Рибонуклеаза активный центр

Рибонуклеаза по модели, описанной Картой и полученной с разрешением 0,2 нм в результате синтеза Фурье для семи различных производных с тяжелыми атомами (7294 измерения), представляет собой молекулу почкообразной формы размером 3,8 X 2,8 X 2,2 нм. Активный центр фермента находится в почечной борозде — характерной щели, разделяющей молекулу иа две половины и содержащей ответственные за каталитическую активность остатки гистидина (положения 12 и 119) и лизина (положения 41 и 7). [c.402]

Предполагают, что формирование активного центра фермента начинается уже на ранних этапах синтеза белка-фермента (см. главу 14) на рибосоме, когда линейная одномерная структура пептидной цепи превращается в трехмерное тело строго определенной конфигурации. Образовавшийся белок приобретает информацию совершенно нового типа, а именно функциональную (в частности, каталитическую). Любые воздействия, приводящие к денатурации, т.е. нарушению третичной структуры, приводят к искажению или разрушению структуры активного центра и соответственно потере ферментом каталитических свойств. Если при подходящих внешних условиях удается восстановить нативную трехмерную структуру белка-фермента (ренатурировать его), то восстанавливается и его каталитическая активность. Это было показано впервые на примере рибонуклеазы поджелудочной железы (см. рис. 1.13). [c.125]

Наличие предуготовленной для субстрата полости обнаружено рентгенографически и у других ферментов. Активный центр рибонуклеазы, расположенный в этой полости, содержит основные остатки Лиз и Арг, взаимодействующие с фосфатными группами РНК (рибонуклеаза катализирует гидролитическое расщепление РНК). Каталитический участок в той же полости образован двумя остатками Гис, осуществляющими основный катализ [89, 90]. Аналогичная полость обнаружена в папаине, активными остатками которого являются Цис 25 и Гис 159 [91]. [c.392]

Рис. 59. Схема, активного центра рибонуклеазы в форме, благоприятствующей протеканию первой стадии реакции

Все эти особенности получают свое объяснение при рассмотрении активного центра рибонуклеазы, схема которого приведена на рис. 59. Видно, что реакционная часть молекулы, включающая остаток фосфорной кислоты и 2 -гидроксигруппу рибозы, располагается вблизи двух имидазольных колец остатков гистидина, Н1з-12 и Н1б-119 (номера показывают положение соответствующих остатков в полипептидной цепи фермента). Поскольку р/ имидазольных колец незначительно отличаются от 7, протонированная и непротонированная формы обоих колец присутствуют в соизмеримых количествах, т.е. в популяции молекул [c.202]

Таким образом, установленные экспериментально структура активного центра и схема расположения 6 нем аналога субстрата логично объясняют все характерные особенности действия панкреатической рибонуклеазы. [c.203]

В случае карбоксипептидазы А аминокислотные остатки апофермента, как и в случае рибонуклеазы, обеспечивают отбор и нужную ориентацию субстрата относительно активного центра. Кроме того, специальные остатки аминокислот участвуют в связывании кофактора — иона цинка. [c.207]

На рис. 5.1 представлен активный центр рибонуклеазы — фермента, гидролизующего РНК, которая состоит из множества мононуклеотидов. В каталитическом центре находятся два остатка гистидина Гис 12 и Гис 119. Оба эти гистидина участвуют в процессе катализа, причем Гис 12 образует комплекс [c.64]

Очевидно, что такая информация может представлять большую ценность при детальном изучении связывания субстратов и ингибиторов с активным центром фермента. К сожалению, этот подход неприменим для другого наиболее изученного фермента — рибонуклеазы (см. разд. 14.2.3), поскольку этот белок не содержит триптофана. [c.359]

В настоящее время установлено, что специфичность и каталитические свойства многих ферментов обусловлены наличием в молекуле фермента определенных активных центров или активных участков полипептидной цепочки. В ряде случаев установлен характер и порядок чередования остатков аминокислот в этих функционально наиболее важных участках. Так, особенно важную роль играет фрагмент полипептидной цепи, имеющий строение аспарагиновая или глютаминовая кислота —серин — глицин или аланин (холинэстераза, трипсин, тромбин и др.). От некоторых ферментов оказалось возможным отщепить часть молекулы без существенного снижения их каталитической активности. К числу таких ферментов принадлежат, например рибонуклеаза и ряд протеолитических ферментов. [c.124]

Таким образом, происходящая реакция сводится к образованию промежуточного ацилфермента, а затем к переносу ациль-ного остатка к молекуле воды, если протекает гидролиз, или к иному акцептору ацетильной группы. Серии, конечно, содержится в активном центре не всех ферментов. Так, например, у рибонуклеазы его нет, и в этом ферменте, как предполагается, два остатка гистидина выполняют функцию акцептора и донора протонов. Серии и гистидин, несомненно, являются не единственными остатками, необходимыми для работы активного центра. Имеются факты, говорящие об участии триптофана в активных центрах химотрипсина, трипсина, лизоцима, однако об этом пока еще известно мало. [c.84]

Рассуждения Анфинсена касались рибонуклеазы. Вопрос об универсальности его представлений пока открыт, но, по-видимому, активные центры ферментов могут формироваться на высшем уровне , т. е. тогда, когда ход эволюции уже привел к значительному развитию структур высшего порядка. Постепенное развитие полипептидных систем привело к формированию активного центра, скомпонованного из различных фрагментов изогнутой полипептидной цепи (или цепей), и рождение этого центра положило начало процессам гидролиза, вероятно, ограничившим процесс наращивания цепей. [c.161]

Последовательность аминокислот в ферменте фактически расшифрована [П2—П51. Дальнейшее исследование позволило предположить, что остатки № П9 (гистидин), 121 (аспарагиновая кислота), 15 (аспарагин) и 41 (лизин)—все находятся в активном центре или близко от него [116]. Искусственно вызванная микрогетерогенность рибонуклеазы может быть следствием различий скорее во вторичной и третичной структуре, чем в первичной последовательности аминокислот [117]. [c.380]

При помощи блокирования функциональных групп рибонуклеазы и других методов было установлено, что в этом ферменте только один (в положении 41) из десяти остатков лизина принимает непосредственное участие в ферментативном катализе. Точно так же только один из 4 остатков (в положении 119) гистидина принимает участие в активном центре. Для активности фермента требуется также наличие свободных карбоксильных групп, так как при эстерификации последних фермент инактивируется. Отрезок из 20 остатков аминокислот на КШг-конце пептидной цепи необходим для функции рибонуклеазы, а отрезок пептидной цепи между 31 и 41 остатками отвечает за присоединение субстрата. [c.213]

Рибонуклеаза представляет собой пример фермента с высокими требованиями к структуре активного центра. Должны находиться в соседстве некоторые аминокислоты из различных участков цепи, и вся молекула рибонуклеазы должна иметь присущую ей конформацию. [c.215]

В данном разделе речь будет идти о таких ферментативных реакциях, в которых участвуют ферменты, не имеющие в активных центрах ионов металлов, и для которых достаточно точно установлен механизм нуклеофильного замещения у тетраэдрического атома фосфора в молекуле субстрата. В подобных случаях электрофильная атака в пуш-пульном механизме нуклеофильного замещения у фосфора обеспечивается за счет образования водородной связи между нуклеофильным центром реагирующей части молекулы фосфорсодержащего соединения и кислотной группой активного центра фермента. В качестве примера рассмотрим недавно опубликованные работы, посвященные механизму действия рибонуклеазы поджелудочной железы быка ниже будут обсуждены некоторые вопросы, связанные с фосфорилированием и дефосфорилированием активных центров эстераз. [c.577]

Уделив внимание некоторым механизмам гидролиза, интересно сравнить их с механизмом реакции, происходящей в активном центре некоторых ферментов, катализирующих подобные превращения. Фермент бычья панкреатическая рибонуклеаза А (РНаза А) (М = 13 680, одна полипептидная цепь, состоящая из 124 аминокислотных остатков) катализирует деградацию РНК по двустадийному механизму [c.126]

Данные, полученные с помощью различных методов исследования, указывают на участие по крайней мере трех аминокислот в построении активного центра рибонуклеазы двух остатков гистидина и одного остатка лизина. Гидролиз РНК (рис. 3.6) проходит в два этапа переэтерификация и последующий гидролиз. Отметим, что при физиологических значениях pH одно из двух имидазольных колец протонировано, а второе —нет. Имидазоль-ные кольца функционируют как общеосновной — общекислотный катализатор, а положительно заряженный остаток лизина, вероятно, стабилизирует пентакоординационный интермедиат. [c.128]

Методы белкового синтеза развиты в настоящее время в такой степени, что ферменты, молекулы которых имеют небольшие размеры, могут быть синтезированы в лабораторных условиях. Это дает возможность создавать новые модифицированные ферменты и критически анализировать роль различных групп активного центра. Так, например, установлено, что построенный из 70 аминокислотных остатков синтетический пептид, аналогичный рибонуклеазе 5, но несущий ряд делеций и, совершенно не содержащий дисульфидных связей, все же сохраняет заметную каталитинескую активность [61]. [c.121]

Сказанное можно пояснить на примере фермента, активный центр и механизм действия которого достаточно хорошо изучены и который будет ниже детально рассматриваться, — панкреатической рибонуклеазы. Этот фермент катализирует двустаДийный гидролиз фосфодиэфирных связей в РИК, сходный в общих чертах со щелочным гидролизом этих связей. На первой стадии происходит внутримолекулярная атака атома Р на 2 -011-группу примыкающего со стороиы 3 -кислородного атома остатка рибозы с образованием циклического 2, 3 -<1)осфата и разрывом межнуклеотидноП связи. Во второй стадии происходит гидролиз пятичленного фосфодиэфирного цикла. На примере одного из простейших субстратов рибонуклеазы — уридили.п(3 — 5 )аденозина — процесс можно записать в виде [c.200]

Ферменты, как правило, работают в определенном диапазоне pH и. чарактери-зуются некоторым оптимальным значением pH, при котором при прочих равных условиях скорость реакции имеет наибольшее значение. Причины такого характера зависимости можно пояснить на примере кинетики гидролиза цитидин-2, 3 -фосфата, катализируемого панкреатической рибонуклеазой. Как следует из рис. 60, изображающего активный центр фермента на второй стадии реакции расщепления РНК, каталитически активной является форма фермента, у которой остаток имидазола, принадлежащий Н1з-12, протонирован и способен подать протон на атом 2 -0 циклофосфааного фрагмента, а остаток имидазола, принадлежащий Н18-119, не протонирован и способен принять протон у атакующей 212 [c.212]

Рис. 99. Строение рибонуклеазы S. Показано язннморасположение His-12 His-119 и Lys 41 в активном центре.

Как известно, функция рибонуклеазы состоит в гидролитическом ра сщеплеиии рибонуклеиновых кислот и олигонуклеотидов. Как мы видели, это один из первых белков, изучавшихся с помощью ЯМР, хотя спектры, полученные на ранних стадиях, не обнаруживали характерных деталей. Рибонуклеаза близка по размеру (молекуляр ная масса 13700, 124 аминокислотных остатка) и форме к лизоциму и является удобным объектом для изучения методом ЯМР. В ее молекуле имеются 4 дисульфидных мостика, 18 остатков основных аминокислот (10 Лиз, 4 Арг и 4 Гис) и только 10 остатков кислых аминокислот (5 Глу и 5 Асп). Таким образом, в растворе при нейтральных pH молекула заряжена положительно. По сравнению с лизоцимом она содержит несколько меньше а-спиральных структур и больше р-структур (остатки 42—49, 71—92 и 94—ПО). В дополнение к 4 Гис имеются также 6 Тир и 3 Фен, но нет остатков триптофана. Полная трехмерная структура рибонуклеазы известна из рентгеноструктурных исследований, проведенных двумя группами авторов [37, 38, 38а]. Форма ее глобулы близка к сферической имеется большая щель, в которой происходит связывание субстрата. С одной стороны этой щели расположены в непосредственной близости друг от друга остатки Гис-12, Гис-119 и Лиз-7, а с другой стороны находится Лиз-41. По данным подробных химических исследований все эти четыре остатка входят в активный центр. [c.363]

Четыре остатка Гис рибонуклеазы были оттитрованы и отнесены по отдельности. Мы видели, что два из них (Гис-12 и Гис-119) входят в активный центр. Брэдбери и Шерага [6] первые показали (на 60 МГц), что протоны при С-2 гистидиновых остатков этого белка дают раздельные сигналы и можно провести титрование имидазольных колец так, как это описано в разд. 13.2 для свободного гистидина и в разд. 14.2.3 для единственного остатка гистидина в лизоциме. Жардетский и сотр. расширили эти наблюдения [21, 39—42]. Ароматическая область спектра (100 МГц) раствора рибонуклеазы в ОгО с дейтероацетатным буфером при четырех значениях pH, соответствующих величинам р/< гистидиновых имидазольных колец, приведена на рис. 14.9. Протоны при С-2 дают четыре раздельных пика слева от основного спектра при pH=4,95 [c.365]

Мы уже видели, что связывание субстратов и ингибиторов с лизоцимом и рибонуклеазой изменяет резонансные сигналы пептидных групп ароматических аминокислот, расположенных вблизи места связывания (см. разд. 14.2.2 и 14.2.3). Особенно важна информация, полученная при изучении резонансных сигналов от гистидиновых и триптофановых остатков лизоцима. Мы теперь рассмотрим прямые наблюдения резонансных сигналов малых молекул. Можно обнаружить изменения химических сдвигов и ширины линий для многих систем. Для определения положения активного центра эти наблюдения, по меньшей мере, столь же полезны, как и изучение резонансных оигналов протонов аминокислотных остатков белка. Однако, поскольку основное внимание в этой книге сосредоточено главным образом яа самих полимерах, наше обсуждение этого аспекта исследований белков с помощью ЯМР будет относительно кратким. [c.387]

После успешной расшифровки строения рибонуклеазы К. Хнр-сом, У. Штейном и С. Муром [76] и Р. Редфилдом и К. Анфин-сеном [77] в 1956 г. впервые появилась возможность создания полной модели фермента, активные центры которого образованы фрагментами нолипептидной цепи. [c.177]

Следующим примером является одностадийное выделение пептидов, несущих аффинную метку, из активного центра нук-леазы стафилококка и панкреатической рибонуклеазы [49]. [c.416]

За последние годы достигнуты определенные успехи в изучении молекулярного механизма действия ферментов, участвующих в переносе фосфорильной группы. Так, в результате исследования строения активного центра рибонуклеазы поджелудочной железы быка было показано, что в состав активного центра этого фермента входят две имидазольные группы, одна из к-рых находится в виде основания, а другая — протонирована. Предполагается, что первое имидазольное кольцо участвует в образованш водородной связи с молекулой воды или оксигруииой спирта, в то время как вторая имидазольная группа, находящаяся в протонированном состоянии, образует водородную связь с эфирным кислородом. [c.254]

Полученные результаты позволили сделать определенные выводы о трех группировках активного центра, значения р/С для которых составляли 5, 6 и 6, 7. На основании зависимости этих величин от температуры был сделан вывод, что наименьшее значение р/С относится к карбоксильной группе (слабая температурная зависимость), а наибольшее — к имидазольной группировке (сильная температурная зависимость). Природа группировки с промежуточным значением р/С, равным 6, оставалась (и остается до сих пор) неясной. Сама величина р/С 6 может быть отнесена к имидазолу, но вместе с тем она не зависит от температуры, что характерно для карбоксила. Авторы предполагают, что это имидазол с аномальной величиной АН ионизации, однако признают, что для окончательного доказательства этого предположения, нужны дополнительные данные. В этой работе были установлены детали механизма действия рибонуклеазы, в том числе обнаружены реакции изомеризации свободного фермента и комплекса фермент—продукт. Тшатель-ность кинетического анализа, проведенного в этой работе, позволяет отнестись с доверием к предложенному авторами химическому механизму действия рибонуклеазы, хотя не вполне ясно, действительно ли все обнаруженные реакции изомеризации входят в последовательность каталитических реакций. [c.218]

Имеются ли наблюдения, указывающие на существование водородных связей типа -Н в реальных биологических системах Такие водородные связи были обнаружены методом ядерного магнитного резонанса между остатками гистидина в активном центре фермента — панкреатической рибонуклеазе [249]. В дальнейшем ЯМР-методом было показано, что в полу-протонированном гистидине в водном растворе при этих условиях проявляется характерный стэкинг -эффект [250] (стопкообразная упаковка. — Прим. ред.). Последний может быть обусловлен взаимодействием между связями -М. Олдридж и Розе [251] на основании большого числа экспериментальных работ рассматривали водородные связи между имидазольными группами гистидиноБЫх- остатков белков в мембранах митохондрий. [c.304]

Рибонуклеаза и папаин являются примерами простых ферментов, построенных исключительно из аминокислот в виде единой пептидной цепи. Однако большинство ферментов имеет простетические группы или показывает зависимость активности от наличия ионов металлов. По-видимому про-стетнческая группа в форме кофермента или металла или обоих вместе принимает участие в образовании активного центра. Выяснение структуры активного центра сложных ферментов представляет собой нелегкую задачу, и мы рассмотрим пример строения активного центра алкогольдеги-дрогеназы из дрожжей. [c.215]

Имидазольная группировка входит в активные центры таких ферментов, как холинэстераза, рибонуклеаза, трипсин, хи-мотрипсин и др. Особенной способностью к присоединениям обладает атом N3 имидазольной группировки, что приводит к ее ацилированию и фосфорилированию с образованием неустойчивых Ы-ацил- и Ы-фосфорилпроизводных в качестве промежуточных веществ при ферментативных превращениях. Однако несомненно, что строение активного центра в целом непосредственно связано с вторичной и третичной структурой бел- [c.217]

В результате исследования 1370—3731 строения активного центра рибонуклеазы (РНК-азы) поджелудочной железы быка было показано, что в состав активного центра этого фермента входят две имидазольные группы, одна из которых протонирована, а другая находится в виде основания. Авторы предположили следующую схему строения и механизма действия активного центра РНК-азы [374, 375]. На рис. 26, А (стр. 578) показано строение фермент-суб-стратного комплекса. Одно имидазольное кольцо (I) участвует в образовании водородной связи с молекулой воды или с оксигруп-пой замещенного спирта (общеосновной катализ). Другое имидазольное кольцо (И), находящееся в протонированном состоянии, образует водородную связь с эфирным кислородом. Участок (П1) соответствует области дополнительных связей между ферментом и молекулой нуклеофильного реагента. Специфичной является область (IV), где происходит взаимодействие между ферментом и пиримидиновым кольцом, по-видимому, с участием атома азота [376]. Таким образом, в переходном состоянии (см. рис. 26, Б), по-существу, имеет место пуш-пульный механизм, когда нуклеофильная атака на атом фосфюра кислородом активированной оксигруппы нуклеофильного реагента сопряжена с образованием водородной связи между кислородом отходящей группировки и кислотной группой фермента. На рис. 26, В показан комплекс фермент продукты. Если подходящим нуклеофильным реагентом является оксигруппа рибозы полинуклеотидной цепи РНК, то в результате реакции происходит удлинение цепи на одно звено (см. рис. 26 Г,). [c.577]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология