Рибонуклеаза аминокислотная последовательность

Последовательность аминокислотных остатков — один из важных факторов, определяющих специфические функции белка в организме. Определение последовательности а-аминокислот в молекуле белка является весьма сложной задачей. В настоящее время известно строение немногих белков. Впервые аминокислотная последовательность была определена в инсулине и рибонуклеазе. [c.288]

Бычья панкреатическая рибонуклеаза, как было рассмотрено выше (разд. 7.3.1), гидролизует РНК ее аминокислотная последовательность приведена на рис. 9.7. Еще до установления трехмерной структуры фермента, когда была известна только его аминокислотная последовательность, серия интересных исследований позволила получить значительную информацию об активном центре и механизме действия рибонуклеазы. [c.306]

В настоящее время полностью расшифрована аминокислотная последовательность панкреатической рибонуклеазы (она состоит из 124 аминокислотных остатков). Субтилизин гидролизует пептидную связь между 20-м и 21-м аминокислотными остатками рибонуклеазы. Полученный пептид, состоящий из 20 аминокислотных остатков, способен обратимо отделяться от оставшейся части молекулы фермента. Удаление пептида сопровождается утратой активности, а его воссоединение с молекулой — за счет нековалентных связей — приводит к полному восстановлению активности фермента. Далее восстановление четырех дисульфидных связей молекулы рибонуклеазы вызывает полное разворачивание полипептидной цепи фермента. Когда при окислении кислородом дисульфидные связи снова образуются, происходит почти полное восстановление активности фермента. Таким образом, характер складывания полипептидной цепи должен опреде- [c.108]

Рис. 6- З.А. Аминокислотная последовательность адренокортикотропного гормона гипофиза (39 остатков). Б. Аминокислотная последовательность рибонуклеазы из поджелудочной железы быка (124 остатка). В. Схематическое изображение молекулы рибонуклеазы, показывающее расположение четырех дисульфидных поперечных связей, образованных остатками цистина.

НО возвращаться к нативному состоянию, приобретая присущую ей правильную трехмерную третичную структуру с полным восстановлением каталитической активности (рис. 8-8). Этот эксперимент доказывает, что информация, необходимая для правильного свертывания полипептидной цепи рибонуклеазы, заложена в первичной структуре полипептидной цепи, т.е. в ее аминокислотной последовательности. [c.197]

Эксперименты показали, что после восстановления нативной рибонуклеазы, взятой в концентрации менее 0,1%, и последую щего ее окисления около 70% окисленного материала оказы-вается растворимым и активность этой растворимой фракции составляет от 80 до 100% активности нативного фермента. Осадок состоит, вероятно, из молекул, соединенных межмолекулярными связями. Окисление в присутствии мочевины не приводит к появлению активного продукта. Эти факты свидетельствуют о том, что характер свертывания молекулы белка предопределен ее аминокислотной последовательностью. Действительно, из 105 вариантов образования дисульфидных связей осуществляется только тот, при котором молекула обладает ферментативной активностью (не исключено все же, что имеется несколько активных модификаций рибонуклеазы). [c.279]

Рис. 35. Аминокислотная последовательность (первичная структура) (а) и третичная структура (б) рибонуклеазы.

Для рибонуклеазы приведено значение молекулярного веса, вычисленное из ее аминокислотной последовательности. [c.423]

Рибонуклеаза поджелудочной железы . Наиболее важным достижением последних лет является определение полной аминокислотной последовательности рибонуклеазы, выполненное Хирсом, Муром и Штейном Панкреатическая рибонуклеаза — фермент, выделяемый из поджелудочной железы животных организмов. Она расщепляет фосфо-диэфирные связи рибонуклеиновых кислот [c.179]

Для большинства кристаллических ферментов установлен аминокислотный состав и определены концевые аминокислоты, а для наиболее изученных ферментов (рибонуклеазы, химотрипсина, трипсина, папаина, цитохрома с, лизоцима и др.) полностью или почти полностью установлена аминокислотная последовательность в пептидных цепях. [c.195]

Вопрос о структурной организации молекул глобулярных белков был одним из наиболее дискутируемых в 1950-е годы. Подавляющее большинство исследователей было единодушно в своем положительном отношении к а-спиральной концепции Полинга и Кори. Выше отмечалось, что в это время для инсулина одновременно несколькими авторами были предложены совершенно различные, но практически полностью а-спиральные структуры. Даже для рибонуклеазы считалось, что регулярное свертывание боковой цепи в нативной конформации нарушается лишь в местах включения в аминокислотную последовательность остатков пролина (предполагалось, что только из-за невозможности образования водородной связи 5—>1) и цистеина. [c.44]

К середине 1940-х годов пептидная теория белков Фишера и Вальд-шмидт-Лейтца была почти повсеместно принята. Встал вопрос о точном знании деталей химического строения, т.е. о конкретном порядке расположения аминокислот в белковых цепях. Впервые такое сложное исследование удалось провести в течение десятилетия (1945-1954 гг.) ф. Сенгеру, определившему аминокислотную последовательность инсулина. Вторым белком была рибонуклеаза А. Полная структура этого фермента расшифрована С. Муром, К. Хирсом и У. Стейном (1960 г.). Вскоре идентификация химичекого строения белков стала производиться с помощью автоматических секвенаторов и приобрела рутинный характер. Однако достижения в решении первой фундаментальной задачи проблемы белка не принесли удовлетворения. Сначала не вызывало сомнений, что химические и физические свойства белков получат свое объяснение, как только станет известно химическое строение их молекул. Однако основанная на опыте всей органической химии и биохимии надежда на то, что установление химического типа и строения молекул окажется достаточным для понимания хотя бы в общих чертах их специфического функционирования, не оправдалась. Тем самым определение структуры из конечной цели исследования превратилось в необходимый для последующего изучения белков начальный этап. Утвердилась мысль, что химическая универсальность и практически необозримое многообразие свойств соединений этого класса при строгой специфичности его отдельных представителей связаны с особенностями пространственных структур белковых молекул. [c.67]

Свертывание может происходить значительно быстрее, чем синтез цепи. Свертывание in vitro осуществляется чрезвычайно быстро, по крайней мере для малых белков, не содержащих дисульфидных мостиков. Нуклеаза стафилококка повторно свертывается в течение 1 с [438], а метмиоглобин — в течение 10 с [439]. Если эти величины применимы также и к условиям in vivo, свертывание цепи может происходить по крайней мере в 10 раз быстрее, чем биосинтез аминокислотной последовательности. Дисульфидсодержащие белки, например панкреатическая рибонуклеаза, повторно свертываются за время от 1 до 10 с, если дисульфидные связи не были разорваны в процессе предшеств ющей денатурации [440]. Однако если такие белки развернуты и восстановлены, последующее свертывание цепи (которое включает образование правильной системы дн-сульфидных связей) продолжается при оптимальных условиях в течение многих минут. [c.182]

Рибонуклеаза Ti открыта гораздо позднее, чем РНаза А. Известна ее аминокислотная последовательность, но полная кристал- [c.143]

Другой окислитель, бромциан, — более надежный реагент [26] Он разрушает пептидные связи, в которых участвует остаток метио нина. Механизм этой реакции подобен расщеплению иодацетами дом [45]. Окисление бромцианом широко применяют как специ фичный метод для получения крупных пептидных фрагментов Весьма успешно он был использован наряду с другими методами при расшифровке аминокислотной последовательности рибонуклеазы [27], миоглобина [17], трипсиногена [36] и альдолазы [42, 68,69]. [c.37]

Определение аминокислотной последовательности — задача очень трудоемкая. Однако ее можно было бы значительно облегчить, если бы удалось выработать приемы для фрагментации длинных пептидных цепей на относительно небольшие пептиды, содержащие от 10 до 15 аминокислотных остатков, и на другой ряд более длинных пептидов, с тем чтобы можно было установить места перекрывания небольших пептидов. Такая идеальная возможность редко встречается. Практически проблема решалась несколькими путями. История изучения инсулина, рибонуклеазы и гемоглобина отражает три различных подхода. В первых исследованиях, проведенных на инсулине, изучали частичные кислотные гидролизаты динитрофепилированных пептидов (см. гл. 6), а ферменты были использованы на второй стадии работы для получения более крупных пептидов. Быстрое установление структуры рибонуклеазы оказалось возможным благодаря усовершенствованию анализа аминокислот. Аминокислотный состав пептидов, полученных [c.113]

Вслед за первыми работами Сэнгера в последние годы удалось расшифровать первичную структуру многих полипептидов и белков. После определения аминокислотной последовательности инсулина были расшифрованы последовательности рибонуклеазы, полипептида из вируса табачной мозаики, нескольких препаратов цитохрома с, различных цепей гемоглобина, ингибитора трипсина, химо-трипсиногена и химотрипсина, трипсина, глицеральдегидфосфат-дегидрогеназы и т. д. Вместе с последовательностями некоторых пептидных гормонов эти данные вошли в Атлас структуры и аминокислотной последовательности белков , который впервые был опубликован в 1966 г. и затем неоднократно переиздавался [c.40]

В ходе того же эксперимента было получено еще одно доказательство точности свертывания рибонуклеазы при ее ренатурации. Оказалось, что восемь остатков цистеина, образ овавщихся в реакции восстановления остатков цистина в полностью развернутой рибонуклеазе, постепенно окисляются под действием атмосферного кислорода, в результате чего образуются четыре внутрицепочечные дисульфидные связи точно в тех же положениях, что и в исходной нативной рибонуклеазе. Это замечательное явление. Случайная комбинация восьми остатков цистеина с образованием остатков цистина теоретически может дать 105 различных вариантов, однако в ходе ренатурации реализуется один-единственный специфический набор дисульфидных поперечных связей, характерный для нативной рибонуклеазы (рис. 8-8). Таким образом, полипептидная цепь денатурированной рибонуклеазы свертывается очень точно, что и приводит к формированию уникальной биологически активной конформации, исключая образование какой бы то ни было неправильной конформации. Этот классический эксперимент, выполненный Кристианом Анфинсеном в 50-х годах, доказал, что аминокислотная последовательность полипептидной цепи содержит всю информацию, необходимую для того, чтобы цепь свернулась в нативную трехмерную структуру. [c.197]

Вторым крупным достижением в изучении аминокислотной последовательности белковых молекул явилось определение структуры рибонуклеазы, выполненное Хирсом, Штейном, Муром и Анфинсеном. Молекула этого фермента, представленная одиночной полипентидной цепью, состоит из 124 аминокислот и содержит 4 дисульфидных мостика. При изучении ее, так же как и в случае инсулина, использовали окисление надмуравьиной кислотой с последуюш им ферментативным гидролизом. Однако для выяснения первичной структуры этой более крупной молекулы потребовалось ввести в методику некоторые усовершенствования авторы применяли ионообменные смолы для количественного разделения пептидов низкого молекулярного веса и использовали количественные методы для определения аминокислотного состава пептидов. Полная структура рибонуклеазы показана на фиг. 30. [c.94]

Вслед за установлением структуры инсулина и рибонуклеазы были расшифрованы аминокислотные последовательности еще нескольких белков, а именно лизоцима, белка оболочки вируса табачной мозаики, химотрип-синогена, трипсиногена, папаина, миоглобина, гемоглобина, цитохрома с, клупеина и некоторых других. [c.94]

В результате ферментативного воздействия, определяли последовательно после каждого отщепления Ы-концевого остатка по методу Эдмана (см. гл. 6). При изучении гемоглобина (Брауницер был удачно применен последовательный гидролиз белка разными про-теолитическими ферментами. В этом случае на белок действовали трипсином, а затем полученные пептиды гидролизовали пепсином, специфичность которого значительно повышали, ограничивая время реакции. Методические трудности, связанные с фракционированием сложных гидролизатов и определением полной структурной формулы белка, были преодолены в результате упорного труда нескольких групп ученых. Мы теперь знаем полную аминокислотную последовательность инсулина, глюкагона, рибонуклеазы, гемоглобина, белка вируса табачной мозаики, а также кортикотропина и других пептидных гормонов приближаются к завершению работы по установлению строения папаина, лизоцима, химотрипсиногена, трипсииогена, цитохрома с успешно продвигается изучение некоторых других белков. Изучение последовательности аминокислот проводилось на частичных кислотных гидролизатах или на гидролизатах, полученных при действии различных протеолитических ферментов. Чисто химические методы избирательного расщепления пептидных цепей не имели до сих пор значительного успеха, и эта область остается еще нерешенной задачей пептидно химии. [c.117]

Аминокислотная последовательность (а) и третичная структура (б) рибонуклеазы. Рнмскимц цифрами обозначены остатки иистенна, между которыми образуется связь. [c.429]

В табл. 14а приведены синтезированные фрагменты S-nen-тида, а также указаны их молярные количества на 1 моль S-белка, необходимые для проявления продуктами рекомбинации активности S-рибонуклеазы. Наиболее активным из всех фрагментов S-пептида является пептид с последовательностью аминокислотных остатков 1—13 (IV) (табл. 146). Продукт комбинации этого тридекапептида с 8-белком обладает 50%-ной активностью рибонуклеазы уже при их молярном соотношении 3 1. В случае фрагмента (1—12) (VIII) 50% активности сохраняется при молярном соотношении компонентов 88 I. Однако в случае фрагмента (1—И) (IX), содержащего всего лишь на один аминокислотный остаток меньше, на 1 моль S-белка требуется уже 8000 молей этого пептида. Приведенные данные определенно показывают важную роль остатка гистидина и не очень существенное значение аминокислотной последовательности 13—20 S-пептида для проявления ферментативной активности рибонуклеазы. Наличие остатка глутаминовой кислоты в положении 2 (от N-конца), по-видимому, существенно для [c.360]

В результате этих работ, основным достоинством которых является успешное введение новых точных количественных методов и стандартизация приемов, структура рибонуклеазы была установлена полностью. Единственный спорный вопрос относительно расположения остатка глутаминовой кислоты в 11 или 18 положениях был успешно разрешен сразу двумя параллельными путями причем на участке аминокислотной последовательности с 11 по 18 уточнен порядок аминокислот, который оказался обратным ранее предполагавшемуся, а именно [c.179]

После выяснения структуры инсулина было установлено строение некоторых других пептидов, а также белков. С каждым годом число белков и пептидов, у которых исследуется аминокислотная последовательность, становится все больше. В настоящее время к ним относятся, кроме инсулина, важнейшие гормоны окситоцин и вазопрессин, меланотропный и адренокортикотроп-ный гормоны гипофиза, глюкагон из поджелудочной железы, фермент рибонуклеаза, гемоглобин, цитохроы С и белок вируса табачной мозаики и др. [c.36]

Меррифилд в 1969 г. предложил твердофазный метод синтеза пептидов для синтеза рибонуклеазы А. Процесс начинается с ковалентного присоединения аминокислоты через карбоксильную группу к гранулам полистирольной смолы [3134] концевую аминогруппу и другие реактивные боковые цепи защищают соответствующими химическими группировками. Защитную группу на ЫНг-конце затем удаляют и вводят в систему вторую аминокислоту, при этом ее группы, за исключением карбоксильной, соответствующим образом защищены при добавлении ди-циклогексилкарбодиймида осуществляют присоединение карбоксильной группы к свободной аминогруппе первой аминокислоты. Путем повторения этого цикла при последовательном введении в реакцию разных аминокислот можно построить пептидную цепь с заданной аминокислотной последовательностью. Весь процесс проводят в одном сосуде с пористым стеклянным фильтром на дне, при этом в сос) д можно вносить требующиеся реагенты и удалять отработанные растущая пептидная цепь задерживается вместе с твердыми частицами смолы на фильтре. [c.71]

Важность этой проблемы можно иллюстрировать простым расчетом. Известно что число различных белков в природе составляет 10 . Каждый белок содержит около 200 аминокислотных остатков. В этом случае полное число различных последовательностей с 20 разными аминокислотными остатками составит 20 , что неизмеримо больше, чем число белков отобранных природой (20 10 ). Уже в первых работах (Р. Ламри, Г. Эйринг, 1954) было указано на связь между характером аминокислотной последовательности и нативной конформацией белка, обладающей минимальной свободной энергией. Об этом же свидетельствовали и опыты по обратимости перехода белков (рибонуклеаза) из денатурированного состояния в нативную конформацию с восстановлением всех дисульфидных связей. [c.206]

Наконец, рассматривая распространенное предположение, что а-спираль у гетерогенной аминокислотной последовательности представляет собой самую компактную структуру, нужно отметить, что в данном случае наибольшей плотностью должны были бы обладать высокоспирализованные белки. Однако это не так. Например, плотность миоглобина и гемоглобина (1,35 и 1,34 г/см соответственно), состоящих на 75% из а-спиралей, оказывается даже несколько меньше плотности карбоксипептидазы, химотрипсина, рибонуклеазы и стафилококковой нуклеазы (1,39, 1,37, 1,41 и 1,39 г/см соответственно), имеющих незначительное содержание а-спиралей, которые к тому же очень искажены [125—129]. Отсутствие корреляции между спиральным содержанием и плотностью белка следует и из сопоставления значений плотности, полученных Козманом и соавт. [130] из расчета на основе известных координат атомов трехмерных структур. [c.264]

Б. Ли и Ф. Рихарде [10] впервые в 1971 г., а позднее А. Шрейк и Дж. Рапли [11], введя определенные геометрические критерии, учитывающие контактные радиусы, число возможных межатомных взаимодействий и размеры молекул растворителя, рассчитали степень экспонированности атомов на поверхности белковой глобулы и таким образом определили статистическую доступность аминокислотных остатков молекулам растворителя. Оценки, сделанные для небольших белков (миоглобина, лизоцима и рибонуклеазы 8), показали, что средняя доступность атомов независимо от их полярности в нативной конформации приблизительно в три раза меньше, чем у гипотетической полностью растянутой аминокислотной последовательности. С. Чотиа, использовав тот же метод на большом числе объектов, нашел линейную зависимость между уменьшением доступной растворителю площади при свертывании аминокислотной последовательности и молекулярной массой белка [12]. [c.341]

Другие модификации включают использование ТФУ и ацетилхлорида вместо уксусного ангидрида [48], для того чтобы реакция проходила главным образом через образование смешанного ангидрида, а не оксазолинона [98]. Кроме того, предполагалось использовать в реакции не тиоцианаты, а саму тиоциановую кислоту [48]. В этих условиях удалось провести успешное определение аминокислотной последовательности пептидов, в том числе имевших С-концевой Pro. Проведение реакции с добавлением трифтороуксуспого ангидрида [96] позволило определить 14 аминокислот папаина и 10 аминокислот рибонуклеазы [97]. [c.502]

При образовании 1- M-His фермент полностью теряет активность, тогда как при образовании второго аддукта модифицированный фермент сохраняет 15% исходной активности. На основании этих данных было сделано предположение, что в состав активного центра рибонуклеазы входят два остатка гистидина. Это предположение подтверждается экспериментами, в которых показано, что небольшие молекулы, например цитидин-3 -фосфат, связывающиеся в активном центре фермента, ингибируют процесс алкилирова-ния. Кроме того, при алкилировании не получено формы рибонуклеазы, в которой были бы модифицированы оба остатка гистидина. Это, вероятно, объясняется тем, что два остатка гистидина, расположенные далеко друг от друга в аминокислотной последовательности, в нативной структуре фермента пространственно близки. И наконец, вполне вероятно, что один или оба остатка гистидина, модифицированные иодацетатом, и некоторые ионизируемые группы, предполагаемые на основании рассмотренных выше кинетических исследований, идентичны. [c.74]

Система S-Tag. Работа системы основана на взаимодействии 15-звенного S-пептида рибонуклеазы А со 103-звенной последовательностью того же фермента, которые образуют специфический очень прочный комплекс (А 10 М) [168]. Последовательность S-Tag присоединяют генно-инженерными методами к N-концевой части рекомбинантного белка в составе экспрессирующего вектора и по завершении экспрессии гибридный белок выделяют с помощью аффинной хроматографии на колонке с протеин S-агарозой. Элюирование целевого белка можно осуществлять с помощью энтерокиназы, распознаваемую последовательность которой вводят в виде линкера между целевым рекомбинантным белком и последовательностью S-Tag. Для тех же целей может быть использован и тромбин в сочетании с расщепляемой этой протеиназой аминокислотной последовательностью. В данном случае с колонки освобождается нативный рекомбинантный белок с правильной N-концевой последовательностью. Альтернативно, элюирование гибридного белка с колонки можно проводить в денатурирующих условиях (ЗМ гуанидинтиоциана-том, 0,2 М цитратом, pH 2, или 3 М Mg l2). В этом случае маркер- [c.129]

Рибонуклеаза имеет мол. вес 13 680 и образована единственной полипептидной цепью, содержащей 124 аминокислотных остатка [166, 167]. Связь между А1а-20 и 5ег-21 может расщепляться субтилизином. Интересно отметить, что при этом пептид остается связанным с остальной частью мо1екулы с помощью нековалентных связей. Модифицированный белок, названный рибонуклеазой 5, и нативный белок, называемый сейчас рибонуклеазой А, обладают одинаковой каталитической активностью. Благодаря своим небольшим размерам, простоте выделения и стабильности рибонуклеаза очень удобна для физических и химических исследований. Она была первым ферменгом, для которого удалось определить аминокислотную последовательность [166]. Кристаллическая структура обеих форм фермента была установлена с разрешением 2,0 А [168, 169]. Поскольку каталитическая активность рибонуклеазы зависит от состояния ионизации двух остатков гистидина, фермент всесторонне исследовался с помощью ЯМР — очень ценного метода для анализа свойств имидазольного кольца гистидина (гл. 5, разд. Ж-2.а). [c.388]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология