Концентрирование растворов ферментов, методы

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

В химической и нефтехимической промышленности эти методы могут использоваться для разделения углеводородов, смещения равновесия химических реакций путем удаления одного из ее продуктов, разделения азеотропных смесей, концентрирования растворов, очистки или отделения высокомолекулярных соединений из растворов, содержащих низкомолекулярные компоненты и т. п. в биологии и медицине — для выделения и очистки биологически активных веществ, вакцин, ферментов и т. п. в пищевой промышленности — для концентрирования фруктовых и овощных соков, молока и молочных продуктов, получения высококачественного сахара и т. п. [c.7]

Аффинная хроматография [27—31] представляет собой один из наиболее специфических методов выделения реакционноспособных соединений, в частности ферментов, и даже таких надмолекулярных агрегатов, как вирусы. Сорбентом в этом случае служит гель типа агарозы, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, например субстрат фермента. Когда раствор, содержащий выделяемое вещество (скажем, фермент), пропускают через колонку с соответствующим образом приготовленным сорбентом, взаимодействие этого вещества с закрепленным на сорбенте лигандом (в данном случае фермента с субстратом) приводит к его удерживанию и, следовательно, к концентрированию. Поскольку сорбция носит обратимый характер, это вещество можно затем элюировать с колонки. Один из вариантов этого приема, который, строго говоря, уже не относится к области хроматографии, заключается в том, что иммобилизованный на геле фермент служит для непрерывного превращения растворенного в подвижной фазе субстрата. Разделение по методу аффинной хроматографии может быть основано на различного рода специфических взаимодействиях, таких, как связывание фермента с ингибитором, гормона с рецептором, антигена с антителом, а также гибридизация полинуклеотидов. Этот метод позволяет выделять даже целые клетки. [c.21]

Культуральную жидкость (после глубинного метода) или экстракт (после поверхностного культивирования) концентрируют в вакуум-выпарных установках (при этом может происходить инактивация ферментов). Концентрирование растворов ферментов осуществляют также с помощью ультрафильтрации (на полых волокнах или на мембранных фильтрах), что существенно уменьшает потери по сравнению с выпарными методами. Из водных растворов ферменты осаждаются с помощью органических растворителей или солей. Сухие ферментные препараты получают в результате распылительного высушивания (что также сопровождается инактивацией). [c.111]

Предназначена для отделения высокомолекулярных фракций из растворов биологически активных соединений, концентрирования и очистки растворов ферментов и полисахаридов, вирусных и бактериальных суспензий и т. д. методом ультрафильтрации и диафильтрации в промышленных и полупромышленных [c.412]

В химической и нефтехимической промышленности мембранные методы применяют для разделения азеотропных смесей, очистки и концентрирования растворов, очистки или выделения высокомолекулярных соединений из растворов, содержащих низкомолекулярные компоненты, и т.п. в биотехнологии и медицинской промышленности-для выделения и очистки биологически активных веществ, вакцин, ферментов и т.п. в пищевой промышленности-для концентрирования фруктовых и овощных соков, молока, получения высококачественного сахара и т. п. Наиболее широкое применение мембранные процессы находят при обработке воды и водных растворов, очистке сточных вод. [c.313]

Анализ литературных и патентных данных, посвященных флокуляции объектов биологической природы, показывает неуклонную тенденцию роста научного и практического интереса в этой области знаний. Так, если в 50-60-е годы они были связаны исключительно с концентрированием суспензий микроорганизмов и вирусов, то к настоящему времени область практического применения флокулянтов существенно расширилась. Основные отрасли, в которых метод флокуляции находит практическое применение, это — микробиологическая, медицинская, пищевая промьппленность и водоочистка. Важнейшие направления исследований и практического применения флокулянтов концентрирование биомассы, очистка культуральных жидкостей и питательных сред от клеточного материала и других примесей, очистка и концентрирование растворов ферментов, антибиотиков, других продуктов микробного синтеза, иммобилизация клеток и ферментов, очистка сточных вод (см. схему на рис. 6.1). [c.117]

Метод ионообменной хроматографии в сочетании с электрофорезом применяется при разделении максимально очищенных смесей белков и гормонов из частично очищенных препаратов. На последней стадии очистки часто применяют метод кристаллизации. Для этого добавляют к концентрированному раствору фермента насыщенный раствор сернокислого аммония или спирт до заметного помутнения. Затем раствор оставляют стоять без помешивания несколько дней на холоде или при комнатной температуре до выпадения кристаллов. Выпавшие кристаллы отделяют и повторяют перекристаллизацию, каждый раз измеряя удельную активность фермента. Первоначально полагали, что кристаллические ферменты являются чистыми, свободными от примеси соединениями. Но вскоре было установлено, что степень чистоты многих кристаллических ферментов не превышала 50%, [c.128]

И, наконец, если ферменты по своим физико-химическим свойствам приближаются к растворимым белкам, то они должны, подобно последним, осаждаться из водных растворов без потери активности водоотнимающими средствами, в частности ацетоном, спиртом и сернокислым аммонием. Опыт показывает, что концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов действительно вызывают осаждение ферментов, причем получаемые осадки полностью сохраняют свои ферментативные свойства. Один из наиболее важных и эффективных методов выделения и очистки ферментов сводится именно к осаждению их нейтральными солями щелочных металлов. [c.121]

Концентрирование водных растворов методом вымораживания. В последние годы для концентрирования водных растворов различных веществ (антибиотиков, витаминов, ферментов и т. п.), опреснения морской воды, а также для концентрирования пищевых продуктов (чая, кофе, пива, вина, фруктовых соков, молока, сахарных сиропов и др.) широко применяют вымораживание [13, 53, 54, 140]. Рассматриваемый процесс имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами концентрирования [c.121]

Из сказанного выше ясно, что в любом случае сухой препарат фермента обладает гораздо большей устойчивостью, чем препарат, выпускаемый в виде сиропа, раствора и т. п. Кроме того, в растворах ферментные белки больше подвержены действию микроорганизмов. Известно также, что большинство белков более устойчиво в концентрированных растворах, чем в разбавленных. Существует много методов концентрирования белковых растворов. Для повышения стабильности, удобства транспортировки и т. д. эти методы желательно использовать, если, разумеется, это не противоречит данным общего экономического расчета. [c.168]

Многие препараты ферментов были получены в гомогенном и кристаллическом состоянии классическим методом солевого фракционирования, основанным на способности белков высаливаться из концентрированных растворов нейтральных солей (сульфатов аммония, натрия, магния, ацетата натрия или фосфата калия) при определенной температуре. Чаще всего пользуются сульфатом аммония, который отличается весьма хорошей растворимостью, мало изменяющейся при понижении температуры. При строго контролируемых значениях температуры и pH солевым фракционированием можно добиться довольно тонкого разделения. Неорганические соли после солевого фракционирования удаляют из растворов ферментов диализом или гель-фильтрацией. [c.200]

В последнем разделе этой вводной главы, посвященной общим методам, приведены некоторые сведения об обращении с белковыми растворами. В гл. 6 обсуждаются специальные методы, позволяющие сохранять стабильность фермента и его активность. Очень часто в распоряжении исследователя бывает раствор белка, который еще непригоден для фракционирования. Он может быть в неподходящем буфере, иметь не то значение pH, содержать слишком много соли, быть слишком разбавленным или слишком мутным. Мутность указывает на наличие нерастворимых частиц, которые можно отцентрифугировать ил отфильтровать, как описано в разд. 1.2. Значение pH можно легко изменить с помощью рН-метра, добавляя к раствору не очень сильную кислоту или щелочь (разд. 6.1). Концентрирование растворов и способы замены буферов описаны в данном разделе более подробно. [c.26]

Предназначены для разделения, концентрирования и очистки растворов методом обратного осмоса и ультрафильтрации. Применяются для деминерализации сточных вод и извлечения компонентов из промышленных стоков химических и других производств, а также для концентрирования ферментов, биологически активных веществ в микробиологической, химической, целлюлозно-бумажной и других отраслях промышленности. [c.919]

Использование сорбционных методов позволит резко сократить объемы растворов на первой стадии очистки различных ферментов и проводить концентрирование разбавленных растворов. [c.83]

Биологические жидкости существенно отличаются от дисперсий органических и неорганических веществ. Характерная особенность культуральных жидкостей, поступающих на переработку, — невысокое (от 0,1 до 10%) содержание целевого продукта — клеток, ферментов, антибиотиков и др. (табл. 2.1). По этой причине применяющиеся способы выделения продуктов микробного синтеза всегда связаны с переработкой больших объемов культуральных жидкостей. Независимо от того, содержится ли целевой продукт в клеточной массе или в нативном растворе, как правило, стадия отделения биомассы от культуральной жидкости является обязательной. Помимо высокой экономичности и эффективности в биотехнологических производствах к методам концентрирования предъявляется ряд специальных дополнительных требований. [c.23]

Для сгущения термочувствительных жидкостей используется прием, основанный на избирательной кристаллизации воды в растворе при охлаждении ниже 0°. Сущность этого метода концентрирования заключается в том, что вода сгущаемого раствора превращается в кристаллы льда, увеличивая тем самым концентрацию растворимых веществ. Кристаллы льда удаляются центрифугированием или прессованием. Операция повторяется многократно до получения необходимой концентрации фермента. При таких условиях полностью исключаются потери термостабильных компонентов раствора (отсутствует термическое разрушение). [c.371]

Ультрафильтрационный волоконный аппарат — Аппараты изготавливают с использованием плас-сосуд с находящимися внутри мембранными элемен- тмассовых корпусов из полиэтилена, бутакрила, метами, изготовленными из полых волокон. Предназ- тилметакрилата, стеклотекстолита, полипропилена, начены для концентрирования растворов фермент- Аппараты транспортируют в коробках или ящи-ных препаратов методом ультрафильтрации при тем- ках в крытых транспортных средствах при темпера-пературе О—40 °С и давлении 0,2 МПа. туре не ниже О ""С. [c.921]

Одним из главных препятствий при структурном изучении интегральных белков биологических мембран является нх низкая растворимость. Мембранные белки практически нерастворимы в водных буферных системах, и это фактически исключает использование протеолитических ферментов в традиционной форме. В процессе работы по установлению полной аминокислотной последовательности бактериородопсина применялись в основном химические методы расщепления полипептидной цепи, и обрАовавшиеся фрагменты разделялись на биогелях, уравновешенных концентрированным раствором муравьиной кислоты. [c.607]

Высаливание белков концентрированными растворами ЫагЗО или (NH4)2S04 применяется при выделении ферментов из экстрактов тканей и является одним из методов фракционирования белковых смесей на альбумины и глобулины. Растворимость белков уменьшается также при добавлении дегидратирующих веществ (спирта, ацетона). [c.114]

Поскольку в описываемом методе применяется титрование раствором щелочи, в ходе реакции происходит разбавление раствора, что Может изменить концентрации фермента и субстрата, а следовательно, и скорость процесса. Во избежание заметного влияния разбавления на скорость реакции объем прибавляемой щелочи необходимо свести до минимума. Это может быть достигнуто применением сравнительно концентрированных растворов NaOH, однако вводимых при помощи ультрамикробюретки. Так, например, при объеме реакционной смеси 3—5 мл, применение 0,1 н. раствора NaOH в общем объеме на титрование 10—15 мкл дает разбавление [c.150]

О пространственной структуре молекул ферментов известно пока мало. Считают, что количество спиральных участков в них невелико это было доказано методом рентгеноструктурного анализа для ряда белков, в частности яичного альбумина наиболее подробно — для лизоцима, а также для рибонуклеазы, а-химотрипсина. Сходные данные найдены и методом спектрополяри-метрии, например по Моффиту-Янгу (10—20—30%). Несомненно, что каждый ферментный белок обладает уникальной третичной структурой, где между спирализованными участками располагаются неспирализованные, количество которых велико и которые составляют значительную часть молекулы. Частицы многих ферментов состоят из нескольких (2—4) одинаковых субъединиц, связанных между собой различными способами (четвертичная структура). Часто они удерживаются вместе с помощью атомов металлов, коферментов. Разбавление во многих случаях приводит к диссоциации субъединиц, иногда же силы, связывающие их, более прочны и для этого требуется действие концентрированных растворов мочевины. Химотрипсин, например, находится в растворах чаще в виде димера, при разбавлении образуется мономер (Л1—23 000), а в концентрированных растворах содержится тример. Алкогольдегидрогеназа дрожжей при удалении из нее атомов цинка диссоциирует на четыре неактивные субъединицы (М = 36 000). [c.73]

В качестве критерия чистоты соединения пользуются также растворимостью. Известно, что растворимость гомогенного вещества постоянна и не изменяется в присутствии избытка твердого вещества. Этот метод вряд ли пригоден для определения растворимости белков в чистой воде, так как растворимость белков в воде сильно зависит от следов электролитов и от концентрации водородных или гидроксильных ионов. Влияние этих веществ можно исключить, если в качестве растворителя использовать концентрированный раствор соли. При проверке растворимости кристаллического яичного альбумина или карбокси-гемоглобина в растворе сернокислого ам1мония было найдено, что растворимость до некоторой степени зависит от количества твердой фазы [22]. На этом основании было сделано заключение, что молекулы этих белков можно рассматривать как системы обратимо диссоциирующих компонентов. Очень тщательные определения растворимости кристаллического химотрипсиногена [23] и рибонуклеазы [24] показали, что эти белки ведут себя как гомогенные соединения. В высшей степени важно, что эти гомогенные белки являются ферментами (см. гл. ХП). [c.15]

Книга, посвященная мембранным методам разделения ясидких систем, выходит в нашей стране впервые. В ней излагаются основы теории обратного осмоса, ультрафиль-гсрации в испарения через мембрану. Рассматривается практическое применение этих методов в химической, нефтеперерабатывающей и нефтехимической, пищевой, медицинской, микробиологической и других отраслях промышленности для разделения и концентрирования растворов, очистки промышленных стоков, опреснения морских и солоноватых вод, разделения азеотропных, близкокипящих ж нетермостойких смесей, смещения равновесия в химических реакторах, обезвоживания фруктовых и овощвых соков, молока при производстве и выделении биологически активных веществ, вакцин, вирусов, ферментов и т. д. [c.2]

Для выяснения механизма катализа оказались полезными исследования смещения кислотно-основных равновесий в ферментативной системе вследствие присоединения лигандов к свободным местам координационной сферы металла активного центра. При ингибировании ионами, подобными N или HS", в области значений pH, меньщих величины pH для диссоциации H N или HzS (при 23°С —9,3 или 6,9 соответственно [108]), должно наблюдаться выделение протонов. Общее количество последних будет зависеть уже от нового положения кислотно-основных равновесий системы. Для карбоангидразы исследавание этих явлений было проведено с помощью дифференциального титрования в интервале pH от 6 до 10 [86], т. е. в области устойчивости циа-нидного комплекса фермента. Метод заключался в фиксировании (на рН-стате с точностью 1 0,02 мкмоль Н+) выде.тения или поглощения протонов после прибавления к раствору фермента экви-молярного количества ингибитора, содержащегося в небольшом объеме его концентрированного раствора. [c.591]

Для быстрого концентрирования можно использовать сухой гель-фильтрующий материал, который при набухании исключает белок. Так как невозможно удалить весь белковый раствор с поверхности частиц без промывания (приводящего к разбавлению), этот метод пригоден лишь в тех случаях, когда более важное значение имеет концентрация раствора, а не выход белка. В лучшем случае можно ожидать, что потери белка составят 10—15%- Например, при обработке 100 мл раствора 20 г сухого сефадекса 0-25 порошок быстро набухает и поглощает воду, занимающую практически весь объем геля. После отса-сыванпя набухшего геля получают около 30 мл раствора, содержащего около 80% исходного белка, сконцентрированного приблизительно вдвое. Это весьма удобный метод, если необходимо быстро сконцентрировать уже концентрированный раствор, однако при очистке ферментов он обычно не применяется из-за потерь белка. [c.28]

Еще один метод концентрирования состоит в удалении воды за счет осмотических сил. Образец помещают в диализный мешок, который затем погружают в раствор или порошок, оттягивающий воду из мешка. Обычно для этого используют поли-этиленгликоль (мол. масса 20 ООО) или высокозамещенную карбоксиметилцеллюлозу. Оба этих полимера очень сильно поглощают воду, поддерживая низкую активность воды снаружи мешка и высокую внутри. Фирма СаШюсЬет выпускает эти вещества под названием Aqua ide . Они очень удобны при работе с небольшими объемами в течение 1 ч раствор объемом 10 мл можно сконцентрировать практически досуха, обсыпая диализный мешок порошком и периодически удаляя с его поверхности гидратированный гель. При работе с большими объемами можно использовать концентрированный раствор поли-этиленгликоля (например, 20%-ный). Диализный мешок оставляют в этом растворе при постоянном перемешивании на несколько часов. Метод можно считать вполне удовлетворительным при условии, что полимеры не содержат низкомолекулярных примесей, вредных для фермента. [c.28]

Некоторые ферменты необыкновенно устойчивы к инактивации, вызываемой любым из факторов, описанных в разд. 6.2. Часто это отмечается даже тогда, когда процедура очистки продолжается в течение нескольких недель. Внеклеточные ферменты отличаются большой устойчивостью потому, что 0Н1И существуют в более жестких природных условиях. В таких случаях быстрота операций не имеет большого значения, если решены проблемы протеолитической инактивации. Но в других случаях, когда стабильность фермента не столь велика, скорость опе раций может быть гораздо важнее, чем разрешегаие, достигаемое на каждом этапе, даже если это означает включение дополнительной стадии очистки для окончательного удаления из препарата примесей. При очистке нестабильных ферментов следует исключать диализ и гель-фильтрацию на медленно фильтрующих средах. Если это возможно, то одна стадия фракционирования должна следовать за другой без длительной подготовки. Так, после солевого фракционирования может идти гель-фильтрация, поскольку на этой стадии удаляется соль и в то же время происходит фракционирование белков. Но после солевого фракционирования нельзя сразу же использовать метод ионного обмена. Его можно применять только в исключительных случаях, когда соль, содержащаяся в осадке, не препятствует адсорбции нужного белка. Непосредственно после стадии ионного обмена невозможно использовать гель-фильтрацию, так как фракции нужно сконцентрировать, — очень редко при элюции с ионообменника получается острый пик, содержащий концентрированный раствор данного вещества (см., однако, обсуждение аффинной элюции в разд. 4.4 и х роматофокуси-рования в разд. 4.3). После фракционирования смеси с помощью органического растворителя может следовать ионный [c.266]

Предназначена для отделения высокомолекуляр- ных суспензий и т.д. методом ультрафильтрации и ных фракций из растворов биологически активных диафильтрации в лабораторных и полупромышлен-соединений, концентрирования и очистки растворов ных условиях, ферментов и полисахаридов, вирусных и бактериаль- [c.921]

Фракционирование сульфатом аммония. К полученному экстракту, (рН 7,0) добавляют при постоянном перемешивании небольшими порциями мелкоизмельченный сульфат аммония (50,5 г на 100 мл раствора). Доводят pH до 7,0—7,5 добавлением концентрированного аммиака. Через 30 мин выпавший осадок удаляют центрифугированием (60 мин при 30 ОООg). Доводят pH раствора до 7,8—8,0 и оставляют на ночь. Кристаллизация начинается сразу и продолжается в течение нескольких дней. Кристаллы отделяют центрифугированием (60 мин при 30 000g ) и суспендируют в растворе сульфата аммония насыщения 0,5, содержащем 5 мМ ЭДТА и 10 мМ дитиотреитол. Дальнейшая очистка фермента может проводиться следующими методами. [c.255]

Стабилизация ферментов глицерином может быть очень эффективным методом ферменты, которые в обычных условиях инактивируются чрезвычайно быстро, в присутствии глицерина могут оставаться активными в течение нескольких недель. Кроме того, поскольку содержащие глицерин растворы или совсем не замерзают, или образуют тонкую взвесь льда в концентрированной смеси глицерин—растворенное вещество, хранение их при очень низкой температуре не наносит ущерба ферменту. Вместо глицерина успешно используются [163] растворы сахаров или полпспиртов (глюкоза, сахароза, фруктоза, сорбит) механизм их действия, вероятно, сходен с механизмом действия глицерина. Другие гидрофильные вещества, например форма-мид и диоксан, имеют тенденцию разрушать ферменты при высоких концент1рац иях. [c.259]

Возможен и другой вариат мембраны, при котором необходимое вещество остается, а все другие компоненты пропускаются. На практике применяют мембраны обоих типов. Для сгущения термочувствительных жидкостей используется прием, основанный на избирательной кристаллизации воды в растворе при о.клаж-дении ниже О С. Сущность этого метода концентрирования заключается в том, что вода сгущаемого раствора превращается в кристаллы льда, увеличивая тем самым концентрацию растворимых веществ. Кристаллы льда удаляются центрифугированием или прессованием. Операция повторяется многократно до получения необходимой концентрации фермента. При таких условиях полностью исключаются потери термостабильных компонентов раствора (отсутствует термическое разрушение). [c.58]

Другим критерием чистоты является раст воримостъ, так как известно, что растворимость чистого вещества не изменяется в присутствии избытка твердого вещества. Однако применение этого метода наталкивается на ту трудность, что растворимость белков сильно изменяется в присутствии следов кислот, оснований или солей этот недостаток устраняют, применяя в качестве растворителя концентрированный солевой раствор. При этом было установлено, что некоторые белки, считавшиеся однородными, в действительности представляют собой смеси очень сходных веществ (например, яичный альбумин и карбоксигемоглобин), тогда как другие, безусловно, являются индивидуальными веществами (например, два кристаллических фермента — химотрипсиноген и рибо-нуклеаза). [c.417]

Белковый характер ферментов. Выше уже отмечалось, каким путем были получены водные экстракты, соки или даже твердые аморфные осадки, содержащие различные ферменты. До выделения чистых ферментов невозможно было оценить концентрацию фермента в этих сырых ферментативных препаратах. Однако на этом этапе исследований удалось получить в результате различных операций очистки препараты, в тысячу раз более активные, чем исходные тем самым было доказано, что ферменты являются, как правило, крайне активными катализаторами, действующими дан е в очень малых концентрациях. Этот результат не давал, естественно, никаких указаний в отношении абсолютной концентрации фермента. Среди методов очистки и концентрирования, примененных прежними исследователями, следует особо отметить метод, которым пользовались Вильштеттер и его ученики, очень сходный с современньш хроматографическим методом, а именно адсорбцию на таких твердых материалах, как каолин или окись алюминия, и последующее элюирование солевыми растворами. Эти исследования показали, что ферменты имеют коллоидный (на современном языке макромолекулярный) характер, но они не позволили уточнить их химический характер. [c.792]

Международная конференция по зонной плавке органических создинений 1, И] и обзоры [2, 5, 6] демонстрируют не только большие успехи в этой области, но также обобщают методики исследования и показывают, насколько актуальны вопросы получения в чистом виде органических веществ, в частности фармакологических препаратов [2, 6]. Однако метод непосредственной зонной плавки ограничивается в своем применении требованием термической устойчивости вещества и кристаллизации его из расплава. Большинство сложных физиологически активных веществ не удовлетворяют этим требованиям. Они либо разрушаются при плавлении (например, различные формы витамина В, В ), либо не кристаллизуются из расплава, образуя при охлаждении стекловидные модификации вследствие большой вязкости расплава (витамин В5). Применительно к сложным физиологически активным веществам этот метод используется для концентрирования разбавленных растворов витаминов, ферментов, бактерий, где как бы происходит очистка растворителя от примеси 14]. Для очистки более сложных веществ были предложены модификации метода — зонное осаждение [15] или зонная хроматография [16], которые заключаются в постепенном прохождении очищаемого вещества через колонну с растворителем. Применение этой методики в производственных условиях возможно только в области разбавленных растворов, так как в этом случае сохраняются стационарные те.мпе ратур ные режимы процесса, вследствие незначительного изменения теплот и температур плавления по дяине контейнера в процессе очистки. По-ви-димому, возможно применение зонного осаждения в производственных условиях и для очистки растворов, которые образуют системы с очень пологой линией ликвидуса, когда резкие изменения концентрации растворов связаны с незначительными изменениями температур плавления. [c.60]

Вурмен [1021 изучал образование летучих компонентов в малине под действием ферментов. Авторы работы [103] таким же методом определили серусодержащие соединения (мети л сульфид) в консервированных томатах. Пары поглощали концентрированной серной кислотой, затем кислоту разбавляли и анализировали паровую фазу над раствором. Таким путем удавалось определять метилсульфид в концентрациях 1,6—7,9 мкг/мл. При 100°С и атмосферном давлении концентрация метилсульфида в томатах составляла от 2 до 6 мкг/мл [104]. [c.105]

Замечательным достоинством этого метода очистки является то, что он позволяет избирательно извлекать из сложной смеси белков один конкретный белок или по крайней мере небольшое их число. Метод основан на использовании иммобилизованного лиганда, который специфически взаимодействует с тем белком, который требуется пблучить в очищенном виде. Из всех белков, присутствующих в смеси, с этим иммобилизованным лигандом связываются только те белки, которые способны вступать с ним в сильное взаимодействие. После удаления всех прочих несвязавшихся белков нужный фермент элюируют с иммобилизованного лиганда либо концентрированными солевыми растворами, либо раствором, содержащим растворимую форму лиганда. Успешное применение метода аффинной хроматографии позволяет добиться в ходе очистки поразительных результатов, обычно превосходящих результаты последовательного применения многочисленных классических методов. [c.70]

Хроматографию по сродству обычно применяют для очистки одногр компонента системы, состоящей из двух или более взаимодействующих веществ. Основной принцип заключается в прикреплении одного компонента к нерастворимой пористой матрице (иммобилизация). Связанный компонент (лиганд) может быть использован для специфической сорбции другого компонента в условиях, благоприятных для их взаимодействия и образования комплекса. Элюция сорбированного вещества может включать любую процедуру, ведущую к диссоциации. комплекса. Для очистки ферментов чаще всего используют конкурентные ингибиторы, связанные с носителями. В качестве лигандов могут быть взяты также кофакторы, субстраты ли фрагменты субстратов. В иммунологии хроматографию по сродству широко применяют для очистки антител на связанных антигенах и для выделения антигенов на связанных антителах. Метод с успехом используют для выделения белков-рецепторов, связывающих витамины и гормоны. ХрО матографию по сродству примедяют также для концентрирования разбавленных белковух растворов, удаления денатурированных или модифицированных ферментов из активных препара- [c.215]

В процессе выделения ферментов, других белков и нуклеиновых кислот биополимеры нередко получают в виде сильно разбавленных растворов, которые для дальнейшей работы необходимо концентрировать. Среди известных методов концентрирования биополимеров — высаливанием, осаждением органическим растворителями, испарением в мешочках для диализа, диализом против гипертонических растворов полимеров и др. — одним из наиболее удобных является метод ультрафильтрации. Этот метод 110з.воля т проводить концентрирование при очень мягких условиях низкой температуре, широких значениях pH, любой ионной силе раствора. Существенно, что концентрирование биополимеров происходит без концентрирования растворителя. Таким образом, денатурирующие воздействия самой процедуры сведены к минимуму. [c.231]

Adelman и соавторы (1973) предложили метод получения м.ембран, позволяющий увеличить выход мембран в постмитохондриальной надосадочной жидкости до 50%. Это достигается использованием в ходе выделения растворов концентрированной сахарозы, не содержащей ионов, и двукратным повторным суспендированием осадка митохондрий с последующим центрифугированием полученной суспензии. Однако и этот метод не лишен недостатков. В частности, описанная процедура получения постмитохондриальной надосадочной жидкости длительна, не позволяет получать мембраны в большом количестве и выделенные этим методом мембраны загрязнены ферментами лизосом и пероксисом. [c.334]

Ультрафильтрация представляет собой способ разделения вещества (вернее его концентрирование) с помощью мембранных фильтров. Технология ультрафильтрации привлекает своей простотой, относительной экономичностью и щадящим обращением с продуктом, поскольку осуществляется при умеренно низком внешнем давлении. Кроме того, в данном методе не требуется изменение рП, ионной силы раствора или перевода продукта в другую фазу. Поэтому метод перспективен при концентрировании малостабильных продуктов (некоторые аминоьсислоты, антибиотики и ферменты). [c.74]