Электрофорез также Двумерный электрофорез

Ввиду того что установление последовательности аминокислот белков представляет трудоемкую и сложную задачу, усилия были направлены на совершенствование современной методики и технических средств. Речь идет о методе выявления термочувствительных аллелей, который позволяет обнаруживать в среднем вдвое большую изменчивость [89]. Это относится также к методу двумерного электрофореза. [c.61]

Зоны можно также сфокусировать в результате наложения молекулярно-ситового эффекта, например, если электрофорез ведется в полиакриламидном геле, то в результате влияния градиента плотности. При проведении электрофореза биополимеров все чаще используются принципы аффинности и иммунной преципитации. Контролировать ход электромиграционного разделения с высоким разрешением удобно с помощью метода двумерного электрофореза и иммунной преципитации. [c.283]

Тонкослойный электрофорез можно применять и в двумерном варианте разделения. Можно, например, проводить разделение на гелях с различной концентрацией [364]. В этом случае на пластинку либо сразу наносят слои геля с разной концентрацией, либо по окончании разделения в одном направлении вырезают полоску геля, содержащую исследуемые компоненты, и вводят ее в слой с другой концентрацией геля [365, 366]. Возможны также и другие комбинации, например разделение на агаре в одном направлении и на крахмальном геле в другом [367]. При разделении рибосомных белков проводили электрофорез в одном направлении в щелочном буферном растворе, а в другом направлении в кислотном буферном растворе [368, 369]. Для разделения белков пригоден также двумерный иммуноэлектрофорез [370, 371]. В этом случае второе разделение проводят на геле, содержащем антисыворотку. [c.170]

Описано также разделение алкалоидов методом электрофореза [24—25] и двумерное разделение ТСХ в сочетании с электрофорезом [26]. Успешным оказалось также двумерное ТСХ [29, 30]. [c.428]

Генетический полиморфизм других (например, структурных) белков [1892, 1803]. На основании данных о высокой частоте полиморфизма ферментов первоначально был сделан вывод о том, что большинство генов высоко полиморфно. Однако работы последних лет заставили усомниться в их правильности. В этих работах в основном использовался метод двумерного электрофореза, иллюстрируемый рис. 5.51 [1892]. В табл. 6.3 приведены результаты одной из них [1803]. В ней исследовали общую фракцию культуры фибробластов, фибробласты, фракционированные на осадок (белки, связанные с клеточными структурами) и супернатант (растворимые белки), а также растворимые белки клеток корней волос. Число качественно различающихся вариантов оказалось весьма низким. Уровень хорошо выявляемой количественной изменчивости был гораздо выше. Предыдущие работы, проведенные на мышах, показали, что такая количественная изменчивость также имеет генетическую основу. Кроме того, уровень как качественной, так и количественной изменчивости оказался выше у растворимых белков супернатанта. Отсутствие изменчивости в настоящее время показано не только для фибробластов, но и для других тканей человека, например мозга [1741] или лимфоцитов [1782, 1783]. Для объяс- [c.287]

Замечание. В основу метода положены ранние работы [241, 244]. Метод дает высокую чувствительность (0,01 нг БСА/мм ) благодаря использованию низкой концентрации формальдегида и процедуре интенсивного окрашивания с последующим обесцвечиванием. Двумерным электрофорезом в сочетании с этим методом было разделено и обнаружено более 200 пептидов из 30 мкл мочи и более 150 — из одного отпечатка пальца. См. также работу [243], где применялось окрашивание комплексами серебра белков из слюны человека. [c.307]

Сочетание электрофореза и электрофокусирования в геле оказалось в ряде случаев удобным методом двумерного анализа белка. Множество компонентов, присутствующих в сыворотке крови, не могут быть однозначно идентифицированы каким-либо одним методом. Их вначале разделяют электрофокусированием в столбике геля, а затем электрофорезом в перпендикулярном направлении в блоке геля [86, 88, 91]. Полученная таким путем двумерная карта (рис. 17) используется при диагностике заболеваний. Этот метод, называемый также методом белковых [c.337]

Компоненты щелочных гидролизатов РНК могут быть разделены также с помощью низковольтного электрофореза на слоях целлюлозы [29, 30] или путем двумерной хроматографии на слоях ПЭИ-целлюлозы [31]. [c.44]

В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией. Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, — дот-блот анализ (от англ. dot — пятнышко) — либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза — Вестерн-блот анализ (Western blotting). Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов. Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера). В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. [c.57]

После очистки субъединиц с молекулярной массой 44 ООО Да были обнаружены последовательности трех типов а-последова-тельность, 7-последовательность, произошедшая от агрегированных глиадинов с низкой молекулярной массой, и специфическая последовательность, очень сходная с той, которую можно предполагать по результатам исследований Хюбнера и Уолла [100] (табл. 6Б.15). Было подтверждено также, что агрегированные глиадины состоят из специфических субъединиц, отличающихся от других глиадинов, как это следует из анализа методом двумерного электрофореза [101]. [c.210]

Работая с соединениями индола. Саджи [114] обнаружил, что если пластинки с пробой сушат более 2 ч, наблюдаются существенные потери, например, индолилуксусной кислоты. В тех случаях, когда задержки с началом разделения не удается избежать, автор советует применять слои целлюлозы, на которых потерь соединений не происходит. При анализе индолов полезна также двумерная ТСХ. На слоях силикагеля элюирование проводят следующими смесями растворителей а) изопропанол— 25 %-ный аммиак—вода 20 1 2) б) н-бутанол—уксусная кислота—вода (15 3 5) [107] а) метилацетат—изопропанол— 25 %-ный аммиак (9 7 4) б) хлороформ—метанол—96 %-ная уксусная кислота (9 4 1) [115] и а) бензол—диоксан (13 7), б) диизопропиловый эфир—Ы,Ы-диметнлформамид (4 1) [116]. Перед хроматографическим разделением индоловые кислоты метилировали диазометаном [ИЗ, 116]. Для двумерного разделения на целлюлозе используют следующие смеси пропанол— вода—аммиак (75 25 2) и пропанол—вода—уксусная кислота (75 25 2) [117]. Пори [117а] описал методику разделения некоторых производных индола тонкослойным электрофорезом. [c.469]

Электрофорез на крахмальном геле использовали также для разделения и идентификации гемоглобинов [195—197]. Раймонд и сотр. [198—200] считают целесообразным проводить электрофорез на геле акриламида. Как и на крахмальном геле, при этом на акрпламиде можно добиться лучшего разделения, чем на агаровом студне. Эти авторы исследовали разделение проб сыворотки на 3—25 %-ных гелях. Эти же авторы описали методику двумерного электрофореза. Согласно этой методике, электрофорез проводят в одном направлении при данной концентрации геля, затем полосу геля, содержащую разделенные белки, внедряют в слой геля другой концентрации и повторяют электрофорез в другом направлении. Эспиноза [201] использовал такой же принцип и проводил в одном направлении разделение на агаровом геле, а в другом — на крахмальном геле. [c.517]

Дасс и Уивер [71] также хроматографировали 55 фенольных соединений растительного происхождения на целлюлозе ММ 300 и микрокристаллической целлюлозе, используя следующие три системы растворителей вода—муравьиная кислота (98 2), н-амиловый спирт—уксусная кислота—вода (10 6 5), а также бензол—пропионовая кислота—вода (4 9 3). Авторы приводят цветные реакции с шестью обнаруживающими реактивами. Халук и др. [72] использовали для разделения фенолокислот смеси н-бутанол—пиридин—вода (14 3 3), метилэтилкетон—вода—диэтиламин (921 77 2) и 30 %-ную уксусную кислоту. Они применяли также двумерное разделение, причем сначала элюировали пробу 30 %-ной уксусной кислотой, а затем проводили уже в другом направлении электрофорез при напряжении 1500 В и токе 30 мА, используя буферный раствор (pH 5,3), представлявший собой смесь пиридин—уксусная кислота—вода (5 2 493). Йошек и Мюллер [73] хроматографировали 44 фенола на целлюлозе 300 Ор254 со смесью бензол— метанол—уксусная кислота (35 4 2) (двукратное элюирова ние) и нижней фазой смеси бензол—н-бутанол—вода (9 1 10) [c.250]

Халук и др. [72] использовали целлюлозу, силикагель, полиамид и гель полиакриламида в качестве субстратов при электрофорезе 25 фенольных кислот. Буферным раствором для полиакриламида служила смесь пиридин—уксусная кислота— вода (5 2 493) (pH 5,3) напряжение составляло 1400 В и сила тока 40 мА. На силикагеле и полиамиде проводили двумерное разделение хроматографию в одном направлении и электрофорез во втором. Для разделения соединений ряда бензойной кислоты применяли смесь этилацетат—уксусная кислота (95 5) при хроматографировании на полиамиде и буферный раствор Аронссона (pH 8,9) при электрофорезе при напряжении 1800 В и токе 40 мА для соединений ряда коричной кислоты буферным раствором служила смесь пиридин—уксусная кислота—вода (1 6 90) (pH 3,55) при токе в 20 мА (об условиях разделения на целлюлозе см. в разд. 5 этой главы). Уокер и Томпсон [86] также пользовались целлюлозой в качестве неподвижной фазы для электрофореза фенолов с буферными растворами с pH 5,3 или 9,1 при напряженности поля 60 В/см. Чтобы улучшить разрешение, под прямым углом к направлению электрофореза проводили хроматографирование. [c.251]

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

Для фракционирования олигорибонуклеотидов может быть также использован двумерный гель-электрофорез [127]. В ходе первой стадии электрофореза, которую проводят в 0,025 М лимонной кислоте, содержащей 6 М мочевину, происходит разделение олигомеров в соответствии с их размерами и нуклеотидным составом, а вторая стадия представляет собой обычный электрофорез при pH 8 [127].С помощью этого метода можно разделить олигомеры длиной до 80 нуклеотидных остатков. Путем сравнения картин распределения пятен ( отпечатков пальцев ), отвечающих разделенным с помощью двумерного электрофореза [и (или) гомохроматографии] олигорибонуклеотидам двух РНК, нуклеотидная последовательность одной из которых известна, можно оценить степень структурной гомологии этих РНК, а затем отобрать для дальнейшего анализа лишь такие олигорибонуклеотиды второй РНК, которые по подвижности не совпада-чют ни с одним из фрагментов РНК с известной структурой (рис. 10.11). [c.190]

Современные методы позволяют определять аминокислотную последовательность полипептида, выделенного из пятна, которое выявляется после проведения двумерного электрофореза, а также во фракциях, получаемых с помощью аналитической ВЭЖХ или [c.165]

Иногда для улучшения растворения осажденного в геле белка экстракцию ведут в 1 %-ном ДДС-Na с б М мочевиной [Buisson et al., 1976]. Щелочные негистоновые белки хроматина можно экстрагировать 66%-ной уксусной кислотой на холоду [Rabbani et al., 1980]. Белки рибосом после двумерного электрофореза и окраски СВВ R-250 можно также элюировать бб%)-ной уксусной кислотой. Краситель легко затем удалить на микроколонке ДЭАЭ-целлюлозы прямо в той же кислоте. Анионный по своей природе краситель десорбируется с белка и полностью задерживается на анионообменнике, а ш елочные рибосомальные белки с ним не связываются [Bernabeu et al., 1980]. [c.105]

Упомянем также об обнаружении фосфорилированных под действием киназ аминокислот после кислотного гидролиза белков. В этом случае наиболее удобным оказался двумерный высоковольтный электрофорез на бумаге ( Whatman ЗММ ) при pH 3,5 и 1,9 [ linton et al., 1982]. [c.485]

Двумерные разделения в настоящее время выполняются почти исключительно на бумаге, хотя известны подобные разделения на геле и комбинированные — на бумаге и геле. Ниже мы кратко опишем процедуру двумерного разделения на бумаге, не касаясь принципов методов хроматографии и электрофореза (см. соответствующие статьи настоящего сборника, а также работы [1, 2]), а затем приведем примеры применения двумерных методов разделения на бумаге. При разделении пептидов обычно используется Whatman 3 ММ или хроматографическая бумага с номи- [c.234]

ТОГО, с ПОМОЩЬЮ ТСХ можно контролировать результаты разделения, проведенного другими способами, например перегонкой, колоночной хроматографией, рекристаллизацией и т. п. Можно также использовать ТСХ для предварительной оценки структуры хроматографируемого соединения. Область применения ТСХ, которая с самого начала ее развития была достаточно широкой [38, 76], еще более расширилась благодаря универсальности метода (непрерывное и двумерное элюирование, электрофорез и гель-фильтрация в тонком слое). Благодаря своим преимуществам метод ТСХ часто вытесняет, а во многих случаях уже вытеснил бумажную хроматографию, в которой также используется плоскостное расположение хроматографической системы. Одпако в последнее время количество опубликованных статей, посвященных ТСХ, несколько уменьшилось, несмотря на то что разработаны новые модификации метода, увеличивающие его разрешающую способность и чувствительность [22а, 54а]. [c.86]

Эффективность газохроматографического разделения подчас снижается, когда в анализируемых смесях присутствуют компоненты с б.тгизкими свойствами, что приводит к наложению ГХ-ников. В ТСХ, электрофорезе и хроматографии на бумаге используют двумерное разделение, позволяющее эффективно разделить бо-льшинство веществ. Использование в ГХ двух пли более стационарных фаз в одном определении также можно рассматривать как дву-или многомерное разделение. [c.150]

Билески и Тернер [89] использовали смешанный слой целлюлозы и силикагеля (12,5 5 или 5 2) для разделения двумерным методом электрофорез — ТСХ. Экстракт растительной ткани наносили вблизи одного из углов пластинки в виде полоски в 2,5 см. После этого опрыскивали слой буфером pH 2,0 (17 мл 90 %-ной муравьиной кислоты-1-57 мл уксусной кислоты в 1 л), смачивая исходный край в последнюю очередь. После того как избыток буферного раствора стекал по каплям, слой соединили тампонами с электродными камерами и проводили электрофорез при 12—18°С в течение 20 мин при 1000 В(55 В/см) и 20— 30 мА. Пластинку затем сушили 15 мин при 40°С в интенсивном потоке воздуха в атмосфере, освобожденной от аммиака. Пластинки погружали в воду под прямым углом к направлению электрофореза, следя за тем, чтобы вода покрывала всю пластинку, но не доходила на 1 см до края электрофоретических полос. Через 5 мин подымающаяся вода перемещает полосы в компактно расположенные пятна у края пластинки. (При наличии в пробе аргинина или других основных аминокислот воду заменяют на 1 %-ную уксусную кислоту.) После сушки пластинку вновь элюируют, но уже в другом направлении смесью метилэтилкетон—пиридин—вода—уксусная кислота (70 15 15 2), чтобы разделить треонин и глутаминовую кислоту, а также удалить посторонние примеси. Второе разделение проводят смесью н-пропанол—вода—н-пропилацетат—уксусная кислота—пиридин (120 60 20 4 1). [c.494]

Плоскостной электрофорез имеет те же преимущества, что и плоскостная хроматография, т. е. позволяет на одной элект-рофореграмме сравнивать одновременно несколько образцов. Методом электрофореза можно, как и в двумерной бумажной или тонкослойной хроматографии, разделять вещества в двух направлениях, в частности в буферах с различным значением pH. Возможен и другой вариант, когда для разделения в двух взаимно перпендикулярных направлениях используют различные носители. Например, сначала проводят электрофорез в узкой полоске агарозного геля, в котором подвижность молекул определяется их зарядом, а затем — в пластинке агарозного геля, в котором вещества разделяются в соответствии с размерами их молекул. Способы качественного и количественного анализа электрофореграмм сходны с используемыми в бумажной и тонкослойной хроматографии. Белки можно обнаруживать также с помощью моноспецифических антител (иммунофиксация). [c.29]

Смотреть страницы где упоминается термин Электрофорез также Двумерный электрофорез: [c.78] [c.183] [c.173] [c.511] [c.136] [c.96] [c.196] [c.197] [c.186] [c.362] [c.105] [c.227] [c.58] [c.74] [c.25] [c.496] [c.499] [c.6] [c.6] [c.53] [c.53] [c.271] [c.131] [c.57] [c.275]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология