Отщепление по Эдману

Эдмана реакция (деградация белков но Эдману) - метод отщепления от белка и идентификации К-концевой аминокислоты. Действующим реагентом в реакции является фенилизотиоцианат. [c.530]

Для этой цели в настоящее время можно было бы воспользоваться методом Эдмана—последовательным отщеплением аминокислот в виде фенилтиогидантоинов (см. стр. 511). Широко применяют также кар-боксипептидазу и аминопептидазу. [c.514]

Другой метод определения концевых групп, предложенный Эдма-ном (1950), включает избирательное отщепление Ы-концевых амино- [c.690]

Как MALDI, так и ионизацию электрораспылением можно легко сочетать с ферментативным расщеплением белков для последующего определения их параметров. После расщепления белка полученная смесь целиком помещается в MALDI-спектрометр и анализируется. В наиболее благоприятных случаях можно определить массу более чем 90% пептидных фрагментов. Этот подход можно использовать для определения изменений в белке, например при определении параметров рекомбинантных белков или для идентификации ковалентно-связанных модификаторов белка. Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, вследствие того, что она легко сочетается как с ЖХ-МС, так и тандемной масс-спектрометрией, может быть источником еще и дополнительной информации о последовательности аминокислот в белке. При химической ионизации пептид фрагментируется на два комплементарных ряда ионов, которые имеют последовательности аминокислот, начиная с С- и N-терминальных атомов пептида. Тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением оказывается более экспрессной и находит более разнообразное применение, чем традиционные биохимические методы, такие, как последовательное отщепление аминокислот по методу Эдмана. [c.308]

Совершенно ясно, что требованиями, предъявляемыми к любому методу ступенчатого отщепления концевых групп, являются высокий выход продукта отщепления на каждой стадии и отсутствие одновременного расщепления других пептидных связей. Рассмотрение наиболее удачного метода отщепления концевых групп — метода Эдмана — приводит к выводу, что оптимальные условия расщепления еще оконча- [c.238]

Преимущество метода Эдмана состоит в том, что при отщеп-1ИИ каждой концевой а-аминокислоты остальная часть пептид-й молекулы не разрушается и операции по отщеплению можно вторять. [c.349]

Определение аминокислотной последовательности пептидов деградацией по методу Эдмана основано на идентификации отщепленных фенилтиогидантоинов (ФТГ) аминокислот [11] по поглощению в УФ-свете ( тах=269 нм, е= 16000). В модифи- [c.419]

Наибольшее внимание следует уделять разработке химических аспектов метода в этом отношении большие методические возможности и гибкость ТФ-анализа до сих пор мало используются. Для повышения чувствительности анализа необходимо добиваться снижения уровня химического фона и повышения эффективности отщепления аминокислот (выход как в первом цикле отщепления, так и постадийные выходы в последующих циклах). На основе более глубокого понимания всех проходящих химических реакций (как основных, так и побочных) необходимо систематически пересматривать условия проведения реакции Эдмана и разрабатывать другие методы отщепления. [c.439]

При автоматическом секвенировании вместо реагента Сенгера применяют фенилизотиоцианат (реагент Эдмана) в результате реакции происходит отщепление N-концевого остатка в виде его фенилтио-гидантоинового производного (реакция Эдмана рис. 4.11). [c.39]

Для непосредственного анализа первичной структуры Б. обычно используют сек вен а тор-прибор, к-рый с высокой эффективностью осуществляет последовательное авто-матнч. отщепление N-концевых аминокислотных остатков путем деградации Б. по методу Эдмана. Все р-ции проводятся в цилиндрич. стеклянном стаканчике, вращающемся с постоянной скоростью в атмосфере инертного газа (рис. 4). Образец Б. распределяется на стенках стаканчика в виде тонкой пленки. Оптимизация процесса и тщательная очистка используемых реагентов и растворителей позволили поднять общий выход реакцин до 95% и выше. Наилучшие объекты для секвенатора-Б. и пептиды, содержащие в своем составе от 60 до 200 аминокислотных остатков для таких соединений обычно удается определять последовательность 30-35 (в ряде случаев 40-50) [c.252]

В случае применения безводных органических растворителей, содержащих кислоту, возможна миграция ацильных групп, находящихся у определенных остатков оксиаминокислот. Так, при определении концевых групп по методу Эдмана (см. стр. 237—245), согласно которому производное пептида обрабатывают нитрометаном и НС1 [87], уксусной кислотой й НС1 [88] или диоксаном и НС1 [186] для циклизации Ы-Конце-вого остатка, установлено [2, 314], что на последующих стадиях отщепления обнаруживаются небольшие Количества Ы-концевь1Х остатков серина или треонина. В одном случае это привело к неправильному выводу о последовательности аминокислотных остатков [2, 186]. Обычно исследуемое соединение обрабатывают СвНаЫСЗ или динитрофторбензолом при pH 8,5. Если же белок находится в среде с такой величиной pH до добавления реагента, то свободные аминогруппы, появляющиеся в результате миграции ацильной группы от N к О, вновь образуют пептидные связи. Предварительную [c.222]

Хорошо известный метод Эдмана для определения аминокислотной последовательности в пептидах основан на образовании тиогидантоинов (12) за счет концевой аминокислоты при действии на пептиды соответствующего RN = = S. Масс-спектры таких тиогидантоинов достаточно характеристичны и облегчают задачу идентификации отщепленной аминокислоты [507]. Масс-спектры фенилтиогидантоинов (12, R = 6Hs), например, всегда содержат интенсивные пики М+ и пики ионов [СбН5]+ и [ eH5N = = S] + - (m/z 135). Если в (12) К >СНз, то из М+ легко отщепляется молекула (R —Н). [c.291]

Метод Эдмана заключается во взаимодействии М-концевой 1МИН0КИСЛ0ТЫ с фенилизотиоцианатом в щелочной среде. При 1ьнейшей обработке слабой кислотой без нагревания проис-гит отщепление от цепи меченой концевой ФТГ-аминокис-гы (см. 11.1.4). ФТГ-аминокислота идентифицируется мерами тонкослойной или газожидкостной хроматографии л. 15.1). [c.349]

Превращение N-концевого аминокислотного остатка в тиогидантоин приводит к укорочению анализируемой полипептидной цепи на одно звено. Выделив этот пептид, исследователь получает возможность повторить всю процедуру, установить природу второго аминокислотного остатка и выделить полипептид, укороченный на два звена. Многократное повторение такой ступенчатой деградаций дает возможность последовательно идентифицировать все составляющие исходный полипептид остатки аминокислот, т.е. установить его первичную структуру. Практически в ручном варианте метод Эдмана позволяет сделать один-два десятка шагов. Работа сводится к многократному повторению одних и тех же чередую-пщхся процедур добавления изотиоцианата, отщепления тиогидантоина, отделения его от укороченного пептида для последующей идентификации, выделение оставшегося полипептида в виде, пригодном длЯ следующего шага обработки. Чтобы избавить исследователей от такой монотонной работы, требующей вместе с тем строгого соблюдения условий эксперимента на каждом шаге, созданы специальные автоматизированные установки для проведения всех перечисленных операций — автоматические секвенатори полипептидов. С их помсоцью удается провести до 40 — 60 шагов ступенчатой деградации. [c.271]

Идентификация отщепленных ФТГ является определяющей стадией в процессе деградации пептидов по методу Эдмана. В течение длительного времени для этой цели использовалась хроматография на бумаге, однако затем оиа была вытеснена другими более чувствительными и кopo тны fи методами микротонкослойной хроматографией на силикагеле и полиамиде, жидкостной и газожидкостной хроматографией. [c.58]

В секвенаторе проводятся только первые две стадии реакции Эдмана — присоединение и отщепление. Образовавшиеся в результате анилинотназолиноиы экстрагируются и собираются в коллекторе фрвкций. Их превращение в ФТГ осуществляется вручную или с помощью автоматической приставки — конвертерв. [c.62]

При ионизации полевой десорбцией масс-спектры пептидов состоят практически из одних молекулярных ионов. На этой основе Я. Шимониши был разработан метод исследования структуры белка путем непосредственного анализа смеси пептидов, получаемых после ферментативного гидролиза. Смесь пептидов подвергается деградации по методу Эдмана, и после каждого этапа, наряду с идентификацией отщепленных аминокислот, масс-спектрометрически по молекулярным ионам определяются молекулярные массы [c.73]

Аминокислотную последовательность П. определяют путем ступенчатого отщепления концевых аминокислотных звеньев с помощью аминопентидазы или по методу Эдмана (обработка фенилизотиоцианатом) [c.15]

Конингсберг и Хилл ввели важное усовервгенствование в этот метод, а именно хроматографическое разделение очищенного деградированного пептида, что открыло возможность идентификации отщепленной N-концевой аминокислоты путем сравнения результатов аминокислотного анализа исходного и деградированного пептида. Благодаря этому реактив Эдмана занял теперь центральное место в арсенале средств, используемых для установления последовательности аминокислот. Определение концевой аминокислоты можно повторять многократно, идентифицируя один N-концевой остаток за другим (после того как будет отщеплен предыдущий). Теоретически так можно пройти по всей пептидной цепи, однако на практике приходится сталкиваться с трудностями, которые вынуждают ограничиться примерно пятью успешными определениями. [c.87]

Для действия этого фермента необходимо присутствие свободной а-аминогруппы поэтому он отщепляет от пептидной цепи только N-концевую аминокислоту. Как и при действии реактива Эдмана, отщеп.тгение N-концевой аминокислоты приводит к демаскированию следующего N-концевого аминокислотного остатка. Изучение кинетики освобождения аминокислот ия полипептида дает информацию о последовательности аминокислот в цепи. В случае пептида, имеющего структуру HgN—A-B- -D и т. д., аминокислота А будет освобождаться быстрее, чем аминокислота В, а эта последняя в свою очередь быстрее, чем аминокислота С, и т. д. Лейцинаминопеп-тидаза, как явствует из ее названия, легче всего отщепляет N-концевые остатки лейцина однако она способна отщеплять также и другие аминокислотные остатки, хотя и значительно медленнее. Затруднения, встречающиеся при использовании этой методики, связаны большей частью именно с этими различиями в скорости отщепления. Если, например, в упомянутом выше гипотетическом пептиде аминокислота В является хорошим субстратом, а аминокислота А — плохим, то А и В будут отщепляться практически одновременно. [c.88]

Другой метод определения концевых групп, предложенный Эдма-ном (1950), включает избирательное отщепление N -концевых аминокислотных остатков. При реакции белка с фенилизотиоцианатом образуется соответствующее фенилтиокарбамильное производное I, которое расщепляется хлористым водородом до фенилтиогидантоина II и модифицированного белка. Наконец, щелочной гидролиз фенилтиогидантои-на приводит к выделению свободной концевой аминокислоты ПГ. [c.675]

При изучении К-концевой последовательности аминокислот в белках и пептидах часто используется метод Эдмана, заключающийся в последовательном отщеплении N-кoнцeвыx аминокислотных остатков от полипептидной цепи в виде соответствующих З-фенил-2-тиогидантоинов [78, 79]. [c.31]

В результате ферментативного воздействия, определяли последовательно после каждого отщепления Ы-концевого остатка по методу Эдмана (см. гл. 6). При изучении гемоглобина (Брауницер был удачно применен последовательный гидролиз белка разными про-теолитическими ферментами. В этом случае на белок действовали трипсином, а затем полученные пептиды гидролизовали пепсином, специфичность которого значительно повышали, ограничивая время реакции. Методические трудности, связанные с фракционированием сложных гидролизатов и определением полной структурной формулы белка, были преодолены в результате упорного труда нескольких групп ученых. Мы теперь знаем полную аминокислотную последовательность инсулина, глюкагона, рибонуклеазы, гемоглобина, белка вируса табачной мозаики, а также кортикотропина и других пептидных гормонов приближаются к завершению работы по установлению строения папаина, лизоцима, химотрипсиногена, трипсииогена, цитохрома с успешно продвигается изучение некоторых других белков. Изучение последовательности аминокислот проводилось на частичных кислотных гидролизатах или на гидролизатах, полученных при действии различных протеолитических ферментов. Чисто химические методы избирательного расщепления пептидных цепей не имели до сих пор значительного успеха, и эта область остается еще нерешенной задачей пептидно химии. [c.117]

Френкель-Конрат при отщеплении N-концевых аминокислот по способу Эдмана (см. стр. 171). Этим методом было подтверждено наличие С-концевого аланина у альбумина сыворотки крови лошади. Очень часто вследствие побочных реакций получают низкие выходы 2-тиогидантоинов по-видимому, идентификацию отщепляемой аминокислоты лучше осуществить путем сопоставления аминокислотного состава исходного и укороченного пептида или белка (т. е. по разности). Фокс и др. показали [51], что аминокислоты лизоцима (кроме С-концевого остатка) не разрушаются при обработке по методу Шлака и Кампфа точный аминокислотный анализ после кислотного гидролиза показал потерю 1 остатка лейцина на 1 моль лизоцима (мол. вес 14 700). [c.210]

При отщеплении N-концевого остатка лизина в каллидине по методу Эдмана (обработкой фенилизотиоциана ом) образуется нонапептид, не отличающийся по своим свойствам от брадикинина. [c.151]

Изучение строения белков намного сложнее, чем каучука, целлюлозы и синтетических полимеров, так как в отличие от последних макромолекула белка состоит не из одинаковых повторяющихся мономерных звеньев, а из остатков более 20 различных аминокислот. При выяснении структуры белков поэтому необходимо было установить не только число и природу остатков, но также и порядок их чередования в макромолекуле. Для решения этой задачи производят последовательное отщепление аминокислот с того или другого конца полимерной молекулы с последующей идентификацией их. В методе Эдмана, например, белок обрабатывают раствором фенилизо-тиоцианата в пиридине и полученный продукт присоединения — раствором НС1 в нитрометане. При этом концевой остаток отщепляется в виде соответствующего фенилтиогидантоина без изменения остальной части макромолекулы [c.242]

С-концевое отщепление. Предложен ряд методов последовательного химического расщепления по карбоксильному концу молекулы пептида (гл. 18). Первые попытки в этом направлении были предприняты еще до описания реакции Эдмана, но они не смогли составить конкуренцию последней. В перспективном, тщательно изученном методе [98] С-концевой карбоксил пептида реагирует с тиоцианатом аммония в уксусном ангидриде полученный при этом циклический пептидилтиоги-дантоин обрабатывается кислотой (или ацетогидроксаматом) продуктами последней реакции являются тиогидантоин С-концевого остатка и пептид, укороченный на одну С-концевую аминокислоту. В исходной методике каждый цикл отщепления включал длительные и трудоемкие стадии разделения и сушки. Удавалось отщепить только 2—6 остатков. Однако в связи с развитием ТФ-метода с этим подходом связаны новые надеж- [c.454]

Два главных препятствия до сих пор ограничивают пределы возможностей автоматического ЖФ-метода Эдмана [32]. Первой проблемой является перенос остаточных аминокислот на каждый последующий цикл. Это явление происходит как из-за неполного присоединения реагента к белку, так и из-за неполного отщепления модифицированной N-концевой аминокислоты в виде 2-анилинотиазолинона другая проблема заключается в том, что па стадии кислотной обработки карбамоилпеп-тида (белка) происходит расщепление внутренних неустойчивых пептидных связей, приводящее к появлению новых полипептидных цепей, т. е. новых последовательностей. В результате этих двух процессов накопление фона ФТГ-аминокислот достигает такого уровня, что однозначная идентификация последовательности аминокислот основной цепи становится невозможной, Для снижения уровня остаточных пиков было предложено проводить и конденсацию, и отщепление АТЗ дважды в каждом цикле [31]. Однако такое изменение стандартной методики приводит к большим потерям пептида (вымывание из реактора). Для снижения этих потерь в реактор добавляют носители-белки или органические полимеры [78, 92], но, к сожалению, белки подвержены ацидолизу, в результате чего возникают ложные последовательности. Для снижения уровня остаточных аминокислот, появляющихся в результате неполного взаимодействия ФИТЦ с полипептидами (особенно если Pro—N-концевой остаток), повышают температуру реактора до 55°С [94]. [c.456]

Этот реагент присоединяется как к N-концевой а-аминогруппе, так и к аминогруппам боковых цепей упомянутых аминокислот. При обработке кислотой отщепляется первый остаток, а второй готов к участию в обычной реакции Эдмана сульфо-фенилтиокарбамоильная группа, присоединившаяся к боковой цепи С-концевой аминокислоты, остается неотщепленной. Единственный недостаток этой методики заключается в неполном отщеплении первого остатка, что сильно снижает начальный выход и вносит высокий фон остаточных аминокислот в самом начале анализа. Кроме того, идентификация первой аминокислоты представляет некоторую трудность. Сообщалось, что изомер (3-сульфофенилизотиоцианат) обладает некоторыми преимуществами при проведении этой модификации [30], однако до сих пор мало известно о его использовании. Для увеличения гидрофильности пептида можно амидировать карбоксильные [c.457]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология