Фермент степень очистки

При установлении степени очистки ферментного препарата необходимо рассчитать удельную активность фермента, характеризующую содер каиие фермента в исследуемом материале. Под удельной активностью понимают число единиц активности на единицу веса сухого препарата она выражается числом единиц на 1 мг белка. [c.198]

Для окончательного фракционирования белков используют также электрофорез, в основе которого лежит разделение кислых и основных молекул белков по их заряду в электрическом поле. Ферменты при достаточной степени очистки их раствора можно получить и в кристаллическом виде. Кристаллизацию ферментов проводят из растворов сульфата аммония, спирта или органических растворителей. К концентрированному раствору фермента осторожно по каплям добавляют насыщенный раствор сульфата аммония или спирт до появления едва заметной мути. Затем раствор на несколько дней оставляют на холоде. Выпавшие кристаллы отделяют и ведут перекристаллизацию до тех пор, пока продолжает увеличиваться активность фермента. [c.203]

Тем не менее попытки выделить и очистить АХЭ из мозга производились неоднократно (табл. 1). Главпая трудность состояла в солюбилизации фермента, потому что только полностью растворимый в воде или в водно-солевых растворах фермент могкет быть подвергнут дальнейшей очистке. Из табл. 1 видно, что разные авторы решали эту проблему по-разному. Одни для этой цели применяли детергенты, другие — органические растворители, третьи — протеолитические ферменты. В большинстве случаев, особенно при применении детергентов, степень очистки была сравнительно невысокой, а выход фермента, как правило, был очень низким. [c.197]

Перед тем как приступить к выделению и очистке того или иного фермента, необходимо выбрать удовлетворительный тест для его идентификации и количественного определения. Прямые методы существуют лишь для очень ограниченного круга ферментов, поэтому используют способность ферментов катализировать специфическую реакцию. Чтобы иметь возможность контролировать степень очистки фермента, его активность относят на 1 мг общего белка (так называемая удельная активность ). [c.198]

Суммарный выход достаточно высокий, а степень очистки превосходная - в 250 раз Но такие показатели далеко не типичны для разных ферментов [c.56]

Оформление работы. Результаты определения активности аргиназы, полученные на трех этапах очистки фермента, сводят в таблицу. Выход фермента рассчитывают, принимая его содержание (в единицах активности) в исходном экстракте или гомогенате печени за 100%. Степень очистки фермента во фракциях Б и В получают путем деления удельной активности фракций на удельную активность исходного препарата (фракция А). [c.51]

Таким образом, удерживаемые в электрическом поле ферменты осуществляют соответствующие превращения субстратов. Следует отметить, что при отключении поля ферменты вымываются потоком жидкости из объема загрузки при этом они не теряют своих каталитических свойств и могут быть повторно иммобилизованы. Опыты показывают, что с помощью электрического поля можно иммобилизовать ферменты любой степени очистки — от кристаллических до находящихся в сложных биологических смесях, в том числе в бесклеточных экстрактах [52, 53]. [c.182]

В том случае, если последней стадией очистки металлофермента является его отделение от другого металлопротеина, содержащегося в более высокой концентрации и содержащего тот же металл, описанный выше критерий (2) не может быть применен. В данном случае повышение степени очистки фермента сопровождается уменьшением соотношения металл — фермент, как и наблюдалось для цинка, связанного пируваткарбоксилазой из пекарских дрожжей [114]. Поскольку в таких ситуациях критерий [c.459]

Инактивация фермента даже высокой степени очистки, если он находится в разбавленном растворе, далеко не всегда характеризуется кинетикой нулевого порядка [как уравнение (26)]. Это объясняется тем, что радикалы могут реагировать не только с активным ферментом, но и с инактивированным ферментом. Таким образом, по мере облучения сам фермент все более и более выполняет роль защитного вещества. При этих условиях величинами 4 (и кв) в уравнениях (28) —(32) на стр. 234 можно пренебречь ввиду их незначительности роль же з, наоборот, должна возрастать. [c.237]

С увеличением числа промывок фактор очистки Pf также значительно возрастает. Например, если каждая единичная промывка имеет относительно большой объем (гг /у = 10), Р/ возрастает с 2 до 22. Уменьшение процента выхода фермента при этом зависит также от Кь. Например, для /Сь=Ю моль/л выход фермента снижается незначительно, но для = моль/л выход при высоких величинах К1 уменьшается с 90 до 82%, а для Кь = = 10" моль/л он понижается уже с 83 до 44%. На рис. 3.5,6 показана зависимость процента выхода фермента от К1 после 10-кратной промывки при ш/и = 1. Для /Сь=10 моль/л достигается очень высокая степень очистки (Р/ = 2000) при относительно большом выходе фермента. [c.30]

Такая полная очистка, осуществленная для сравнительна ограниченного числа ферментов, представляет довольно сложную экспериментальную задачу. Неполная очистка ферментных препаратов бывает связана со значительными трудностями из-за ничтожного количества фермента в исходном материале. Практически наиболее часто исследованию подвергаются препараты ферментов больщей или меньшей степени очистки или же непосредственно с вытяжкой из объектов животного или растительного происхождения, содержащей изучаемый фермент. [c.49]

На заключительных этапах очистки в отдельных случаях удается кристаллизация ферментного белка. Чаще всего ее проводят из растворов сульфата аммония, реже — из водноацетоновых или водноспиртовых растворов. Неоднократно подтверждалось, что кристаллическое состояние не является доказательством гомогенности белка и даже не всегда указывает на высокую степень очистки. Часто кристаллы содержат 50—60% ферментного белка и даже меньше. Во многих случаях это бывает при кристаллизации микробных ферментов, где иногда говорят о кристаллах, богатых белком. В составе примесей могут быть иные ферменты [c.153]

Известно, что с повышением степени очистки фермента или иного белка его устойчивость обычно падает. Так как белки могут стабилизироваться другими белками (часто балластными или примесями ), поскольку их стабилизируют продукты реакции, коферменты, продукты распада белков или даже нейтральные соли, то при производстве ферментного препарата следует учитывать возникающие при их удалении опасности. Излишняя степень очистки почти всегда нежелательна. В каждом отдельном случае необходимо ясно представлять себе, в какой мере белок должен быть освобожден от примесей, не снизит ли это резко его устойчивости как при выделении, так и при хранении и использовании фермента в производстве. Кстати, высокая очистка обычно и сильно удорожает выпускаемый препарат. Несмотря на все эти замечания, еще раз подчеркиваем, что будущим в ферментной промышленности, как и в большинстве других областей использования ферментов, является, по-видимому, применение их чистых препаратов. При решении возникающих задач, следовательно, надо учитывать различные стороны вопроса. Можно иметь в виду, что часто применяемые наполнители [c.168]

Было установлено, что сорбция амилазы ионообменными смолами (ЭДЭ-ЮП) зависит от метода и степени очистки ферментов. В табл. 15 приведены результаты сорбции и десорбции [c.91]

Необходимо отметить, что степень инактивации ферментов зависит также и от степени их очистки. Чем меньше степень очистки, тем меньше и инактивация фермента, так как белковая молекула неочищенного фермента защищена поверхностноактивными веществами, обладающими полярностью, средней между полярностью белковой молекулы и водного раствора органического растворителя. Это способствует взаимодействию защитного слоя с раствором органического растворителя и тем самым предотвращает его взаимодействие с молекулой фермента. Как установил П. А. Ребиндер, адсорбция на границе двух [c.131]

Рекомендуется применять очищенные препараты ферментов, для чего пользуются фракционным осаждением части белкового балласта сульфатом аммония при разных pH. После отделения осадка на центрифуге, диализа и лиофилизации полученные сухие вещества обладают по сравнению с нормальной сывороткой повышенной, в зависимости от степени очистки, активностью и пониженным буферным действием и склонностью к денатурации [c.174]

В то же время Вильштеттер отмечал, что удаленне из препаратов белковых веществ влечет за собой снижение стабильности ферментов и прогрессивную потерю активности. Именно здесь крылись причины тех разочарований, которые принесло использование метода адсорбции для очистки ферментов. Во-первых, адсорбционный метод оказался не столь избирательным, как это предполагалось сначала. Часть ферментов так и не удалось разделить. Но главный недостаток заключался в том, что при повышении степени очистки ферментного препарата нередко исчезало, притом внезапно в необъяснимо, то единственное свойство, по которому собственно и судили о присутствии фермента в препарате - его активность. [c.139]

В 1913 г. появилась фундаментальная работа Л. Михаэлиса и М. Л. Ментена по ферментативной кинетике. В 1922—1928 гг. Р. Вильштеттер и его ученики, усовершенствовав метод избирательной адсорбции и последующей элюции, достигли блестящих успехов в получении ферментативных препаратов высокой степени очистки. Последние были в сотни и тысячи раз активнее исходных носителей ферментов. Вместе с тем Р. Вильштеттер, добиваясь высокоочищенных ферментных препаратов, на последних стадиях очистки терял какие-то в то время неизвестные вещества (коферменты) и фермент утрачивал свою активность. [c.123]

На каждом этапе колоночной хроматографии содержание белка в смеси увеличивается не более, чем в 20 раз. и поэтому выделить из сложной смеси белков отдельный белок за один цикл практически невозможно. На долю каждого белка, как правило, приходится менее 1/1000 всего белка клетки, и для его очистки требуется последовательное использование нескольких различных типов колонок (рис. 4-47). Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография но сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. Так, при ковалентном связывании субстрата фермента с матриксом, например, с полисахаридными шариками, фермент специфически удерживается матриксом и может быть элюирован (смыт) практически в чистом виде. Подобным образом можно иммобилизировать короткие олигонуклеотиды ДНК определенной структуры (см. разд. 4.6.8) и использовать подобные носители для очистки ДНК-связывающих белков, опознающих данную последовательность нуклеотидов на хромосомах (см. разд. 9.1.8). С матриксом можно связать и специфические антитела такой носитель очень удобен для очистки белков, узнаваемых этими антителами. Аффинные колонки обладают высокой степенью специфичности за один цикл хроматографии можно добиться очень высокой степени очистки (1000-10000 раз). [c.213]

Биоспецифическая хроматография применяется для очистки ферментов, так как она позволяв извлекать ферменты из сложных смесей в одну стадию с высокой степенью очистки и с большим выходом. В последнее время в качестве адсорбентов-носителей в биоспецифической хроматографии находят применение как макропористые неорганические адсорбенты (силикагели, силохромы, пористые стекла), так и макропористые органические сшитые сополимеры, например макропористые сополимеры глицидилме-такрилата с этилендиметакрилатом типа сферой (см. лекцию 6) со сферическими зернами разных размеров. Эти адсорбенты-носители обладают разной удельной поверхностью и крупными порами разных размеров. На рис. 18.10 представлен пример биоспецифической хроматографии химотрипсина на сфероне с иммобилизованным химической прививкой белком — ингибитором трипсина (являющегося также ингибитором химотрипсина). Из колонны, заполненной обычным макропористым сфероном без иммобилизованного ингибитора, химотрипсин выходит вместе с остальными белками, а из колонны, заполненной сфероном с привитым ингибитором, сопутствующие белки выходят приблизительно за то же время, а химотрипсин прочно удерживается. Это позволяет отделить [c.342]

Получают препарат II изозима гексокиназы из растворимой клеточной фракции скелетных мышц крысы. После определения белка микробиуретовым методом оценивают удельную активность фермента, а также степень очистки. При этом учитывают, что на долю II изозима гексокиназы приходится 60% от общего содержания фермента в растворимой клеточной фракции скелетных мышц. [c.376]

В наименовании препарата отражаются способ культивирования микроорганизмов, степень очистки препарата и степень концентрирования ферментов. С этой целью после наименования препарата ставится индекс. Например, Амилоризин ПЮх или Амилосубтилин Г20х. В индексе буква П означает, что препарат получен поверхностным способом культивирования, а буква Г — глубинным. Буква х условно обозначает количество фермента в стандартной (обладающей строго определенной активностью на единицу массы), глубинной или поверхностной культурах. Цифра перед буквой х отражает степень очистки препарата. [c.90]

В настоящее время известно около 2000 ферментов, более 100 из них получены в кристаллическом состоянии [3]. Наиболее развита ферментная промышленность в США, Японии, Великобритании, Германии, Дании, Нидерландах и Франции. Ежегодный прирост объемов производства ферментов за последние 25 лет составлял от 5 до 15 %. Основными ферментными препаратами являются грибные и бактериальные амилазы и протеиназы, глюкоамилазы, глюкозоизомераза, целлюлазы и гемицеллюлазы, липазы, р-галактозидаза, реннин и некоторые другие [4, 5]. Наибольший удельный вес (до 65 % выпускаемых препаратов) имеют протеиназы для производства синтетических моющих средств и амилазы для переработки крахмала. До 10 % вьтускаемых ферментов потребляет виноделие и производство соков по 5 % приходится на производство сыра, хлеба и спирта 4%— на пивоварение и 6 %—на остальные отрасли промьппленности [6, 7]. Доля ферментов для медицинских целей и научных исследований в общем объеме производства невелика. Они отличаются высокой степенью очистки, сложной и энергоемкой технологией, необходимостью использования дорогостоящих материалов. [c.160]

Гидрогеназы многих прокариот также обнаруживают высокую чувствительность к молекулярному кислороду, которая in vitro в большой мере зависит от метода вьщеления и степени очистки. Как правило, более устойчивы к Oj неочищенные ферментные препараты. По сравнению с мембрансвязанным ферментом устойчивость к О2 гидрогеназы, отделенной от мембраны, обычно ниже. Фермент, полученный из клеток анаэробов, более чувствителен к О2, чем вьщеленный из клеток аэробных прокариот. [c.329]

Не менее относительным является и понятие нативности полисахаридов ГМЦ. В настоящее время можно говорить лищь большей или меньшей модификации их в процессе выделения. Как правило, при этом происходит их частичная деполимеризация и окисление. Кроме того, при извлечении в большинстве случаев разрушаются межмолекулярные связи (водородные, ковалентные) полисахаридов ГМЦ с другими компонентами клеточных стенок. Для выделения максимально нативных препаратов полисахаридов перспективно, по-видимому, применение ферментов [174, 209]. Так, Альбершейм, располагая рядом ферментов высокой степени очистки, выделил из клеточных стенок взаимосвязанный фрагмент , сочетающий в себе иолисахариды ГМЦ (арабиногалактан, ксилоглюкан) и рамногалактуронан, в котором сохранились нативные межмолекулярные связи, что позволило автору в дальнейшем установить природу этих связей и сформулировать гипотезу о функциональном назначении каждого из биополимеров в архитектонике клеточной стенки [121]. [c.56]

В промышленности высокая степень очистки ферментов не всегда нужна. Очист5 а должна быть очень высокой в случае использования ферментов как терапевтических препаратов. [c.59]

При разработке таких схем получения меченых соединений главной задачей является возможно более полное превращение дефицитного и дорогостоящего исходного соединения в искомый продукт. Например, при проведении биосинтезов использовались ферменты с высокой степенью очистки, а также проводился подбор их наилучшего соотношения, чтобы скорость образования высокомеченых препаратов была максимальна. При проведении химических реакций для реализации той же задачи оптимизировались температура, время реакции и концентрации немеченых реагентов. [c.526]

Приведенный ниже материал можно было бы сгруппировать на основании классификации, принятой недавно Международным биохимическим союзом. Хотя такая классификация ферментов и желательна, все же для неэнзимоло-гов, интересующихся фенолами, изложение будет более наглядным, если обсуждение свести к некоторым метаболическим путям (например, путь через шикимовую кислоту), соединению или группе соединений (реакции фенилаланина и тирозина) или типу реакций (метилирование). Особое внимание уделено степени очистки ферментов в каждой конкретной работе. [c.314]

При очистке веществ белково-пептидной природы (в частности, ферментов), которые растворимы лишь в воде и водных растворах, нередко используют приемы, основанные на уменьшении их растворимости при прибавлении к водным растворам солей или смешивающихся с водой органических растворителей. Увеличивая концентрацию соли (например, сернокислого аммония или поваренной соли) в воде, можно осадить те или иные из растворенных веществ. Таким путем удается значительно очистить ферменты от сопровождающих веществ, так как нередко изучаемое вещество осаждается при другой концентрации соли, чем примеси (дробное осаждение). Повторяя такой процесс с небольшими модификациями (осаждение при разных значениях pH и при различной концентрации солей), обычно удается получить концентраты фермента (или другого биорегулятора) высокой степени очистки, но содержащие значительные примеси солей. Последние удаляют посредством диализа (при котором низкомолекулярные вещества проходят через полупроницаемую пленку, например из целлофана, и удаляются, а высокомолекулярные остаются) или путем гельхроматографии (в последнее время), что значите, ьно быстрее. [c.21]

Данные относительно действия высоких температур на пероксидазу разноречивы. Очевидно, устойчивость препаратов находится в тесной связи со степенью очистки фермента от разных примесей. Установлено, что одним нагреванием до кипения пероксидаза, как и фенолаза, еще пе разрушается, так как через несколько часов вскипяченный раствор опять дает характерные реакции окисления. Пероксидаза разрушается окончательно только после вторичного кипячения. [c.82]

Влияние химических факторов на активность ферментов. Активность ферментов значительно меняется в зависимости от изменения условий, в которых они действуют. Так, например, для каждого фермента существует определенная область концентрации водородных ионов, в которой лежит оптимум его действия. Для пепсина оптимальное значение рН=1,5—1,6 для трипсина 7,8—8,7 для сахаразы 4,5 для липазы рицинуса 4,7 для липазы поджелудочной железы 8,0 и т. д. Однако на положение оптимума влияет степень очистки фермента. Так, например, оптимальное pH для липазы из слизистой оболочки желудка собаки равняется 5,5—6,3 после электродиализа оно будет 6,3—7,1 после адсорбции каолином 7,1—7,9. В области оптимального pH ферменты обычно устойчивы, но это небезусловно для трипсина оптимум расщепления белка лежит при рН=7,8—8,7, а наибольшая устойчивость—при рН=6,0 для пепсина оптимум действия при рН=1,5—1,6, а наибольшая устойчивость наблюдается при рН==4,0. [c.338]

К этому времени Эйвери, Мак-Леод и Мак-Карти уже проделали большую работу в связи с критическими замечаниями о том, что они повторили ошибку Вильштеттера. Они показали, что обработка трансформирующей ДНК пневмококков различными ферментами, расщепляющими белки, не влияет на ее биологическую активность, тогда как вся трансформирующая активность сразу разрушается даже при кратковременной обработке дезоксирибонуклеазой, или ДНКазой — высокоспецифическим ферментом, гидролитическое действие которого проявляется исключительно в отношении полинуклеотида ДНК (фиг. 74). Поэтому трудно было понять, каким образом предполагаемая активная белковая примесь могла остаться устойчивой к ферментам, расщепляющим белки, будучи чувствительной к специфической в отношении ДНК дезоксирибонуклеазе. Хочкисс продолжил химическое фракционирование трансформирующего начала и к 1949 г. получил препарат активной ДНК, максимальное количество белковой примеси в котором было снижено до 0,02%. Однако даже такая невероятная степень очистки не убедила тогда всех в том, что именно ДНК ответственна за наследственные изменения лишь в середине 50-х годов, когда дезоксирибонуклеиновая природа генетического мате- [c.160]

В системе in vitro используется классический подход проводят очистку всех компонентов и подбирают условия, при которых наблюдается правильная инициация. Правильная инициация определяется как процесс образования РНК, начинающийся в сайте, соответствующем 5 -концу мРНК. В последнее время появилась возможность осуществить это в отношении каждой из трех эукариотических РНК-полимераз. Имеющиеся системы характеризуются различной степенью очистки. В состав некоторых систем входят неочищенные клеточные экстракты, содержащие РНК-полимеразу, в других-фермент добавляют к клеточному экстракту. В дальнейшем эти системы должны быть заменены препаратами, содержащими все охарактеризованные компоненты, и тогда in vitro можно будет сравнивать активности РНК-полимераз из различных тканей и объектов. [c.149]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология