Методы выделения хлоропластов

Ддя получения изолированных хлоропластов листья сначала измельчают растиранием в той или иной среде в зависимости от задачи исследования, а затем отделяют фракцию хлоропластов от компонентов клетки - цитоплазмы, ядер, крахмала, осколков клеток и других - ди еренциальным центрифугированием или центрифугированием в градиенте плотности или комбинацией обоих этих методов (Рабинович, 1951 Вечер, 1961 Осипова, 1%8 Методы выделения хлоропластов, 1970). [c.34]

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ХЛОРОПЛАСТОВ [c.166]

Описанный ниже метод можно применять для выделения хлоропластов из многих видов растений, а также для изучения других белков хлоропластов. [c.344]

На первом этапе выделения хлоропластов листья зеленых растений размельчают в соответствующей среде выделения, разрушая оболочки клеток. Затем гомогенат центрифугируют со скоростями, позволяющими отделить фракцию хлоропластов от других, более тяжелых и более легких компонентов клетки. Этот метод, основанный на последовательном разделении гомогената на фракции, осаждаемые при определенных значениях величины силы тяжести, получил название метода дифференциального центрифугирования. [c.167]

Выделение хлоропластов методом дифференциального [c.168]

В общем все методы, которые применяют для выделения хлоропластов, основаны либо на механическом разрушении самой ткаии листа, либо на разрушении в щадящих условиях. тех протопластов, которые были предварительно из нее получены. Такой прием был разработан лишь недавно, и в этом случае для получения протопластов используют ферменты (целлюлаза- -пектиназа), которые растворяют клеточную стенку клеток мезофилла. Для того чтобы получить интактные органеллы, протопласты осторожно разрушают в щадящих условиях. [c.545]

Данная работа представляет собой обзор результатов, полученных в наших работах [5—8] количественный анализ спинового обмена макромолекул [7, 8] проводится с использованием нового теоретического подхода. Вначале излагаются способы определения величин Тх и и учета ядерной релаксации методом НН, затем рассматривается применение метода НН для изучения спинового обмена. макромолекул и регистрации выделения кислорода в хлоропластах гороха под действием света. [c.212]

РНК хлоропластов. Опыты с нуклеиновыми кислотами хлоропластов всегда осложнены присутствием нуклеиновых кислот в других частях растительной клетки. Однако, как показывает анализ изолированных хлоропластов, выделенных как водным, так и безводным методами, хлоропласты содержат около 3—7% РНК и около 0,5% ДНК в расчете на сухой вес [6, 20]. Присутствие ДНК в хлоропластах [c.82]

В растительном материале протеолипиды представлены в хлоропластах. Для выделения их используют различные методы осаждения, диализ, хроматографию на сефадексах, электрофорез, ионообменную хроматографию и др. [c.379]

У высших растеиий имеется два типа реакционных центров. Один из них представлен более длинноволновыми формами хлорофилла а 683 и 700 нм (фотосистема I). В фотосистеме II-роль реакционного центра выполняют более коротковолновая форма хлорофилла а — 670 нм, некоторые каротиноиды и фикобилины, Всего в одном хлоропласте может содержаться в среднем около 2-10 реакционных центров. Исследования локализации фотосистем в мембранах хлоропластов й разделение их на фракции с применением метода ферментативного гидролиза и дифференциального центрифугирования показали, что более тяжелые частицы (при 20 ООО д ) оказались обогащенными компонентами II фотосистемы, а более легкие. (выделенные при 145 ООО g)— I фотосистемы. [c.187]

В 1937 г. М. В. Хилл разработал оригинальный метод измерения кислорода, выделяемого изолированными хлоропластами. Суспензию хлоропластов смешивают в темноте с гемоглобином и помещают в трубку Тунберга. Затем под вакуумом удаляют находящийся в растворе кислород и освещают препарат. Кислород, выделяющийся в ходе фотосинтетических процессов, вступает в реакцию с гемоглобином. Образование оксигемоглобина, которое сопровождается изменением спектральных характеристик раствора, прослеживают спектрометрически. Метод обладает хорошим быстродействием, но он наиболее чувствителен к изменениям парциального давления кислорода в сравнительно узком диапазоне — от 2,66 до 40 кПа (2—30 мм рт. ст.). Недостаток метода заключается также в том, что помимо изменения спектральных характеристик гемоглобина в ходе реакции образования оксигемоглобина освещение суспензии существенно влияет на оптические параметры самих хлоропластов. Это может исказить данные экспериментов. Кроме того, гемоглобин, адсорбируясь на мембранах хлоропластов, несколько изменяет кинетику процессов выделения кислорода. [c.193]

Основные требования к адекватному методу, позволяющему непосредственно регистрировать динамику выделения кислорода в суспензии хлоропластов, в основном аналогичны требованиям, изложенным в работах И, 12, 13 для метода изучения процессов Н+-транспорта. Так, отклик системы на световой импульс необходимо регистрировать в широком диапазоне времени, а измерительная аппаратура должна обладать высокими чувствительностью и быстродействием. Важно также обеспечить однородность освещения суспензии и свести к минимуму влияние тех диффузионных процессов, которые могут исказить результаты экспериментов. [c.195]

Эти методы служат для разрушения клеток и выделения ферментов в раствор. Если фермент локализован в органеллах, метод может быть использован только при условии, что органеллы также разрушаются. С другой стороны, может понадобиться предварительное выделение самих органелл, что позволит избавиться от загрязнения цитоплазматическими ферментами перед экстракцией фермента из органелл. Для этого требуется менее сильное воздействие. Предварительное растворение поверхностных коллагеновых и целлюлозных структур препаратами гидролитических ферментов позволяет в дальнейшем разрушать клетки более мягкими способами, сохраняя целостность органелл. Примером подобной методики служит получение препаратов митохондрий из таких тканей, как скелетная или сердечная мышцы, под действием протеолитических ферментов [6]. Однако эта методика применима только для получения препаратов в небольших масштабах и больше подходит для. метаболических исследований органелл, чем для очистки ферментов. Выход очищенных органелл может быть очень низким, поэтому во многих случаях лучше сначала разрушить всю ткань, а затем уже приступить к выделению нужного фермента из сложной смеси белков в экстракте. Таким образом, ферменты митохондрий и хлоропластов часто получают из тканевого гомогената, а не из выделенных органелл. [c.42]

В этом разделе кратко рассматриваются методы работы, используемые для выделения ферментов, структурно связанных с нерастворимыми компонентами клетки, такими, как митохондрии, хлоропласты, плазмалемма, эндоплазматический ретикулум и ядерные мембраны. Эти методы не применяются к водорастворимым ферментам, заключенным внутри органелл, например к белкам митохондриального матрикса, а лишь к ферментам, ковалентно связанным или прочно ассоциированным с частицами. Существенной степени очистки по сравнению с исходным материалом можно добиться, многократно промывая гомогенат буфером, в котором данный фермент не растворяется. После этого возможны два подхода к решению проблемы. Можно фракционировать осадок методом дифференциального центрифугирования (седиментация или градиент плотности), с помощью электрофореза или молекулярных сит . [c.52]

Кириченко Е.Ь. Выделение пластид в органических средах и исследование их функтшональноЯ деятельности. В сб. "Методы выделения хлоропластов", Пущино-на-Оке, 1970. [c.281]

Диссертационная работа М. С. Цвета, наряду с изложением результатов исследования хлоропластов, хлороглобина и хлорофилла и подробным обсуждением литературного материала, содержала немало интересных мыслей и рассуждений, характеризующих М. С. Цвета как ученого с материалистическим мировоззрением. В своей диссертации М. С. Цвет, подробно рассматривая различные методы выделения веществ, уделял внимание и адсорбции. В одном из разделов он отмечал ...Различно окрашенные пояса отчетливо наблюдались мною при фильтрации через шведскую бумагу петролейно-эфирной вытяжки листьев [12]. Эти слова свидетельствовали о внимании молодого исследователя к адсорбционным явлениям, а полученные результаты были первым его шагом на пути к открытию хроматограф ии. Именно поэтому впоследствии М. С. Цвет в предисловии к своему основному труду [13] с полным правом писал о том, что зачаток хроматографического метода находится в моем русском сочинении от 1901 года . [c.13]

Это обсуждение касалось только тех методов, которые можно использовать для выделения хлоропластов, Одиако из тех же принципов следует исходить и при получении функциоиально-активных митохондрий и пероксисом из листьев растений. [c.557]

Идея хроматографического метода в общем виде принадлежит русскому ученому бота)1ику М С. Цвету, который для разделения веществ использовал явление мзбкрательной адсорбции. Так, при фильтрации пигментов, выделенных нз хлоропластов и растворенных в петролейном эфире, через стеклянную колонку, заполненную карбонатом кальция, М. С. Цвет наблюдал разделение исходной смеси па окр. тен)1ые зоны в соответствии с эффективностью адсорбции пигментов на данном адсорбенте (рис. 9.1). Эти зоны перемешались в колонке с раз-лич)1ыми скоростями, при пропускании чистого растнорителя перемещение продолжалось до завершения разделения. Цвет назвал свой метод хроматографией (разделением по цвету), но уже тогда он вполне обоснованно предположил, что хроматографический метод применим и к бесцветным веществам. Однако а то время не было еще приборов, с помощью которых можно было бы контролировать процесс разделения бесцветных веществ. В настоящее время такие приборы имеются в больнгом разнообразии, их называют детекторами. [c.220]

Хлорофилл. Зеленый краситель листьев, называемый хлорофиллом (Пеллетье и Кавантур, 1819 г.), был впервые изучен Берцелиусом (1837 г.) в результате оптических исследований Стокс (1854 г.) установил, что он представляет собой смесь четырех веп] еств — двух хлорофиллов и двух каротиноидов. Выделение двух хлорофиллов было осуществлено М. Цветом (1906 г.) при помощи открытого им в связи с этим хроматографического метода. Оба хлорофилла а ж Ъ постоянно сопровождаются в хлоропластах зеленых листьев двумя каротиноидами — каротином и ксантофиллом (см. гл. Каротиноиды ). (5реди исследователей, внесших значительный вклад в эту область, приведем еще М. Ненки, Л. Мархлевского, Р. Вильштеттера и, наконец, Г. Фишера, [c.630]

Применение водноорганических растворителей является единственным эффективным методом экстрагирования хлорофилла и других пигментов из клеток. В этом случае вода действует на белковую фракцию системы хлоропласта, а органический растворитель— на липоидпую фракцию, включающую пигменты. Выделенные из [c.385]

В опытах с листьями наземных растений в замкнутой системе (фиг. 38, Б) имеются еще более сложные источники ошибок. Здесь один и тот же воздух в течение продолжительного времени циркулирует, проходя последовательно через прибор для измерения концентрации и через листовую камеру. Поэтому фотосинтез происходит при непрерывно уменьшающейся концентрации СОа и скорость его в любой момент времени можно определить, исходя из известного объема системы и наклона кривой, описывающей изменение концентрации СО2 во времени. Этот наклон определяется не только скоростью поглощения и выделения СО2 (соответственно хлоропластами и митохондриями), но и наружной концентрацией СО2 в данный момент времени, предшествующими изменениями этой концентрации во времени и, наконец, всеми значениями внутреннего сопротивления движению СО2. При наличии,очень точного метода определения концентрации объем замкнутой системы можно сделать достаточно большим относительно поверхности листа для того, чтобы снижение концентрации происходило крайне медленно (и вместе с тем поддавалось измерению). В противном случае видимый фотосинтез следует измерять в открытой или, еще лучше, в полузамкнутой системе (см. ниже), так как в этих случаях можно поддерживать постоянную скорость фотосинтеза, пополняя запас СО2 в воздухе по мере его расходования. Следует указать, что те же самые рассуждения приложимы и к опытам с открытой и замкнутой системами, в которых измеряются изменения концентрации кислорода, поскольку выделение кислорода обычно считается эквивалентным поглощению СОг- Однако теоретичесю [c.85]

Изава и Гуд [179] провели обширное исследование с целью выяснить число точек в изолированных хлоропластах шпината, которые чувствительны к ингибиторам выделения кислорода при фотосинтезе. Помимо монурона, они испытали М-(3,4-ди-xлopфeнил)-N N -димeтилмoчeвинy (диурон) и 2-хлор-4-этил-амино-6-изопропиламино-сил<л1-триазин (атразин). Поглощение всех трех ингибиторов хлоропластами оказалось состоящим из трех процессов 1) необратимое связывание одной молекулы ингибитора на каждые 1000 молекул хлорофилла (связанные молекулы не оказывают ингибирующего действия) 2) разделение ингибитора между внешней средой и хлоропластами выше этого порога концентрации 3) поглощение, определяющее степень ингибирования и обусловленное, возможно, образованием комплекса фермент — ингибитор. С учетом первого из этих процессов два метода анализа результатов, основанные на явле- [c.278]

Обнаружение полифуикциональных систем, функционирующих в некоторых биосинтетических путях, например в биосинтезе жирных кислот, позволяет предположить существование подобных ферментных систем и в других путях биосинтеза. Очень важно выяснить, характерны ли они также для фотосинтеза, и если да, то как они функционируют. Ответ на этот вопрос можно получить путем комбинации исследований с использованием радиоактивных изотопов, исследований изолированных ферментов, выделенных различными методами, и более детального изучения структуры хлоропластов методом электронной микроскопии и различными методами химического и физического анализа. [c.550]

Изучение состава и фунгаций хлоропластов стало возможным в последние 30-35 лет благодаря разработке методов их выделения, до этого времени хлоропласты изучались только внутри клеток цитологическими и микрохимическими методами. Наиболее изученными компонентами хлоропластов были пигменты, которые легко и полностью из них извлекаются. [c.34]

Растительные пигменты хроматографируют также в тонком слое силикагеля [374], однако этот сорбент, по-видимому, более подходит для выделения всей группы пигментов хлоропластов, чем для их разделения на индивидуальные компоненты. Так, например, на силикагеле, содержаш,ем 10% сульфата аммония, можно лишь отделить каротины и феофитины от хлорофиллов, а разделить каротины практически не удается. Используя высокоскоростной видеоденситометр, аналогичный применяемому в тех аминокислот, можно оценивать количество вещества в каждом хроматографическом пятне, причем результаты такого анализа близки к полученным обычными спектрометрическими методами. Проводя элюирование смесями грет-бутанол — бензол (1 9) и грег-бутанол — пентан — ацетон (1 18 1), авторам работы [377] удалось быстро и достаточно легко отделить хлорофиллы и их производные от желтых каротиноидных пигментов. В системе дихлорметан — этилацетат — диэтиловый эфир (8 2 1) была полностью разделена смесь зеаксантина, лютеина и диэфира лютеина [377]. Индивидуальные компоненты элюировали с силикагеля этанолом и определяли их фотометрически. Хроматографическая подвижность астаксантина и кантак- [c.251]

Прогресс знаний в области изучения механизмов кислородного обмена в хлоропластах во многом связан с развитием новых экспериментальных методов, позволяющих изучать динамику процессов выделения кислорода под действием коротких световых импульсов. Было показано (Уит-тингем, 1958 Браун, 1958), что для выделения молекулярного кислорода хлоропластами необходим световой импульс длительностью 5 мс. В том случае, если длительность вспышки меньше 5 мс, выделение кислорода наблюдается только после действия четырех световых импульсов. Эти данные позволили выделить ряд промежуточных этапов последовательного накопления энергии в кислородовыделяющей системе хлоропластов. Согласно наиболее распространенной схеме Кока, существует четыре промежуточных состояния, причем формальная схема их последовательного образования следующая [c.192]

Однако для исследования динамики процессов кислородного обмена, индуцированных световым импульсом в суспензии хлоропластов, полярографический метод не вполне пригоден. Этим методом нельзя непосредственно получить кривую, описывающую изменения концентрации кислорода в суспензии после действия вспышки. Можно лишь, многократно регистрируя зависимости ток — потенциал, получать данные о концентрации кислорода в суспензии через определенные интервалы времени, в лучшем случае — через сотни миллисекунд. Так как время выделения Ог хлоропластами, освещенными световым импульсом, составляет 10-2 (. (Витт, 1979), динамику выделения кислорода целесообразно определять на основании анализа кривых ток — время при фиксированном потенциале электрода, т. е. по-тенциостатическим методом. [c.195]

Материалы и химреактивы перед началом работы проводят выделение препаратов хлоропластов методом дифференциального центрифугирования. Полученную фракцию хлоропластов суспендируют в среде выделения и после гомогенезации разводят в 3—4 мл среды. В полученной суспензии определяют концентрацию хлорофилла. [c.198]

Большинство таких индикаторов ярко окрашены в окисленном состоянии и бесцветны в восстановленном (хотя имеются и исключения, такие как соли тетразолия и виологены). Эти индикаторы можно применять для определения окислительно-восстановительного потенциала отдельного раствора, а также исполь вать в качестве доноров или акцепторов электронов, причем в этом случае можно следить за скоростью реакции окисления или восстановления. По скорости восстановления красителя, наблюдая за окраской раствора, определяют также ферментативную активность (например, сукцийатдегидрогеназы). Применение индикаторов дает возможность изучать процессы переноса электронов в хлоропластах, митохондриях, бактериальных и дрожжевых клетках и даже в тканевых срезах и гомогенатах. Для определения степени окисленности или восстановленности обычно применяют спектрофотометрические методы, хотя можно следить и за поглош,ением или выделением газа, если оно имеет место в процессе реакции. [c.232]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология