Электрофорез изоферментов

Рис. 9-23. Электрофоретическое разделение разных молекулярных форм лактатдегидрогеназы (ЛДГ), Изоферменты обычно обозначаются цифровыми индексами, указывающими относительную скорость их перемещения при электрофорезе в полиакриламидном или крахмальном геле в стандартных условиях.

Одним из наиболее изученных 4 ферментов, множественность форм которого детально изучена методом гель-электрофореза, является ЛДГ, катализирующая обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную. Пять изоферментов ЛДГ образуются из 4 субъединиц примерно одинакового размера, но двух разных типов. Поскольку Н-протомеры несут более выраженный отрицательный заряд при pH 7,0—9,0, чем М-про-томеры, изофермент, состоящий из 4 субъединиц Н-типа (Н,), при электрофорезе будет мигрировать с наибольщей скоростью в электрическом поле к положительному электроду (аноду). С наименьщей скоростью будет продвигаться к аноду изофермент М в то время как остальные изоферменты будут занимать промежуточные позиции. Следует подчеркнуть, что изоферменты ЛДГ, обладая почти одинаковой ферментативной активностью, различаются некоторыми физико-химическими свойствами молекулярной массой, электрофоретической подвижностью, отнощением к ак- [c.128]

Изоферменты а-амилазы из сыворотки человека были разделены методом электрофореза в агаровом геле [1332]. По окон- [c.297]

Изоферменты обозначают самыми разными способами, но в настоящее время принято присваивать им номера в порядке уменьшения их электрофоретической подвижности. Обычно электрофорез проводят при pH 7—9 Большинство ферментов в этом интервале pH заряжено отрицательно. Ферменту, движущемуся с наибольшей скоростью к аноду, приписывается номер 1. Подобный способ уже давно используется при электрофорезе белков крови. Так, глобулины нумеруются в порядке уменьшения их подвижности (аь аг и т. д. см. дополнение 2-А) [71]. [c.68]

Определение изоферментов ЛДГ методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле основано па различиях в зарядовом состоянии и электрофоретической подвижности молекул разных изоформ белка. [c.271]

Изоферменты могут быть разделены электрофорезом, хроматографией, гель-фильтрацией. [c.196]

Б. Физиологическая основа. КФК представлена тремя изоферментами, разделяющимися при электрофорезе. Для скелетной мышцы характерен изофермент ММ, для миокарда—МВ, для мозга — ВВ. [c.373]

Был предложен метод определения относительных активностей изоферментов пероксидаз, разделенных путем электрофореза в крахмальном геле [775]. 20 мл основного раствора бензидина (для его приготовления 2 г бензидина растворяют в 18 мл ледяной уксусной кислоты и к ним добавляют 72 мл воды) смешивали с 70,4 мг аскорбиновой кислоты, 20 мл 0,6%-ной Н2О2 н 60 мл воды. Аскорбиновая кислота восстанавливала окисленный бензидин, благодаря чему развитие синей окраски задерживалось до тех пор, пока аскорбиновая кислота не окислялась полностью в процессе инкубации. Время, требуемое для развития окраски, прямо пропорционально концентрации аскорбиновой кислоты и обратно пропорционально активности фермента. [c.289]

Изоферментам ЛДГ присущи разные кинетические характеристики, величины pH, при которых они проявляют максимальную активность, сродство к субстратам и кофакторам. Для определения относительного содержания изоферментов используют ряд физико-химических методов электрофорез, ионообменную хроматографию, различия в кинетических параметрах отдельных изоферментов, дифференцированную чувствительность к субстратам и ингибиторам, имму но химические методы. [c.173]

После окончания электрофореза извлеченные столбики поместить в красящую смесь для проявления изоферментов ЛДГ. [c.272]

Козьи антитела против КК-ММ титровали также по их способности к преципитации антигенов. Контрольный препарат сыворотки человека, содержащий 80% очищенного изофермента КК-ММ и 20% очищенного КК-МВ (общая ферментативная активность 1300 МЕ/л при 37 °С), инкубировали 5 мин при комнатной температуре с различными разведениями антисыворотки. Далее добавляли избыток иммобилизованных вторых антител и инкубировали еще 5 мин. После центрифугирования полноту удаления КК-ММ и КК-МВ из супернатанта проверяли с помощью электрофореза, предварительно сконцентрировав образец в 5 раз. Для эффективного ингибирования и преципитации, как правило, требовалось разведение антисыворотки в 50—200 раз. [c.328]

Чаще всего обнаруживается изофермент, мигрирующий при электрофорезе между КК-ММ и КК-МВ, Было показано, что этот изофермент (изофермент типа I) в действительности представляет собой комплекс КК-ВВ с сывороточным IgG. Это подтвердили с помощью ряда экспериментальных приемов. Характер элюции данного изофермента при гель-фильтрации соответствует мол. массе 325000. Преципитация изофермента наблюдается как при действии антисыворотки против КК-ВВ, так и в присутствии А-белка. Кроме того, после инкубации при высокой концентрации мочевины наблюдается разрушение комплекса, сопровождающееся появлением при электрофорезе полосы с обычной подвижностью КК-ВВ. Наконец, при добавлении очищенной КК-ВВ к образцу сыворотки, содержащему аномальную КК типа I, наблюдается превращение добавленной КК-ВВ в аномальную форму, мигрирующую между КК-ММ и КК-МВ. Присутствие аномального изофермента типа I наиболее характерно для пожилых женщин. Как правило, он обнаруживается в сыворотке в течение нескольких месяцев или даже лет, но пока никакой корреляции между его присутствием и какими-либо клиническими проявлениями не установлено. [c.333]

Помимо вышеупомянутых классических вариантов аномальной креатинкиназы мы зарегистрировали у двух больных аномальный изофермент, который мигрирует при электрофорезе вместе с КК-МВ (рис. 21-12 и 21-13), но не реагирует с антисыворотками против КК-ММ или КК-ВВ. Происхождение и строение этого аномального изофермента еще не установлено. [c.334]

Наличие изоферментов может быть обусловлено также генетическими вариациями в гетерозиготах. Так, если генетически детерминированный вариант определенного белка несет на один положительный или отрицательный заряд больше (или меньше), чем стандартный фермент, то при электрофорезе соответствующей белковой фракции у гете-розигот будет обнаружен новый изофермент. Следует отметить, что электрофоретический метод, часто используемый для выявления изоферментов, не позволяет обнаружить генетические варианты, в которых замещения аминокислот не приводят к изменению заряда молекулы. [c.68]

Электрофоретическими методами установлено наличие 4 изоферментов церулоплазмина. В норме в сыворотке крови взрослых людей обнаруживается 2 изофермента, которые заметно различаются по своей подвижности при электрофорезе в ацетатном буфере при pH 5,5. В сыворотке новорожденных также были выявлены 2 фракции, имеющие большую электрофоретическую подвижность, чем изоферменты церулоплазмина взрослого человека. Следует отметить, что по своей электрофоретической подвижности изоферментный спектр церулоплазмина в сыворотке крови при болезни Вильсона—Коновалова сходен с изоферментным спектром новорожденных. [c.578]

Карбоангидраза существует в нескольытх молекулярных формах (изоферменты А, В и С), которые можно разделить ири иомощи электрофореза. [c.597]

Специфичность ферментативных тестов можно значительно повысить, проводя анализ не общей ферментативной активности, а отдельных молекулярных форм или изоэнзимов. Для этого применяют такие методики, как электрофорез, ионообменную или гель-распределительную хроматографию, изоэлектри-ческое фокусирование. Еще одним методом анализа изоферментов может служить использование специфических к изоферменту антител. Этот метод обладает высокой чувствительностью и может быть легко автоматизирован. В последние годы получила распространение диагностика наследственных заболеваний при помощи рекомбинантньос ДНК и метода полимеразной цепной реакции. В этой технологии большую роль играют ферменты рестриктазы. [c.87]

Четвертичная структура белков имеет, по-видимому, непосредственное отношение к существованию изоферментов. Изоферментами называются ферменты, встречающиеся у одного и того же биологического вида в разных структурных формах. Особенно хорошо изучен в этом отношении благодаря исследованиям Каплана, Маркерта и их сотрудников фермент лактатдегидрогеназа этот фермент был выделен из организма цыпленка в двух главных формах, из которых одна характерна для скелетных мышц, а другая — для сердечной мышцы. Эти две формы заметно отличаются одна от другой как по аминокислотному составу, так и по некоторым физическим, иммунологическим и каталитическим свойствам. Общее число различных форм лактатдегидрогеназы, обнаруженных у цыплят, а также выделенных из других источников, равно пяти. Три из них занимают по своим свойствам промежуточное положение менаду формой, характерной для скелетных мышц, и формой, характерной для сердечной мышцы. При электрофорезе, например, получается пять отдельных полос, находящихся друг от друга на равном расстоянии, причел крайние полосы соответствуют мышечной и сердечной [c.117]

Пероксидаза хрена в действительности не является простым ферментом. По-видимому, у многих, если не у всех, высших растений имеется множество форм пероксидазы (иногда их называют изоферментами) которые удается разделить методами электрофореза и (или) хроматографии. Множественность форм пероксидазы можно сопоставить с неоднородностью, обнаруженной у гемоглобинов (разд. 7.1 и 7.2). В корнеплоде репы найдено, например, семь изоферментов [151 ], а в хрене — около десяти изоферментов [131 ]. Относительная концентрация изоферментов может варьировать в зависимости от времени года [151 или от одной части растения к другой [147]. Подобные колебания в относительной концентрации изоферментов, возможно, связаны с различными и изменяющимися функциями пероксидаз в метаболизме растений. Четыре изофермента пероксидазы хрена, которые удалось выделить в очищенном состоянии, как оказалось, все содержат углеводный фрагмент и имеют примерно одинаковый аминокислотный состав [131]. Природа неоднородности остается неясной. Спектры различных изоферментов пероксидазы хрена почти идентичны, и практически совпадает их ферментативная активность, что облегчает сопоставле- [c.197]

Как и в случае множественных форм других ферментов, изоферменты АХЭ выявляют различными методами электрофореза или хроматографии. Некоторые наиболее типичные данные о результатах изучения изоферментов АХЭ нервной ткани сведены в табл. 2, анализ которой позволяет прийти к общему выводу, что АХЭ мозга несомненно имеет изоферменты, которые в зависимости от вида животного отличаются по числу и по некоторым свойствам. Несоответствия, наблюдаемые при сопоставлении работ разных авторов, легко могут быть объяснены видовыми различиями и различиями в методических приемах, применяемых при разделении изофермептов. [c.201]

При исследовании экстрактов из микробных клеток методом электрофореза в крахмальном или полиакриламидном геле, как правило, обнаруживают песколько фракций, обладающих способностью гидролизовать эфирные связи используемого субстрата. В настоящее время не представляется возмояшым с уверенностью называть эти множественные формы эстераз изоферментами , так как многие исследователи определяли активность получаемых с помощью электрофореза фракций только с одним субстратом. Поскольку эстеразы, по крайней море многие из них, характеризуются малой специфичностью, выявление таких множестветшых форм может быть обусловлено наличием в каждом случае целого семейства ферментов, члены которого обладают различной, но перекрывающейся специфичностью. [c.37]

Наличие различных изоферментов в органеллах может быть связано и с особыми условиями транспорта белка через мембрану из цитоплазмы в матрикс органеллы. Фумарат-гидратаза (КФ 4.2.1.2) присутствует и в матриксе митохондрий, и в цитоплазме клеток млекопитающих. Митохондриальная форма при электрофорезе движется в сторону анода медленнее, чем форма цитоплазматическая, но исследование межвидовых гибридных соматических клеток указывает на то, что обе эти формы могут быть продуктами одного гена и что различия между ними являются результатом постсинтетической модификации-[4761]. Эта модификация изофермента, по-видимому, довольно незначительна, и неясно, когда она совершается, — до или после проникновения фермента в митохондрию. Вопрос о механизме, с помощью которого в естественных условиях белки проникают в окруженные мембранами органеллы, окончательно не решен особенно трудно объяснить этот процесс в том случае, когда органелла окружена несколькими мембранами [479, 4112]. Лизосомы окружены одиночной мембраной при исследовании гомогенатов печени грызунов было установлено,, что фермент -D-глюкуронидаза (КФ 3.2.1.31) присутствует и в лизосомах, и в микросомной фракции, причем, хотя изофермент-ные его формы в этих компартментах различаются, они тем не менее образуются в результате посттрапсляционной модификации продукта трансляции одного гена. Эта модификация может-состоять в нековалентном присоединении какого-то пептида [2689], в частичном протеолизе или же в присоединении углевода [3574]. Возможно, однако, что лизосомы и эндоплазматический ретикулум имеют общее происхождене, и это облегчает транспорт белка между ними. [c.111]

Рис. 12.3. Распределение изоформ лактатдегидрогеназы в тканях крысы [29821 Тканевые экстракты подвергали гель-электрофорезу, а затем гель окрашивали, чтобы выявить положение изоферментов. Контур, обозначенный пунктирной линией, отвечает нзоферменту С4 из семенников, обладающему низкой активностью.

Б. Физиологическая основа. Щелочная фосфатаза присутствует в высокой концентрации в растущих костях, в желчи и в плаценте. В сыворотке щелочная фосфатаза содержится в виде смеси изоферментов, полностью еще неидентифицированных. Изоферменты могут быть разделены электрофорезом печеночная щелочная фосфатаза мигрирует быстрее, чем ферменты костей и плаценты, которые движутся вместе. [c.376]

Таким образом, электрофорез в гелях дает довольно легкий способ непосредственного определения частоты аллелей в популяциях. Он был введен в 1966 г. независимо английским генетиком Харрисом (Harris), американским биохимиком Хэбби (Hubby) и американским генетиком Левонтином (Lewontin). С тех пор определения изоферментов проводятся у всевозможных видов — от глубоководных беспозвоночных и разных видов дрозофилы до человека от широкораспространенных до редких видов от видов, для которых обычно случайное скрещивание, до [c.237]

Скорость образования соединений фермент—субстрат очень велика, и активность фермента лимитируется скоростью распада этого комплекса — константой Михаэлиса—Ментен Кт- Однако величина Кт может меняться в зависимости от того, какой изоэнзим катализирует данную реакцию. Так, Гибсон и Ли проверили два выделенных изоэнзима пероксидазы проростков гороха с искусственными (о-дианизидин и бензидин) и естественными (эугенол, кофейная и феруловая кислоты) субстратами и показали, что величина Кт различается для изоэнзимов этой пероксидазы в зависимости от использования того или иного субстрата. Исследуя изоэнзимный состав пероксидазы в динамике развития проростков гороха с этим пятью субстратами, они установили, что в опытах с кофейной кислотой наибольший пик активности наблюдается на 7-й день после проращивания семян. Методом электрофореза был выявлен изофермент, ответственный за эту реакцию, и выяснено, что он не реагировал с другими субстратами [Gibson, Liu, 1978]. [c.16]

Определение изоферментного спектра ЛДГ также используют в диагностических целях. Изоферменты сывороточной ЛДГ выявляются после электрофореза при pH 8,6 на крахмальном, агаровом или полиакриламидном гелях. При инфаркте миокарда обнаруживается увеличение содержания ЛДГ 1. Относительное повышение уровня ЛДГ 4 и 5 наблюдается при остром гепатите, тяжелом мышечном повреждении, дерматомиозите, мышечной дистрофии. [c.267]

С поверхности заполимеризовавшегося концентрирующего геля удалить воду и внести образец (смесь изоферментов ЛДГ, разведенную 40 %-ным раствором сахарозы в отношении 1 1) в количестве 0,2 мл. Наслоить раствор лидирующего красителя (0,001 %-ный раствор бромфенолового синего). Эта часть колонки непосредственно соприкасается с электродным буфером при электрофорезе, поэтому верхнее наслаивание заканчивается электродным буфером. Наслаивание проводят очень осторожно, избегая перемешивания образца с буфером, во избежание потери вещества. [c.272]

Большое преимущество данного метода заключается в том, что он дает возможность провести препаративный электрофорез без всякой поддерживающей среды и таким образом избежать трудностей, связанных с отделением от нее исследуемого материала. Этим способом можно выделять вещества, которые особенно чувствительны к взаимодействию с поддерживающей средой. Хэнниг [508] и Изихай (цитируется по Мауреру [839]) описали фракционирование сывороточных белков. При разделении изоферментов пероксидазы Эванс [344] показал, что включение в состав буфера 10%-ной сахарозы улучшает разделение фракций благодаря уменьшению скорости диффузии. [c.25]

Фриц и др. 408] обнаружили, что соотношение между изоферментами ЛДГ, выявленными с помощью электрофореза в геле и последующего специфического окрашивания разделенных зон, зависит от количества нанесенного на гель белка. Более того, соотношение изоферментов, определенное при электрофорезе, отличается от их соотношения при измерении другими методами. Меньшие количества фермента обнаруживали более высокую относительную активность, что, вероятно, объясняется медленным проникновением в гель субстрата и сопрягающего агента. При электрофорезе в микрогелях изоферментов глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы подобных отклонений не наблюдалось [257]. В этом случае субстраты, коферменты, сопрягающие агенты и другие низкомолекулярные соединения очень быстро проникают в гель, благодаря чему обеспечивается постоянный избыток субстрата и других реагентов. Таким образом, микрогель можно рассматривать как микрокювету и использовать его для количественного определения пикограммовых количеств ферментов, а также для изучения кинетики ферментативных реакций. Детальное описание этих методов дается в работе Нейхоффа [915]. [c.283]

Изоферменты липоксигеназы можно выявить после электрофореза на ацетате целлюлозы, инкубируя электрофореграммы в течение 20 мин в 7,5 мМ растворе линолевой кислоты в 0,25%-ном растворе детергента твин 20, забуференной 0,2 М фосфатом до pH 6,5. После инкубации электрофореграммы промывают дистиллированной водой и погружают на 30 с в 5%-ный раствор Fe(iNH4)2(804)2 в 3%-ной НС1, а затем еще на 30 с в 20%-ный раствор (NH4)S N. В местах расположения фермента появляются красновато-коричневые пятна [487]. [c.291]

Анализ изоферментов, проведенный в гомогенатах линий клеток 25 видов, показал, что этот биохимический признак можно использовать для подтверждения вида [11]. Определяя спектры трех изоферментных систем (глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (ГФД), лактатдегидрогеназы (ЛД) и нуклеозидфос-форилазы (НФ)) с помощью вертикального электрофореза в крахмальном геле, можно с высокой степенью надежности оп- [c.120]

Разработаны удобные методики для определения изоферментов, связанных с сердечной деятельностью, таких, как лактат-дегидрогеназа-1 (Н4) и креатинкиназа MB. Эти методики обеспечивают надежные результаты, хорошо согласующиеся с результатами электрофореза (Wi ks, Usategui-Gomez, 1985). [c.31]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология