Рибонуклеаза реакции

Рис. 59. Схема, активного центра рибонуклеазы в форме, благоприятствующей протеканию первой стадии реакции

Прежде чем проводить расщепление полипептидной цепи, обычно сначала разрывают дисульфидные мостики [138—141]. Для этой цели можно использовать три реакции [см. уравнения (2-20) —(2-22) ]. При работе с рибонуклеазой использовалось окисление надмуравьиной кислотой [c.173]

Из панкреатической железы была выделена рибонуклеаза, полученная в 1940 г. в кристаллическом состоянии. Она действует на РНК, расщепляя фосфоэфирную связь присоединенного к положению 3 пиримидинового нуклеозида (см. гл. 22.3). Особенности ее действия были исследованы Маркхамом и Смитом, которые показали, что первичными продуктами действия этой РНазы на РНК являются 2, 3 -циклофосфаты уридина и цитидина (47). Они в свою очередь на следующей стадии ферментативной реакции мед ленно гидролизуются до З -фосфатов [60]. Для пуриновых остат ков в то время не было аналогичных ферментов, обладающих по добной специфичностью. (Такодиастаза была открыта позднее) Однако в руках исследователей была фосфодиэстераза селезенки которая действует как экзонуклеаза н дает все четыре рибонук леозид-З -фосфата. [c.58]

Существует несколько методов, с помощью которых можно обнаружить аминокислотные остатки, ответственные за биологическую активность белков. В первом методе белок необходимо подвергнуть частичной деградации, в особенности вблизи Л/- и С-кон-цов соответственно с помощью аминопептидаз и карбоксипептидаз. Например, удаление (с помощью карбоксипептидазы) трех остатков с С-конца рибонуклеазы не влияет на ее активность. Более глубокая деградация в этой части молекулы, однако, приводит к инактивации. По второму методу необходимо подвергнуть химической модификации боковые группы аминокислотных остатков белка. Естественно, что результаты такого рода экспериментов проще интерпретировать в том случае, когда эта модификация специфична. Например, легко идентифицировать область связывания кофермента пиридоксальфосфата в аминотрансферазе. Альд-имин, образующийся в результате конденсации кофермента с е-аминогруппой остатка лизина, восстанавливают борогидридом натрия и идентифицируют, так как он не затрагивается при гидролитическом распаде. Аналогично, ферменты, содержащие тиольные группы, такие как алкогольдегидрогеназа, 3-фосфоглицераль-дегиддегидрогеназа и папаин, обычно ингибируют реакцией с п-хлормеркурибензойной или иодуксусной кислотой. Специфичность модификации белков можно усилить, если структура реаген- [c.282]

Уделив внимание некоторым механизмам гидролиза, интересно сравнить их с механизмом реакции, происходящей в активном центре некоторых ферментов, катализирующих подобные превращения. Фермент бычья панкреатическая рибонуклеаза А (РНаза А) (М = 13 680, одна полипептидная цепь, состоящая из 124 аминокислотных остатков) катализирует деградацию РНК по двустадийному механизму [c.126]

Твердофазная техника приводила к существенной экономии труда и времени, необходимых для пептидного синтеза. Так, например, ценой значительных усилий Хиршмен с 22 сотрудниками [5f] завершили вьщающийся синтез фермента рибонуклеазы (124 аминокислотных остатка) с помошью традиционных жидкофазных методов. Почти одновременно тот же белок был получен путем автоматизированного твердофазного синтеза [5g], Во втором случае синтез, включающий 369 химических реакций и 11 931 операцию, был вьшолнен двумя участниками (Гатте и Меррифилд) всего за несколько месяцев (в среднем до шести аминокислотных остатков в день присоединялись к растущей полипептидной цепи — фантастический темп ). Последующие усовершенствования позволили построить полностью автоматический синтезатор. Таким образом, дерзновенная и волнующая проблема пептидного синтеза, решение которой ранее требовало огромных затрат труда и времени, теперь может считаться практически решенной (по крайней мере, для не слишком сложных пептидов). [c.302]

Может оказаться невыгодным синтезировать таким способом пептид, содержащий более 15 аминокислотных единиц, но рибонуклеаза, которая состоит из 124 аминокислотных единиц, была синтезирована целиком с помощью твердофазных реакций блочным методом (разд. 14.7.1). [c.333]

На рис. VII.6 приведена последовательность аминокислот в бычьей рибонуклеазе — ферменте, катализирующем некоторые клеточные реакции. Этот фермент образован 124 молекулами аминокислот на рисунке каждая представлена стандарт1[0й аббревиатурой из трех букв. [c.453]

Зависимость времени релаксации реакции (9.11) от суммы равновесных концентраций рибонуклеазы и уридин-З -монофосфата. Уелрвия опыта pH 5,5 25° С ионная сила 0,2М (K I) [c.201]

Рибонуклеозидтрифосфаты и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты не являются субстратами фермента. Фермент не нуждается в матрице, однако для синтеза необходима затравочная цепь РНК (НМФ) со свободной З -гидроксильной группой, к которой присоединяются остатки мононуклеотидов. Образовавшаяся полимерная молекула РНК не имеет заданной специфггческой последовательности мононуклеотидов, но содержит 3 —>5 фосфодиэфирные связи, легко разрываемые рибонуклеазой. Относительно биолопгческой роли этого фермента у бактерий предполагают, что он катализирует, скорее всего, обратную реакцию —расщепление мРНК с образованием нуклеозиддифосфатов. [c.495]

Эта реакция была использована для успешного избирательного расщепления ш ,сти тирозилпептидных связей в рибонуклеазе (Коэн и Вильсон, 1961). [c.740]

Другой окислитель, бромциан, — более надежный реагент [26] Он разрушает пептидные связи, в которых участвует остаток метио нина. Механизм этой реакции подобен расщеплению иодацетами дом [45]. Окисление бромцианом широко применяют как специ фичный метод для получения крупных пептидных фрагментов Весьма успешно он был использован наряду с другими методами при расшифровке аминокислотной последовательности рибонуклеазы [27], миоглобина [17], трипсиногена [36] и альдолазы [42, 68,69]. [c.37]

Неоспоримое преимущество этого метода по сравнению с классическими методами синтеза пептидов состоит в том, что ни на одной из стадий он не требует выделения растущей полипептидной цепи. В силу чрезвычайно низкой растворимости аддукт пептида и полимера легко отмывается после каждой реакции от побочных продуктов, растворителей и избытка реагентов без потери пептида, после чего аддукт готов к следующей реакции- В настоящее время метод автоматизирован, и запрограммированные аминокислотные синтезаторы без труда могут присоединить шесть аминокислот к растущей полипептидной цепи за 24 ч. Эти приборы добавляют реактивы в падлен<ащей последовательности, меняют условия реакций, обеспечивают необходимое время реакции, отмывают побочные продукты, после чего начинают всю операцию сначала. При помощи метода ТФСП были синтезированы инсулин и фермент рибонуклеаза, состоящий нз 124 аминокислот. [c.406]

Однако вполне возможно, что читатель, мало знакомый с энзимологией, захочет сперва прочесть по крайней мере разделы, посвященные хи-мотрипсину (разд. Г,1), карбоксипептидазе (разд. Г,4), рибонуклеазе (разд Д,2), реакциям множественного замещения (разд. Е), иминам (разд. 3, 3), реакциям присоединения к связям С—С (разд. 3,5), реакциям р-отщепления и конденсации (разд. К). [c.91]

Уникальные свойства аденилатциклазы [85] и родственной ей гуанил-атциклазы [86] уже рассматривались в предыдущих главах (гл. 5, разд. В,5 гл. 6, разд. Е,5). С кинетической точки зрения молекула циклического АМР исключительно стабильна, однако с точки зрения термодинамики (в отношении возможности гидролиза этого соединения) она нестабильна. Специфическая фосфодиэстераза катализирует расщепление сАМР с образованием 5 -адениловой кислоты [АМР стадия б в уравнении (7-25)]. Две последовательные реакции в уравнении (7-25) обеспечивают образование и разрушение сАМР. Следует обратить внимание на сходство этой последовательности реакций с двумя стадиями реакции (7-19), катализируемой рибонуклеазой. [c.131]

Тактика минимальной защиты эффектно продемонстрирована Хирш-маиом при полном синтезе S-белка рибонуклеазы А. Пептидная цепь из 103 аминокислот содержит все трифункциональные аминокислоты, исключая триптофан, в которых были защищены только -амиио- и тиольные группы. Вследствие частичной защиты синтез фрагментов и последующая их конденсация (сборка) могли быть проведены лишь немногими методами (с применеииём НКА и НТА, N-гидроксисукцииимидиых эфиров и азидным методом). Само собой разумеется, что опасность побочных реакций при минимальной защите велика, поэтому фрагменты после их синтеза должны быть очень тщательно очищены. Деблокирование защитных функций обычно протекает без осложнений. [c.221]

Естественно, что полной обратимости денатурации следует ожидать для белков, не содержащих групп, вступающих в денатурированном состоянии в необратимые реакции (например, окисление 5 — Н-групп) [101]). Так, доказана обратимость денатурации рибонуклеазы [135], такаамилазы А [136] и а-амилазы [136]. В работах Анфинсена и др. [137—140] показано, что можно добиться ренатурации белков и с разорванными дисульфидными связями. Из этих данных следует, что денатурацию действительно можно трактовать как термодинамический конформационный переход и что нативная структура белка отвечает если не глобальному, то относительному минимуму свободной энергии. [c.249]

Ферменты, как правило, работают в определенном диапазоне pH и. чарактери-зуются некоторым оптимальным значением pH, при котором при прочих равных условиях скорость реакции имеет наибольшее значение. Причины такого характера зависимости можно пояснить на примере кинетики гидролиза цитидин-2, 3 -фосфата, катализируемого панкреатической рибонуклеазой. Как следует из рис. 60, изображающего активный центр фермента на второй стадии реакции расщепления РНК, каталитически активной является форма фермента, у которой остаток имидазола, принадлежащий Н1з-12, протонирован и способен подать протон на атом 2 -0 циклофосфааного фрагмента, а остаток имидазола, принадлежащий Н18-119, не протонирован и способен принять протон у атакующей 212 [c.212]

Ковалентные комплексы чрезвычайно важны с точки зрения химии, но с точки зрения энзимологии они не столь интересны. Наиболее ферментоподобными являются нековалентные комплексы, как, например, комплексы, образуемые циклоамилозой. Пиклоамилозы и их производные прекрасно моделируют такие ферменты, как химотрипсин, рибонуклеазу, трансаминазу [27] и карбоангидразу [28]. Высокие каталитические свойства проявляют полимерные комплексы. Показано, что скорости реакций в обращенных мицеллах приближаются к ферментативным [25]. Очевидно, что катализ, движущей силой которого выступает комплексообразование, будет интенсивно исследоваться в ближайшие годы. [c.341]

Значительно более сложная ситуация возникает при синтезе соединений с несколькими дисульфидными связями. Например, если в пептиде содержится 6 остатков цистеина <3 дисульфидных связи, как в рибонуклеазе А), то формально возможно образование 105 структурных изомеров с разными дисульфидными связями. В этом случае направление и полнота реакции обычно определяются специфической укладкой пептидной цепи, что позволяет проводить самопроизвольное окислительное замыкание нужных дисульфидных связей. Естественно, здесь требуется тщательный подбор условий окислитель, концентрация, pH среды, температура, причем даже в оптимальных условиях выход целевого продукта невысок и не исключается образование пббочных соединений. [c.154]

Ферментативный синтез олигорибонуклеотидов. Как правило, для синтеза сравнительно коротких фрагментов — ди- и тетранук-леотидов использукэт реакцию, катализируемую рибонуклеазами [c.367]

Основные яды и их характеристика. Из примерно 1200 видов скорпионов около 20 имеют опасные для человека яды. Нативные яды представляют собой бесцветную слегка опалесцирующую жидкость кислой реакции легко растворяются в воде, водном растворе глицерина, не растворяются в этаноле, хлороформе, ацетоне, бензине. Разрушаются крепкими кислотами, щелочами, а также хлором, марганцовокислым калием, иодом. Выдерживают кратковременное нагревание до 100 °С. По силе токсического действия они в среднем в 1000 раз превышают цианид калия. В яде обнаружены углеводы, биогенные амины, гистамин, некоторые полиамины — спермидин, следы путресцина и спермина. Особый интерес представляют белковые фракции яда, содержащие токсические полипептиды и ферменты к числу последних относятся фосфолипазы А и В, ацетилхолинэстераза, кислая фосфатаза, нуклеотидаза, фосфодиэстераза, гиа-луронидаза, рибонуклеаза. Активность токсичных полипептидов может в несколько раз превосходить токсичность целого яда. Токсичность яда зависит от способа его получения. Так, яд, полученный при механическом раздражении тельсона, в два раза более токсичен, чем полученный при электрической стимуляции. [c.730]

Эту методику применяли для разделения аминокислот и пептидов, образующихся при действии проназы на нативную и модифицированную (путем окисления, динитрофенилирования и окисления-Ьдинитрофенилирование) рибонуклеазу [21]. В первом варианте 2,4-динитроанилин вымывался вблизи ДНФ-ала-нина. Когда же в смеситель 1 вместо к-гептана вводили смесь толуол—к-гептан, 2,4-динитроанилин начинал элюироваться в меньшем объеме, а положение остальных пиков осталось прежним. Можно было, конечно, предварительно экстрагировать его диэтиловым эфиром при pH 8. Однако все эти предосторожности излишни, поскольку реагент и побочные продукты реакции вымываются раньше ДНФ-аминокислот. [c.371]

Фиг. 24. Разделение продуктов реакции трннатрийтиофосфата (160 мкмоль) с рибонуклеазой (2 мкмоль) [22].

Гель-хроматографию особенно целесообразно применять в тех случаях, когда необходимо очень быстро отделить высокомолекулярные компоненты от низкомолекулярных. На специально подготовленной колонке (3X6 сл) с сефадексом 0-25 (грубым) Эрлан-деру [25] удалось всего за 2 мин полностью отделить рибонуклеазу от воды, содержащей тритий. Этот быстрый аналитический метод позволяет изучить кинетику обмена трития и на этом основании сделать выводы о степени спирализации растворенного белка. Несколько позднее аналогичная методика была успешно использована при исследовании вторичной структуры растворимых рибонуклеиновых кислот [26] и дезоксирибонуклеиновых кислот [27]. Конечно, нуклеиновые кислоты также могут быть модифицированы химическим путем, например действием диазотированной сульфаниловой кислоты [28]. Избыток реагента и побочные продукты реакции удаляют на сефадексе 0-50. [c.146]

В ходе того же эксперимента было получено еще одно доказательство точности свертывания рибонуклеазы при ее ренатурации. Оказалось, что восемь остатков цистеина, образ овавщихся в реакции восстановления остатков цистина в полностью развернутой рибонуклеазе, постепенно окисляются под действием атмосферного кислорода, в результате чего образуются четыре внутрицепочечные дисульфидные связи точно в тех же положениях, что и в исходной нативной рибонуклеазе. Это замечательное явление. Случайная комбинация восьми остатков цистеина с образованием остатков цистина теоретически может дать 105 различных вариантов, однако в ходе ренатурации реализуется один-единственный специфический набор дисульфидных поперечных связей, характерный для нативной рибонуклеазы (рис. 8-8). Таким образом, полипептидная цепь денатурированной рибонуклеазы свертывается очень точно, что и приводит к формированию уникальной биологически активной конформации, исключая образование какой бы то ни было неправильной конформации. Этот классический эксперимент, выполненный Кристианом Анфинсеном в 50-х годах, доказал, что аминокислотная последовательность полипептидной цепи содержит всю информацию, необходимую для того, чтобы цепь свернулась в нативную трехмерную структуру. [c.197]

Смотреть страницы где упоминается термин Рибонуклеаза реакции: [c.922] [c.687] [c.167] [c.126] [c.146] [c.215] [c.191] [c.142] [c.222] [c.329] [c.302] [c.361] [c.129] [c.214] [c.215] [c.323] [c.95] [c.564] [c.405] [c.344] [c.359] [c.360]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология