Электрофорез на ацетате целлюлозы

При наличии аномальных гемоглобинов электрофорез на ацетате целлюлозы желательно дополнять Другими высокоразрешающими электрофоретическими мето- [c.247]

Рис. 13. Кювета для электрофореза на ацетате целлюлозы [694].

Рис. 100. Схематическое изображение подвижностей различных цепей глобина при электрофорезе на ацетате целлюлозы в двух буферах с разными значениями pH, содержащих мочевину и 2-меркаптоэтанол [1142].

Электрофорез на ацетате целлюлозы [c.40]

Белки на бумажных электрофореграммах обычно фиксируют, высушивая последние при 100—120 °С, а затем бумагу погружают на 10 мин в ванночку с раствором, содержащем не более 1% красителя. Грассманн и Ханниг [468] предложили использовать насыщенный раствор амидового черного в смеси, состоящей из 9 частей метанола и 1 части уксусной кислоты. Обесцвечивание фона на электрофореграммах осуществляют, промывая их несколько раз той же смесью метанола и уксусной кислоты. Таким же способом обнаруживают белки и после электрофореза на ацетате целлюлозы, причем пленки можно сразу же погружать в раствор красителя для окрашивания вполне достаточно 5 мин. [c.266]

Электрофорез на ацетате целлюлозы проводят обычным способом. Антиген наносят в виде капли или короткой полоски. Для наблюдения- за миграцией образца рекомендуется использовать краситель. [c.245]

После электрофореза полоски пленки помещают во влажную камеру. Для этой цели удобно использовать плоскую пластмассовую коробку с плотно прилегающей крышкой. Пленку кладут на подложку из фильтровальной бумаги с прямоугольной прорезью так, чтобы с подложкой соприкасались только края пленки. Подложки можно изготавливать, например, из нескольких слоев фильтровальной бумаги ватман № 3. Крышку коробки следует выстлать поролоновой губкой, которую увлажняют, чтобы во время иммунодиффузии в камере поддерживалась влажная атмосфера. Подложки также смачивают раствором электролита, используемым для пропитывания пленок. Полоски фильтровальной бумаги (ватман № I) шириной 1—2 мм пропитывают антисывороткой, проводя по ним пастеровской пипеткой, которую держат в вертикальном положении. Оптимальное количество антисыворотки и расстояние между полоской с антисывороткой и образцом подбирают эмпирическим путем. Если полоска содержит только часть необходимого количества антисыворотки, то остальной объем наносят уже после того, как полоску помещают на пленку. Оптимальное время диффузии следует определять в предварительных опытах как правило, для этого требуется 18—48 ч. Линии преципитации не видны на пленках и обнаружить их можно только после окрашивания. С этой целью избыток белка удаляют путем промывания пленки солевым раствором в течение нескольких часов, после чего преципитаты можно окрасить так же, как зоны, получаемые при электрофорезе на ацетате целлюлозы. Лучше всего пользоваться водорастворимыми красителями (пунцовый 5 или нигрозин). [c.245]

Несмотря на высокую разрешающую способность, электро форез в гелях со свойствами молекулярного сита не нашел ши рокого применения в повседневной клинической практике. Он более трудоемок, чем электрофорез на ацетате целлюлозы или в агарозном геле. К тому же электрофорез в крахмальном или полиакриламидном геле труднее проводить в стандартных условиях. Проблемы стандартизации условий электрофореза в полиакриламидном геле подробно обсуждаются Маурером и Алленом [841]. Разумеется, необходимо сопоставлять стоимость метода с ценностью получаемой с его помощью информации. Основная причина того, что в повседневной практике до сих пор широко используются электрофоретические методы, обладающие ограниченной разрешающей способностью, заключается в следующем пока известна физиологическая роль лишь небольшого числа белков плазмы и те фракции, которые нельзя обнаружить простыми методами, дают мало полезной информации для диагноза. Методы электрофореза с высокой разрешающей способностью имеют исключительно важное значение в исследованиях белков плазмы, и после установления природы и физиологической роли остальных белковых компонентов эти методы, несомненно, займут свое место в клинической практике. [c.333]

Рис. 111. Корреляция между классами липопротеидов сыворотки, различаю шимися по плотности, и фракциями липопротеидов, полученными с помощью различных электрофоретических методов [769]. А. Электрофорез на бумаге, о. Электрофорез в агарозном геле. В. Электрофорез на ацетате целлюлозы. Л Электрофорез в полиакриламидном геле. — хиломикроны, ЛОЯЯ —липиды с очень низкой плотностью, ЛЯЯ —липиды с низкой плотностью, ЛВП— липиды с высокой плотностью, / — стартовый гель, 2—концентрирующий гель, 3 — разделяющий гель.

Бумажный электрофорез — самый простой и, возможно, наиболее широко применяемый из электрофоретических методов. Он годится для разделения целого ряда заряженных веществ, однако в настоящее время его в ряде случаев вытеснил электрофорез на ацетате целлюлозы и в гелях, обладающий более высоким разрешением. При использовании всех этих носителей наблюдается значительная диффузия малых молекул наилучших результатов удается достичь при работе с высоким напряжением (разд. 4.4.1). [c.121]

Электрофорез на ацетате целлюлозы служит простым и вместе с тем чувствительным способом обнаружения аномальных видов гемоглобина. Наиболее подходящей буферной системой является смесь трис-борная кислота-ЭДТА (pH 8,4) [816, 1141, 1224]. Для качественных анализов можно использовать микрометоды. Электрофореграммы анализируют либо без применения красителей, либо после их окрашивания общими белковыми красителями или с помощью пероксидазы. Последний метод, очевидно, более специфичен, так как выявляет только те белки, которые содержат гем. Шнейдер [1141] рекомендует двукратное окрашивание сначала пунцовым S, а затем раствором бензидина, содержащим нитропруссид натрия (дает синюю окраску). Если при электрофорезе необходимо определить содержание минорного (т. е. имеющегося в незначительном количестве) компонента, например гемоглобина Аг, то наиболее надежный метод состоит в том, что на пленку наносят относительно большое (точно определенное) количество образца, элюируют соответствующие зоны электрофореграммы без ее предварительного окрашивания и проводят фотометрическое измерение [1141]. При денситометрическом сканировании окра- [c.321]

Электрофорез на ацетате целлюлозы широко применяется в клинических исследованиях, а в сочетании с иммунодиффузией может использоваться и для иммуноэлектрофореза (разд. 4.4.4). Отсутствие адсорбции на ацетате целлюлозы и обусловленная этим высокая разрешающая способность позволяет при использовании радиоизотопов получать четко разграниченные радиоактивные области. [c.122]

TNF не является интерфероном или бактериальным эндотоксином, в частности, он не содержит 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты и жирных кислот. При электрофорезе на ацетате целлюлозы TNF движется с а-гло5улином. Он состоит по меньшей мере из четырех субъединиц и имеет молекулярную массу около 150 ООО. Он относится к гликопротеинам и содержит сиаловую кислоту и галактозамин. [c.185]

Белки после электрофореза на бумаге или ацетате целлюлозы окрашивают также бромкрезоловым зеленым (0,2%-ный раствор в этаноле, содержащем 2% ледяной уксусной кислоты). Обесцвечивание фона проводят в 2%-ной уксусной кислоте. После обесцвечивания и высушивания электрофореграммы помещают в пары аммиака. Синняя окраска медленно исчезает [336]. Уэбстер и др., [1381] исследовали возможность применения этого красителя для определения сывороточного альбумина после электрофореза на ацетате целлюлозы. Для количественной оценки окрашенную зону альбумина элюируют 3%-ным (объем/объем) раствором детергента Teepol 610. Элюция занимает всего несколько минут. Количество альбумина определяют по оптической плотности при 520 им. Было изучено также взаимодействие выделенных фракций глобулинов сыворотки с бромкрезоловым зеленым, [1381]. [c.272]

Пунцовый S также относится к широко распространенным красителям. Особенно часто его применяют после электрофореза на ацетате целлюлозы. Белки можно окрашивать 0,15— 0,20%-ным раствором пунцового S в 3%- Ной ТХУ. Для этой процедуры вполне достаточно 5 мин. После промывания электрофореграмм 5%-ной уксусной кислотой на светлом фоне проявляются четкие полосы, [251, 694]. Краситель экстрагируют из окрашенных зон 0,4 М NaOH или вероналовым буфером. [c.273]

Изоферменты липоксигеназы можно выявить после электрофореза на ацетате целлюлозы, инкубируя электрофореграммы в течение 20 мин в 7,5 мМ растворе линолевой кислоты в 0,25%-ном растворе детергента твин 20, забуференной 0,2 М фосфатом до pH 6,5. После инкубации электрофореграммы промывают дистиллированной водой и погружают на 30 с в 5%-ный раствор Fe(iNH4)2(804)2 в 3%-ной НС1, а затем еще на 30 с в 20%-ный раствор (NH4)S N. В местах расположения фермента появляются красновато-коричневые пятна [487]. [c.291]

После электрофореза на ацетате целлюлозы гиалуронидазу выявляли с помощью метода, который, по-видимому, является специфическим в отношении эндо-М-ацетилгексозамидиназ. Влажную электрофореграмму помещали на стеклянную пластинку и тщательно разглаживали чистой стеклянной пробиркой, чтобы удалить из-под нее пузырьки воздуха. Затем сверху накладывали полоску ацетата целлюлозы, насыщенную раство--ром, содержавшим 1 мг/мл гиалуроновой кислоты и фосфатно-цитратный буфер в 0,15 М ЫаС1 (pH 5,0). Полоску раскатывали по поверхности геля и сверху помещали стеклянную пластинку. Полученный сэндвич инкубировали 30 мин во влажной атмосфере при 37°С. После инкубации верхний слой снимали, высушивали на воздухе и окрашивали в течение 1 мин алциановым синим в 7%-ной уксусной кислоте. Затем его промывали водой для удаления избытка красителя и вновь сушили. Белые полосы на равномерно окрашенном синем фоне указывали положение фермента [550]. [c.298]

Обнаружение и количественное определение фосфатазной активности проводят также с другим флуорогенным субстратом—нафтол-А5-МХ-фосфатом (2-окси-3-амидо-М- (2 , 4 диметил-фенил)-нафталинфосфатом), который под действием фосфатаз превращается в сильно флуоресцирующее соединение. Инглис и др. [611] применили для этой цели метод индикаторного геля. Для его приготовления 2 /о-ный агар смешивают с равным объемом раствора 4 мМ нафтол-АЗ-МХ-фосфата в 0,4 М 2-ами-нО 2-метил-1-пропаноловои буфере (pH 11,2). После электрофореза пленки из ацетата целлюлозы кладут на пластину этого геля, тщательно разглаживая их, и инкубируют при 37 °С. При освещении пленок УФ-светом в тех местах, где произошла реакция, появляется флуоресценция. С помощью сканирующего устройства в УФ-свете можно проводить количественное определение фермента. Аналогичный метод был описан для выявления щелочных фосфатаз после электрофореза на ацетате целлюлозы [110]. [c.300]

Протеолитическую активность можно обнаружить различными методическими приемами. Уриель [1322, 1323] погружал агаровые пластины в забуференный раствор белкового субстрата. Меркель [861] использовал хромопротеиды, выделенные из морских красных водорослей. Полоски ацетата целлюлозы после электрофореза помещали на пластины агара, содержащего субстрат. Эти ферменты после электрофореза на ацетате целлюлозы можно определять также с помощью индикаторного геля, включая в агаровый гель неокрашенные белки (например, казеин) [872]. [c.303]

С помощью электрофореза на ацетате целлюлозы легко можно разделить целый ряд различных видов гемоглобина человека, например гемоглобины А, Р, 5 и С. Однако при электрофорезе в щелочных условиях нельзя отделить НЬ5 от других гемоглобинов, имеющих сходный заряд, а также НЬС от тех вариантой гемоглобина, которые, подобно НЬС, отличаются от НЬА на два заряда (НЬЕ и НЬО). Из-за незначительных различий в подвижностях гемоглобинов А и Р трудно обнаружить небольшие количества НЬА в присутствии больших количеств НЬР, и наоборот. Шмитд и Холланд [1136], проводившие оценку готовых наборов, предназначенных для электрофореза гемоглобинов (на ацетате целлюлозы), подчеркивают, что на каждую пластинку ацетата целлюлозы следует наносить набор свидетелей, содержащий гемоглобины А, Р, 5 и С. Они также пришли к выводу, что некоторые партии ацетата целлюлозы дают плохие результаты. Шмидт и Брозиус [1135] обращают внимание на тот факт, что источником ошибок при тестах на аномальные виды гемоглобина нередко является неверная интерпретация электрофоретической картины. Поэтому считают необходимым при определении фенотипа гемоглобина использовать по меньшей мере два метода, например электрофорез при разных pH или электрофорез при одном значении pH в сочетании с тестом на растворимость НЬ5. [c.322]

В настоящее время при разделении белков плазмы на основные фракции альбуминов и глобулинов метод электрофореза на фильтровальной бумаге заменяется электрофорезом на ацетате целлюлозы или в агарозных гелях (рис. 101), (Лучше ис-пользовать агарозу, а не агар, поскольку сильно заряженный агаропектиновый компонент взаимодействует с рядом белков и [c.329]

Дальнейшее повышение разрешения обеспечивает двухмерный электрофорез. Описано множество различных комбинаций, таких, например, как электрофорез на фильтровальной бумаге в первом направлении и электрофорез в крахмальном геле — во втором [1031] электрофорез на ацетате целлюлозы в первом направлении и ИЭФ — во втором [944] ИЭФ на первом этапе и электрофорез в полиакриламидном геле — на втором [270, 1127]. Самые лучшие результаты получают при использовании на первом этапе электрофореза в мягких полиакриламидных гелях или ИЭФ, а на втором — электрофореза в градиенте концентрации полиакриламидного геля. Таким путем Райт [1452] изучал белковый состав нормальных сывороток и сывороток больных с некоторыми видами злокачественных опухолей (рис. 103). Основные классы иммуноглобулинов давали при этом дискретные зоны. Постальбуминовая зона разделялась [c.333]

В случае гетерозиготного носительства аномальных гемоглобинов, например при наличии гемоглобина 8, с по(мощью электрофореза на ацетате целлюлозы можно определить не только процентное содержание НЬАг, но и процентное содержание нормальной фракции (НЬА) и патологической (НЬЗ). В эиж случае зоны, соответствующие фракциям НЬАг, НЬЗ и НЬА, вырезают, помещают в отдельные пробирки, в пробирку с НЬАг и а контрольную наливают по 4 мл 80% уксусной кислоты, а [c.246]

Соотношение фракций гемоглобина у гете(розиготных носителей НЬЗ, определенное с помощью электрофореза на ацетате целлюлозы, в среднем составляет НЬАз—3%, НЬЗ — 35 40%, НЬА — 55-60%. [c.247]

Электрофорез на ацетилцеллюлозной пленке является быстрым и удобным отборочным методам для выявления гемоглобиновых заболеваний. Прибор для проведения электрофореза на ацетате целлюлозы малогабаритный и может использоваться даже в условиях экспедиции. Электрофорез на ацетате целлюлозы является незаменимым при диагностике р-талаосемии, когда содержание НЬАг является наиболее надежным диагностическим тес-том. Однако с помощью электрофореза на ацетате цел-люлозы нельзя дать количественную оценку НЬР, так как содержание его слишком мало (в норме в среднем 1%). Поэтому данные относительно фракционного состава гемоглобина, полученные прн электрофорезе на ацетате целлюлозы, необходимо дополнить количественным определением фетального гемоглобина (Г. В. Дервиз, [c.247]

Наиболее общий метод анализа первичной структуры тРНК заключается в следующем. Молекулы тРНК. меченные Р, гидролизуются до небольших фрагментов под действием панкреатической РНазы, РНазы Т1 или смеси этих ферментов. Радиоактивные фрагменты гидролиза, олигонуклеотиды, разделяются двумерным электрофорезом (гл. 5).- В первом направлении проводят высоковольтный электрофорез на ацетате целлюлозы при pH 3,5. Затем продукты переносят на ДЭАЭ-целлюлозу и вновь проводят электрофорез при кислых зна- [c.235]

Электрофорез используется для разделения молекул, несущих суммарный заряд. Низковольтный электрофорез на бумаге нашел широкое применение для разделения аминокислот, пептидов, белков, нуклеотидов, нуклеиновых кислот и заряженных производных углеводов. Однако при низковольтном электрофорезе на бумаге имеет место значительная диффузия малых молекул, поэтому для их разделения применяют, как правило, высоковольтный электрофорез, при котором время разделения сводится до минимума и вследствие этого уменьшается диффузия. Вместо бумаги в качестве носителя зачастую используют ацетат целлюлозы, высокая чистота которого обусловливает уменьшение адсорбции образца, а следовательно, и лучшее разделение его компонентов. Одним из преимуществ ацетата целлюлозы является также его слабое фоновое окрашивание, что облегчает выявление соединений после рааделе-ния. Электрофорез на ацетате целлюлозы нашел широкое применение в клинике для разделения белков сыворотки крови (включая гликопротеиды и липопротеиды) и гемоглобинов он применяется также при иммуноэлектрофорезе. Высоковольтный электрофорез, как бумажный, так и тонкослойный, используется для разделения аминокислот, концентрация которых в плазме крови и моче при различных нарушениях обмена может быть довольно высокой. Особенно велика ценность тонкослойного электрофореза при разделении малых молекул, таких, как аминокислоты и нуклеотиды, поскольку [c.136]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология