. Развертывание пептидных цепей не может происходить, если вода не проникает в промежутки между пептидными цепями, поэтому сухие белки более устойчивы к нагреванию, чем их растворы. По этой же причине концентрированные растворы белков обладают более высокой устойчивостью по сравнению с разбавленными растворами. Кристаллы сывороточного альбумина сохраняют свою форму при нагревании [160]. [c.151]

Во многих случаях требуются концентрированные растворы белков. Обычно белки более устойчивы в концентрированных растворах [9], из которых часто они лучше кристаллизуются [14, 160]. Концентрированные растворы, например альбумина плазмы человека, применяются в терапевтических целях [161]. Для концентрирования белковых растворов можно воспользоваться рядом методов, однако в каждом случае следует принимать обычные меры предосторожности против денатурации (см. стр. 7). [c.33]

Белковые растворы можно также концентрировать путем удаления льда. Если раствор заморозить, а затем дать ему медленно оттаивать, то кристаллы чистого льда будут подниматься наверх и их можно отделять от находящегося в нижней части сосуда концентрированного раствора белка [165]. [c.34]

Сорбционная способность поверхности ограничена и определяется число имеющихся на ней сорбционных центров. Поэтому при работе с концентрированными растворами белков практически не чувствуется уменьшение ферментативной активности из раствора за счет сорбции. Однако сорбционная инактивация становится весьма заметной в разбавленных белковых растворах (концентрация 10 —10 моль/л). [c.125]

Если в растворе произошло частичное или полное разворачивание белковой молекулы, например, в результате нагревания, то на ее поверхности появляются новые дополнительные центры взаимодействия с поверхностью реакционного сосуда. За счет этого усиливается сорбционная способность белков и, как следствие, сорбционная инактивация начинает чувствоваться в несколько более концентрированных растворах белка. [c.126]

Концентрирование растворов белков [c.246]

Наиболее распространена как метод концентрирования растворов белков лиофилизация. При интенсивном охлаждении (ацетон, этанол или изопропанол в смеси с твердой углекислотой) раствор замораживают и удаляют воду и летучие буферы в вакууме масляного насоса, снабженного специальной ловушкой. Ловушка заполняется щелочью, если упариваются кислые растворы концентрированная муравьиная кислота перед замораживанием должна быть разбавлена водой до 30%-ной концентрации. [c.246]

КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ РАСТВОРОВ БЕЛКОВ 247 [c.247]

Концентрация белка для ИЭФ должна быть не ниже 1,7—2 мг/мл. Может возникнуть необходимость пропустить концентрированный раствор белка через колонку с сефадексом 0-25 для удаления следов сульфата аммония, мешающего проведению ИЭФ. [c.159]

Наиболее важные методы концентрирования разбавленных растворов белков заключаются просто в удалении воды и низкомолекулярных веществ. Это может быть достигнуто с помощью различных приемов, основанных на применении полупроницаемых мембран (диализ) или на принципах гель-фильтрации при этом белки не проходят через мембрану или какую-то поверхность, через которую вода, и малые молекулы проходят. Наиболее часто используемой системой является ультрафильтрация, при которой вода принудительно проходит через мембрану, а по другую сторону мембраны остается более концентрированный раствор белка. Это достигается либо снижением давления, чтобы отсосать воду (рис. 1.13,Л), либо, чаще, применением сжатого воздуха или азота при давлении до 5 атм в специальных ячейках с перемещиванием раствора для предотвращения закупорки мембраны (рис. 1.13, ). Последний метод при правильном использовании позволяет снизить объем с 50 [c.27]

Прежде чем обратиться непосредственно к пространственной структуре миоглобина и гемоглобина, рассмотрим некоторые основные аспекты метода рентгеноструктурного анализа. Прежде всего анализируемый белок должен быть вьщелен в кристаллическом виде. Миоглобин, например, кристаллизуется при добавлении сульфата аммония к концентрированному раствору белка (рис. 3.4). В концентрации 3 М сульфат аммония значительно снижает растворимость миоглобина и тем самым приводит к его кристаллизации. Растворимость большин- [c.50]

Концентрирование раствора белка (N114)2804 (0—50%)). К супернатанту, полученному на предыдущей стадии, добавляют сульфат аммония до 50%-ного насыщения (313 г/л) и затем центрифугируют (22 500 15 мин). [c.243]

Количество вводимого белка определяется главным образом его гетерогенностью и растворимостью, а также крутизной градиента pH. При аналитическом фракционировании с высоким разрешением нагрузка на колонку объемом 110 мл долл на составлять 5 мг белка в зоне. В случае препаративного разделения содержание белка в зоне составляет 25 мг. При перегрузке может наблюдаться появление капель концентрированного раствора белка ниже уровня зоны. Вероятно, аналогичное явление имеет место при высоком напряжении и крутом градиенте pH. Высокие нагрузки возможны при пологом градиенте, поскольку зоны в этом случае несколько шире. В качестве примера можно привести работу Вальдстрёма [28], где в колонку объемом 110 мл было внесено 500 мг образца. [c.310]

Методы определения поглощения света, основанные на измерении различий между количеством падающего света и количеством света, прошедшего через объект, а также отраженного и рассеянного им, обсуждаются в гл. III. Если при определении спектров поглощения с помощью этих методов используются узкие спектральные полосы падающего света, то полученные результаты выражают действительное поглощение данного объекта—листа, суспензии клеток или суспензии изолированных хлоропластов. Однако объяснить эти спектры, исходя из оптических свойств отдельных пигментов, чрезвычайно трудно. Особенно трудно интерпретировать спектры поглощения листьев. Проникающий в лист свет проходит через неоднородную среду. Сначала он отражается и преломляется клеточными стенками, особенно в листьях наземных растений, у которых межклетники заполнены воздухом затем он рассеивается множеством внутриклеточных частиц разной величины, обладающих разными показателями преломления. Следовательно, пути света в листе различны и длина их неизвестна. Часть света может вообще не попасть в хлоропласты, тогда как другая часть пройдет через несколько пластид или даже несколько раз через один и тот же хлоропласт. Для суспензий одноклеФочных водорослей или хлоропластов эта неопределенность длины оптического пути меньше, но и в этих случаях она довольно значительна. Известно, что резкое изменение показателя преломления приводит к рассеянию части света. Рассеяние на поверхности клеток водорослей, являющееся результатом различия в показателях преломления их стенок и воды, можно почти полностью исключить, суспендируя клетки в концентрированном растворе белка, показатель преломления которого близок к показателю преломления клеточных стенок [10]. Рассеяние внутри клеток может быть более значительным вследствие того, что рассеивающие свет частицы в этом случае меньше, а также из-за присутствия пигментов. При наличии очень мелких частиц, диаметр которых меньше длины волны света, величина рассеяния обратно пропорциональна четвертой степени длины волны (релеевское рассеяние). Это в высшей степени избирательное рассеяние особенно сильно увеличивает среднюю длину пути коротковолнового света. Для бесцветных частиц больших размеров величина рассеяния в меньшей степени зависит от длины волны. Однако показатель преломления пигментов резко меняется в области их полое поглощения (аномальная дисперсия), вследствие чего [c.39]

Определение по скорйсти желатинирования. В ряд пробирок, содержащих одинаковые объемы буферных растворов с различными значениями pH, добгш-ляют концентрированный раствор белка. Быстрее всего желатинирование наступит в той пробирке, pH которой соответствует ИЭТ исследуемого белка. [c.429]

Микрометод является прекрасным методом для опре деления изоэлектрической точки белка. Изоэлектрическая точка имеет большое значение в химии белков. В этой точке свободный заряд на частице равен нулю, и при таком pH белок имеет минимальную растворимость. Частицы стекла микроскопически видимых размеров помещаются в концентрированный раствор белка (1-—2%) и полностью покрываются белком в течение нескольких минут. Суспензия частиц стекла затем разбавляется соответствующим буфером разбавленная суспензия помещается в кювету для микроэлектрофореза и определяется подвижность. Применяется серия буферов с различной pH и строятся кривые зависимости подвижности покрытых белком частиц от pH. Через эти точки проводится наилучшая линия и затем она интерполируется на нулевую подвижность. Значение pH, при котор м подвижность равна нулю, есть изоэлектрическая точка белка. Например, изоэлектрическая точка псевдогдо-булина в опытах, показанных на рис. 36, находится при pH, равном 5,3. [c.207]

Первые препараты сывороточного трансферрина были получены по методу Кон [16], а также фракционированием с помощью сульфата аммония в сочетании с осаждением этанолом [1]. Впо--следствии стали использовать ионообменную хроматографию, которая проще и, вероятно, мягче, чем методы, в которых используется спирт [17]. Последнее замечание, по-видимому, имеет некоторое значение, так как Шэйд [18] указывал, что некоторые препараты трансферрина могут быть физиологически неактивны, хотя их способность связывать железо остается неизменной. Самой главной проблемой при очистке трансферрина было отделение его от связанного с гемом сывороточного белка, гемопексина. Кристаллизацию сывороточного трансферрина проводили следующим образом постепенно добавляли спирт к концентрированному раствору белка [19] с одновременной диффузией спирта в раствор белка во время его концентрирования в аппарате для ультрафильтрации [20] кристаллы были также выделены из концентрированных растворов при низкой ионной силе и низких значениях pH [13]. [c.333]

Глобулины, подобно большинству других белков, также можно осаждать из раствора методом высаливания. Эвглобулины плазмы имеют тенденцию осаждаться при минимальных концентрациях соли, -причем легче других осаждается фибриноген однако, мак и в случае большинства кривых высаливания, здесь имеет место. значительное перекрывание. интервалов осаждения. Такое осаждение может быть полезным в качестве предварительной стадии фракционирования или концентрирования растворов белков. [c.54]

В других приборах камерного типа осуществляются процессы, описанные под названиями электрофоретической конвекции [304, 305] или электродекантации [176, 306, 307]. В этих методах белок электрофоретически движется по направлению к мембране, где он и концентрируется концентрированный раствор белка под влиянием конвекции оседает на дно. Если в прибор помещена смесь двух белков с разными изоэлектрическими точками, а величина рН раствора соответствует изоэлектрической точке одного из компонентов, то этот компонент передвигаться не будет, в то время как второй компонент будет перемещаться описанным выше образом ко дну аппарата. При конструировании такого аппарата [308] важно, чтобы горизонтальный путь белковых частиц (по направлению к мембране) был коротким прочие размеры аппарата должны быть относительно большими, что необходимо для повышения его емкости. Так как при использовании этого метода за один опыт можно выделить только один белок (или группу белков), то в случае сложных смесей требуется многократное повторение таких операций. Рассматриваемый прибор, однако, является относительно простым и дешевым. Емкость, прибора может быть сделана весьма большой разделяющая способность его также весьма значительна. Кирквуд и его сотрудники с успехом осуществили частичное фракционирование ряда смесей, состоящих из родственных друг другу белков с весьма близкими изоэлектри-.ческими точками [309 — 314]. [c.70]

Предположения I и V. Первый шаг при попытке установить справедливость предположения I должен состоять в том, чтобы определить, имеются или отсутствуют в молекуле остатки, которые могут дать аномальный вклад в оптическую активность, например пролил, цистинил или любой из аминокислотных остатков с ароматическими боковыми цепями. То, что ароматические боковые-цепи дают вклад во вращение, можно выяснить, исследуя КД или ДОВ концентрированных растворов белка в спектральной области 250—300 ммк. Однако если оптически активные полосы не наблюдаются в этой области спектра, то еще нет уверенности в том, что хромофоры боковых цепей не дают вклада [c.275]

Концентрирующий гель можно с успехом использовать в препаративной колонке (для которой иногда требуются большие количества геля), чтобы устранить нежелательные эффекты, вызванные наличием солей и отсутствием преэлектрофоре-за [1184]. Концентрация этого геля должна быть такой, чтобы белки до. вхождения в разделяющий гель подверглись предварительному фракционированию в соответствии с размерами их молекул. Подобным способом можно предотвратить закупоривание разделяющего геля концентрированным раствором белков. Если же исследуемая проба очень разбавлена, то рекомендуется применить более разведенный концентрирующий гель,, не обладающий свойствами молекулярного сита. Это даст возможность сконцентрировать белковые компоненты ири помощи изотахофореза. Таиим образом, концентрирующий гель играет довольно существенную роль при препаративном электрофорезе в полиакриламидном геле. [c.115]

Неспецифическая сорбция. Этот недостаток связан со способом активации. Обработка бромоцианом приводит к активации множества гидроксильных групп, однако не все они доступны для молекул лиганда. Избыточные гидроксильные группы инактивируют избытком первичного амина, лизина, этилен-диамина. Несмотря на это, может иметь место неспецифическое связывание. Нековалентная сорбция наблюдается также при нанесении на колонку концентрированных растворов белков, например сывороток, экстрактов клеток или семян. Для уменьшения неспецифической сорбции рекомендуется промывать сорбент концентрированными солевыми растворами, однако это может привести к десорбции белков, имеющих низкое сродство к лиганду, [c.183]