Растворимость белков и их разделение

Некоторые белковые вещества могут быть высолены из их растворов, другие — нет. Высаливание является важным средством для открытия и разделения отдельных белковых веществ. Производится оно по большей части поваренной солью или же сернокислым магнием весьма замечательно, что все белковые вещества сполна высаливаются прн насыщении сернокислым аммонием их нейтральных или кислых растворов. Природные белковые тела могут быть разделены дробным осаждением из их водных растворов при постепенном увеличении концентрации раствора сернокислого аммония. Концентрация, при которой данная соль осаждает белок, является для него столь же характерной, как растворимость для кристаллического вещества. Если высаливание происходит при обыкновенной температуре, то белковые вещества при этом не изме [c.322]

Растворимость белков зависит также от наличия других растворенных веществ. Например, некоторые белки не растворяются в дистиллированной воде, но растворяются в присутствии небольших концентраций нейтральных солей. При высоких концентрациях нейтральных солей белки выпадают в осадок, причем для осаждения (высаливания) разных белков требуются разные концентрации соли. Следовательно, этим способом можно фракционировать белки. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют сульфат аммония. После удаления соли (например, путем диализа) осажденный белок вновь растворяется при этом сохраняются его нативные свойства. [c.47]

Высаливание из водных растворов можно проводить не только электролитами, но и органическими веществами (этанолом, ацетоном), способными взаимодействовать с водой (гидратироваться) и понижать растворимость высокомолекулярного вещества. Например, для фракционирования белков, т. е. разделения их на фракции с относительно одинаковой молекулярной массой, в исследуемый водный раствор добавляют спирт для уменьшения растворимости белков. Растворимость белков, как и других полимеров, зависит от молекулярной массы чем она больше, тем растворимость хуже. Поэтому при введении в водный раствор белка небольшого количества спирта из раствора выделяется фракция с наибольшей молекулярной массой. Последовательно добавляя к раствору белка все новые порции спирта, можно разделить белок па любое число фракций. Каждая последующая фракция белка будет иметь меньшую среднюю молекулярную массу. [c.259]

Групповое разделение белков. Высаливание — разделение белков на фракции по их растворимости. Принцип метода заключается в дегидратации белков (обычно с помощью сернокислого аммония) при pH, близком к Р1. Различные белки выпадают в осадок при разных концентрациях соли. Это грубый метод разделения на группы. Например, глобулины выпадают в осадок при полунасыщении, а альбумины — при полном насыщении (НН4)2804. Избирательная денатурация — это выпадение в осадок при нагревании раствора до 50 °С или при подкислении среды до pH 5,0. Если выделяемый белок устойчив к нагреванию и изменению pH, то часть ненужных белков можно удалить таким простым способом. Органические растворители при низких температурах используются для щадящего группового разделения белков. По методу Кона белки плазмы крови фракционируют спиртом при температуре 3—5 °С альбумины — спирт 40%, pH 4,8, при 1-5 °С р, у-глобулины — спирт 25%, pH 6,9, при 1-5 °С а-глобулины — спирт 18%, pH 5,2, при 1-5 °С фибриноген — спирт 8%, pH 7,2, при 1-3 °С а2-глобулин — спирт 40 , pH 5,8, при 1—3 °С. Диализ — освобождение белковых растворов от низкомолекулярных соединений (например, от сернокислого аммония (NH4)2S04). Белки не проходят через полупроницаемую мембрану, а низкомолекулярные вещества проходят, что и позволяет очистить раствор белков от низкомолекулярных примесей. Получаем группу (смесь) белков, обладающих близкими физико-химически-ми свойствами. [c.50]

При кипячении с водой коллаген превращается в хорошо знакомый растворимый в воде белок желатин-, при охлаждении раствор не дает снова коллагена, а образует гель. Молекулярный вес желатина равен одной трети молекулярного веса коллагена. Очевидно, эта обработка приводит к разделению ветвей спирали, разрыву межмолекулярных водородных связей и замене их на водородные связи с молекулами воды. [c.1061]

Растворимость различного рода белков изменяется в широких пределах. Некоторые белки, например склеропротеины, нерастворимы в воде, в разбавленных растворах солей и большинстве прочих растворителей. Другие белки, встречающиеся в организованных структурах, растворяются только после экстрагирования липидов [54]. Третьи — проламины — растворимы только в 60— 80%-ном спирте. Большинство остальных белков более или менее растворимо в воде или в разбавленных водных растворах солей при средних значениях рН и температуры, а также в разбавленных водных растворах органических растворителей. В большинстве других растворителей белки не растворяются при крайних значениях рН и температуры и во многих органических растворителях они легко денатурируются. В указанных пределах стабильности каждый отдельный белок может обнаруживать в зависимости от внешних условий изменение растворимости в широких пределах, причем различные белки по-разному реагируют на изменение внешних условий. Различия в растворимости представляют собой один из важнейших принципов, на которых основано разделение белков. [c.41]

Прежде чем рассмотреть исследования Астбери, кратко остановимся на предложенной им классификации белков, в основу которой был положен структурный признак [11, 12]. По этому признаку все белки делятся на два больших класса фибриллярных и глобулярных белков. Первые имеют вытянутую, волокнистую структуру вторые -форму глобулы (во времена Астбери они назывались корпускулярными белками). Такое разделение отчасти согласуется со спецификой функционирования белков и растворимостью их в воде. Фибриллярные белки входят в состав кожи, соединительных тканей, хрящей, скелета, волос, рогов и т.д. Как правило, в обычных условиях они химически инертны, не растворяются в воде и выполняют структурную или защитную функцию. Глобулярные белки играют активную роль в метаболизме, участвуя во всех процессах жизнедеятельности организма. Многие глобулярные белки растворимы в воде. Четкой структурной или функциональной границы между двумя классами белков, однако, провести нельзя. Например, миозин (белок мышц), хотя и имеет волокнистое строение, тем не менее химически не инертен. Функция миозина связана с превращением химической энергии в механическую работу. Несмотря на значительную условность, предложенная Астбери и сохранившаяся до сих пор классификация белков по структурному признаку остается все еще целесообразной. Сама идея разделения белков в зависимости от топологии структуры хорошо согласуется с одной из задач молекулярной биологии, а именно с установлением связи между строением (в том числе пространственным) и функцией биологических молекул. У. Астбери были изучены структуры разнообразных фибриллярных белков [13, 14]. Оказалось, что эти белки по структурному признаку могут быть разделены на две конформационные группы. Первая группа, названная по начальным буквам входящих в нее белков группой к.т.е.Г., включает такие белки, как кератин (белок волос, шерсти, ногтей и т.д.), миозин (белок мышц), эпидермин (белок кожи) и фибриноген (белок плазмы крови). Во вторую группу фибриллярных белков (группа коллагена) входят белки сухожилий, соединительных тканей, хрящей и др. Белки каждой группы имеют близкие картины рентгеновской дифракции, что указывает на их конформационную аналогию. [c.11]

Для дальнейшего разделения растворенных белков часто используют различия в их растворимости. Большие количества балластных белков или выделяемый белок можно осадить из раствора путем изменения условий, влияющих на растворимость, а именно концентрации солей, pH или концентрации органического растворителя. Часто оказывается эффективным ступенчатое увеличение концентрации (ЫН4)2504. Глобулярные белки растворимы в 1 М (25% концентрации насыщенного раствора) (ЫН4)2504 и осаждаются при увеличении концентрации этого раствора до [c.141]

Высаливание. Растворы нейтральных солей широко используются не только для повышения растворимости белка, но и для избирательного осаждения разных белков, т. е. их фракционирования. Процесс осаждения белков нейтральными солями называется высаливанием. Характерной особенностью белков, осажденных в процессе высаливания, является то, что после удаления соли они сохраняют свои нативные биологические свойства. Сушность процесса высаливания заключается в том, что ионы забирают на себя гидратную оболочку белка, одновременно нейтрализуя заряд белковой молекулы. Способность к высаливанию наиболее ярко выражена у многозарядных анионов, в частности у сульфатов. На практике для высаливания чаше всего применяют сульфаты натрия и аммония. Помимо солей для осаждения белков могут быть использованы органические водоотнимаюшие (гидрофильные) растворители — этанол, ацетон, метанол и др. Высаливание достаточно широко применяется для разделения и очистки белков. Для каждого белка существует своя зона высаливания, т. е. диапазон концентраций соли, позволяющий дегидратировать и осадить белок. После удаления высаливающего агента белок сохраняет все свои природные свойства и функции. [c.72]

Принцип, положенный в основу методов RIA [91, 117], аналогичен принципу методов ELISA эти методы в основном различаются тем, что для мечения вместо ферментов применяются радиоактивные элементы (главным образом йод) [49]. Широко используемый вариант этого метода не предусматривает иммобилизацию одного из реагентов реакция проходит в растворимой фазе, поэтому очень важным дополнительным этапом является отделение меченых реагентов, участвующих в иммунокомплексах, от тех, которые не участвуют. Если антиген представляет собой белок, обычно проводят разделение иммунокомплекса, осаждая его антителами к иммуноглобулинам кролика (если специфические антитела к белку индуцированы у кролика) [49]. [c.108]

Следует остановится на исторически самых старых методах разделения и очистки белков, основанных на фракционном осаждении и соосаждении, т. е. на разнице в растворимости различных белков. В некоторых случаях, когда разница в растворимости белков может быть очень велика, методы осаждения весьма эффективны и сохраняют свое значение и сейчас. Такой случай представляется, например, когда мы выделяем термостабильный белок, не денатурируемый при нагревании из смеси других белков. Мы прибегаем к нагреву смеси и переводим все белки в малорастворимое денатурированное состояние. Подгоняя pH среды к изоэлектрической точке большинства белков, мы осаждаем все термолабильные белки, и в растворе остается лишь термостабильный белок. Так поступают при выделении рибонуклеазы, миокиназы и ряда других белков. Этот прием позволяет избавиться одним ударом от массы балласта и обогатить раствор нужным компонентом во много раз. [c.132]

Когда два белка находятся в растворе при pH, лежащем между их изоэлектрическими точками, один компонент несет положительный, а другой — отрицательный заряды и таким образом они стремятся осадить друг друга. Уже давно было признано, что это явление налагает ограничения на любой метод фракционирования белков. Были разработаны специальные методы, использующие такие взаимодействия для выделения группы белков из сложных смесей. Эти группы могут быть подвергнуты дальнейшему разделению путем повторного фракционирования с использованием э.тектролитов большей ионной силы или в присутствии биполярных ионов, т. е. в условиях, при которых взаимодействия между макромолекулами растворенного вещества сводятся к минимуму [197]. В другом методе разделения белков в межизоэлектрической области используется синтетическая полимерная кислота, которая вытесняет анионные компоненты из комплекса с катионным белком [198, 199]. Соотношение между растворимостями в системе, содержащей полимерную кислоту и белок ниже их изоэлектрической точк11, иллюстрируется на примере системы иолимета-криловая кислота — альбумин бычьей сыворотки (рис. 18). Следует отметить, что избыток полимерной кислоты приводит к повторному растворению осадка, появление которого указывает на образование отрицательно заряженных комплексов. Кривые растворимости не зависят от длины цепи [c.82]

Проводимости белковых молекул настолько низки, что устойчивая граница может существовать лишь при чрезвычайно высоких потенциалах, представляющих к тому же опасность для персонала лаборатории. Чтобы избежать этого, препаративный изотахофорез белков проводят в присутствии амфолитов, которые ипрают роль прокладок (spa ers), имеющих промежуточную по сравнению с белковыми компонентами подвижность. Эти прокладки увеличивают проводимость и способствуют образованию более устойчивых границ между компонентами. Их присутствие облегчает также создание градиента pH. Таким об разом, изотахофорез белков сходен с изоэлектрическим фокусированием, за исключением того, что компоненты в случае изотахофореза продолжают перемещаться (и со временем выходят из колонки), причем индивидуальные компоненты никогда не достигают области, где значения ipH соответствуют их изоэлектрическим точкам. Этам способом удается преодолеть три недостатка изоэлектрического фокусирования. Белок способен выходить из канала разделения и может быть собран так же, как и при простом электрофорезе. Неустойчивость белков в их изоэлекпрических точках перестает быть проблемой, если сохраняется более высокое значение pH (или более низкое при изменении общего направления потока). Не нужно также опасаться не растворимости белка в изоэлектрической точке. Основной недостаток этого метода по сравнению с изоэлектрическим фокусированием заключается в том, что он обладает [c.234]

Опыты на клетках яичника китайского хомячка (СНО) привели к предположению о компартментации двух популяций белка NS, различающихся на 10% по степени фосфорилирования, причем с РНП ассоциирована популяция с меньшим уровнем фосфорилирования [6]. Вместе с тем в клетках ВПК такой компартментации не наблюдали. Для разделения молекул NS использовали ионообменную хроматографию. Оказалось, что транскрипция in vitro идет только в присутствии более фосфорилированных молекул. Белок NS, выделенный из растворимой цитоплазматической фракции, по своей подвижности в геле отличается от вирионной формы малой степенью фосфорилирования и неспособностью поддерживать транскрипцию в реконструированных системах. Хотя высокий уровень фосфорилирования коррелирует со способностью поддерживать транскрипцию, неясно, существенны ли все или некоторые из фосфорилированных остатков для активности белка NS, или же эта корреляция случайна, [c.435]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология