Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Статьи Рисунки Таблицы О сайте English

Электрофорез в полиакриламидном двумерный

    Зоны можно также сфокусировать в результате наложения молекулярно-ситового эффекта, например, если электрофорез ведется в полиакриламидном геле, то в результате влияния градиента плотности. При проведении электрофореза биополимеров все чаще используются принципы аффинности и иммунной преципитации. Контролировать ход электромиграционного разделения с высоким разрешением удобно с помощью метода двумерного электрофореза и иммунной преципитации. [c.283]


    Другой тип двумерного разделения с применением изоэлектрической фокусировки — это метод, в котором используется иммунодиффузия. В этом методе разделение проводят изоэлектрической фокусировкой на полиакриламидном геле, а затем фрагмент геля вводят в агарозу, содержащую антисыворотку. После этого проводят электрофорез в направлении, перпендикулярном первому разделению. Белки перемещаются в агарозу, и в ней появляются зоны миграции антигенов-антител [419]. [c.177]

    Одно из серьезных ограничений гель-электрофореза как метода выделения специфических фрагментов ДНК заключается в том, что молекулы, имеющие примерно одинаковую массу, но различную нуклеотидную последовательность, обладают, как правило, одинаковой электрофоретической подвижностью. Один из возможных подходов к решению этой проблемы основан на использовании предложенного в работе Фишера и Лермана [115] метода двумерного гель-электрофореза фрагментов ДНК. Сначала смесь фрагментов ДНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью обычного гель-электрофореза, а затем в перпендикулярном направлении проводят электрофорез в 4%-ном полиакриламидном геле в градиенте концентрации формамида (от 4 до 30%) и мочевины (от 0,7 до 5,25 М). Разделение проводят при повышенной температуре. В этой методике использован эффект резкого уменьшения электрофоретической подвижности в результате денатурации или плавления части нативной молекулы ДНК. В ходе электрофореза во втором направлении фрагменты ДНК подвергаются воздействию все более жестких денатурирующих условий, и плавление части молекулы двухцепочечной ДНК сопровождается скачкообразным изменением ее подвижности. Связь между подвижностью фрагментов ДНК и их нуклеотидной последовательностью носит сложный характер и до сих пор окончательно не выяснена [115], [c.185]

    Если методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле сравнить примерно 2000 наиболее часто встречающихся белков (т. [c.177]

    Рис 13-8. Анализ белков, синтезируемых в фазах G и S. с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. [c.400]

    Использование метода электрофореза в полиакриламидном геле для анализа и разделения сложных смесей белков и нуклеиновых кислот значительно расширило наши знания о многих клеточных и вирусных системах. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет ряд преимуществ перед другими аналитическими методами он отличается простотой в исполнении, хорошей воспроизводимостью результатов и не требует сложного оборудования. В комбинации с двумерным разделением и изоэлектрофокусированием он может быть использован не только для аналитических, но и для препаративных целей. [c.118]


    Среднее время, за которое рецепторы трансферрина проходят цикл от поверхности клетки в эндосомы и обратно к поверхности, было определено путем мечения рецепторов на поверхности клетки радиоактивным иодом при 0°С и изучения их дальнейшей судьбы при 37°С. В различные моменты времени после переноса клеток в условия температуры 37°С образцы разбавляли охлажденной до 0°С средой, содержащей трипсин. Количество радиоактивности в рецепторах трансферрина, устойчивых к трипсину, измеряли после их отделения от других компонентов мембран с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Результаты представлены на рис. 6-12. [c.67]

    Остановимся вначале на номенклатуре Р-белков. Все они имеют сходную молекулярную массу, поэтому их довольно трудно разделить с помощью одномерного гель-электрофореза. Гораздо лучшее разрешение удается получить при двумерном разделении, когда в одном направлении проводят изоэлектрофокусирование, а в другом — электрофорез в полиакриламидном геле (рис. 24.8). При этом два основных белка РВ1 и РВ2 (перечисленные в порядке убывания их молекулярной массы) отделяют- [c.460]

    Экзонуклеазы отщепляют нуклеотиды с концов полинуклеотидных цепочек, в то время как эндонуклеазы делают разрывы внутри цепи. Одни из них гидролизуют лишь одноцепочечные молекулы, другие— двухцепочечные. Некоторые нуклеазы разрывают обе цепи ДНК, тогда как другие надрезают молекулу, внося разрыв лишь в одну из цепей. Специфичность ряда нуклеаз отражена в табл. 2-11. Частичный ферментативный гидролиз РНК дает расщепление молекулы на короткие нуклеотидные последовательности, позволяющие далее определить полную последовательность РНК. (Первой РНК, для которой установлена последовательность, была аланиновая тРНК. Расщепление проводили с помощью панкреатической рибонуклеазы и рибонуклеазы Т1 [133]. Очень полезным методом получения нуклеотидных карт оказался двумерный электрофорез в полиакриламидном геле [134]. [c.168]

    Для контроля за степенью очистки белков чаще применяют метод электрофореза. Большинство авторов в качестве носителя используют гомогенные гели или градиент концентрации акриламида. Основной способ при этом — электрофорез в диссоциирующей среде ДДС-Na соответственно процедуре, которую описал Лэммли [68]. В определенных случаях завершающим приемом при этом являются иммунодиффузия [29, 114] либо иммуноэлектрофорез [17, 80, 118]. При исследовании структуры некоторые авторы прибегают к двумерному электрофорезу. Тогда первая миграция молекул может происходить в гомогенном геле полиакриламида с ДДС-Na или без него во втором направлении молекулы мигрируют в полиакриламидном геле с ДДС-Na в присутствии восстановителей дисульфидных связей (р-меркапто-этанол) [10, 40, 61, 78]. Чтобы охарактеризовать субъединицы легуминов гороха и конских бобов, Матта и др. [77, 78] применяют сочетание ДДС-Na с р-меркаптоэнталом и электрофокусированием. Рестани и др. [92 пользуются этим же способом применительно к глобулинам люпина, а Ху и Еэзен [53] демонстрировали гетерогенность белков сои. Указанные методы с [c.155]

    Полное аналитическое разрешение всех рибосомных белков достигается с помощью двумерного гель-электрофореза в денатурирующих условиях. Удобная система разделения была предложена Э. Кальт-шмидтом и Г. Виттманном они использовали 8%-ный полиакриламидный гель при pH 8,6 для электрофореза в первом направлении и 18%-ный гель при pH 4,6 во втором направлении. В этих условиях разделялись все белки 30S субчастицы и все белки 50S субчастицы Е. oli. Пример такого разделения белков обеих рибосомных частиц в слегка модифицированной системе дан на рис. 53 и 54. Первое направление электрофореза в рыхлом геле при нейтральном или слегка щелочном pH обеспечивает движение кислых и нейтральных белков влево, к аноду, в то время как основные белки мигрируют вправо, к катоду, разделяясь в основном по заряду. Второе направление электрофореза в плотно сшитом геле при кислом pH обеспечивает движение всех белков в одну сторону —к катоду (вниз), и в их разделение большой вклад вносит размер разделяемых компонентов (чем меньше, тем подвижнее). [c.91]

    Изоэлектрическое фокусирование обладает наивысшей разрешающей способностью, когда-либо достигавшейся при разделении белков цо зар5 дам [58—64, 92]. Этот метод позволяет разделить белки, велйчины р/ которых различаются всего на 0,01 ед. pH. Иногда Для такого разделения бывает достаточно различия между двумя структурами на одну заряженную группу. При помощи метода изоэлектрофокусирования можно также обнаружить другй различия в зарядах, которые, строго говоря, не связаны с макроскопической егомогенностью белков. Вот некоторые из факторов, обусловливающих такие различия посттрансляционная модификация первичной структуры (например, дезамидирование), связывание лигандов, химическая модификация, вариации в небелковых компонентах, например липидах, углеводах и других простетических группах, ассоциация и диссоциация, изменения окислительно-восстановительного состояния металлоферментов. Если при анализе картины изоэлектрофокусирования иметь в виду эти факторы, то полученные данные могут приобрести дополнительную ценность, поскольку в принципе они позволяют обнаружить микрогетерогенность белковых структур. В настоящее время метод изоэлектрического фокусирования применяют в сочетании с другими электрофоретическими методами, например в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, для получения двумерных карт разделяемых компонентов. В одном направлении производят разделение белков в соответствии со значениями их рД а в другом — в соответствии с размерами их молекул, т. е. в соответствии с их молекулярными массами. При помощи этих методов можно охарактеризовать смеси, содержащие тысячи белков [94]. Еще несколько лет тому назад разделение с таким высоким разрешением было просто немыслимо, а в настоящее время этот метод анализа находит все более широкое и все более успешное применение в различных биохимических исследованиях. [c.126]


    Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

Рис. 4-52. Фракционирование белков клетки Е. oli методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле Каждое пятно соответствует отдельной полипептидной цепи. Сначала белки разделяли соответственно их изоэлектрическим точкам методом изоэлектрического фокусирования слева направо Затем в присутствии ДСН их разделяли методом электрофореза сверху вниз в соответствии с молекулярной массой их субъединиц Рис. 4-52. <a href="/info/15400">Фракционирование белков</a> клетки Е. oli <a href="/info/1554457">методом двумерного</a> электрофореза в <a href="/info/105837">полиакриламидном геле</a> Каждое пятно соответствует отдельной <a href="/info/31816">полипептидной цепи</a>. Сначала <a href="/info/235179">белки разделяли</a> соответственно их <a href="/info/995842">изоэлектрическим точкам методом изоэлектрического</a> фокусирования слева направо Затем в присутствии ДСН их <a href="/info/444957">разделяли методом</a> электрофореза <a href="/info/1721851">сверху вниз</a> в соответствии с <a href="/info/532">молекулярной массой</a> их субъединиц
    О Фаррел (O Farrell) разработал систему двумерного гель-электрофореза для анализа белковых смесей. Предложенный им метод представляет собой сочетание ДСП-электрофореза белков в полиакриламидном геле и изоэлектрического фокусирования [c.218]

    Клетка скелетной мышцы млекопитающих обычно очень велика и содержит много ядер. Она образуется в результате слияния многих клеток-предшественников. называемых миобластами (см. разд. 17.6.1). Зрелая мышечная клетка отличается от других клеток большим числом присущих только ей белков, включая специфические типы актина, миозина, тропомиозина и тропонина (входящих в состав сократительного аппарата), креатинфосфокиназу (обеспечивающую специализированный метаболизм мышечной клетки) и ацетилхолиновые рецепторы (необходимые для того, чтобы мембрана была чувствительна к нейростимуляции . В пролиферирующих миобластах такие специфичные для мышц белки и соответствующие им мРНК отсутствуют либо обнаруживаются в очень небольших количествах. По мере слияния миобластов в образующихся клетках одновременно увеличивается концентрация мышечно-специфичных белков и их мРПК. Следовательно, контроль за экспрессией соответствующих генов осуществляется на уровне транскрипции. Уровень синтеза многих специфичных для мышцы белков возрастает по меньшей мере в 500 раз. С помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле показано, что одновременно меняется концентрация многих других белков некоторые из них перестают синтезироваться, продукция других достигает максимума и затем падает, у части белков происходит сдвиг с одного уровня синтеза на другой и так далее. [c.182]

    Убедительные результаты были получены в лаборатории А. Д. Мирзабекова В. Л. Карповым и О. В. Преображенской. Они разработали метод гибридизации с тенями гистонов . Для этого ДНК сшивали с гистонами с помощью диметилсульфата в условиях, когда пришивается в среднем одна молекула гистона на отрезок ДНК длиной около 200— 300 п. н. Затем ДНК фрагментировали и проводили двумерный электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После прогона в первом направлении разрушали пришитые к ДНК гистоны протеиназой и вели разгонку во втором направлении уже свободной ДНК. Так как при первом раунде электрофореза разные гистоны по-разному замедляли движение фрагментов ДНК, то после второго прогона выявлялось несколько диагоналей [c.147]

    Набор белковых фракций, разделенных при электрофорезе, называется электрофореграммой , как синонимы применяются термины протеинограмма , белковый спектр электрофоре-граммы после двумерного электрофореза обозначают как белковые карты . С внедрением в микробиологические исследования новых модификаций зонального электрофореза, в частности в крахмальном и полиакриламидном геле, создалась возможность широкого изучения белков, свободных и связанных с субклеточными структурами бактерий разных систематических групп. [c.75]

    В настоящей главе дается общий обзор ряда методов тонкого аналитического разделения белков и гликопротендов. Все это методы двумерного разделения, которое включает два последовательных этапа, основанных на использовании разных биохимических и биофизических свойств. По крайней мере одни из этих этапов — электрофорез в полиакриламидном геле. [c.72]

    Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия — это основная процедура во всех обсуждаемых ниже методах двумерного разделения. Описание прибора и основных принципов разделения было сделано ранее (Taka s, 1979). Ниже будет сказано лишь об особых деталях метода, которые применяются в нашей лаборатории и дополняют процедуру, описанную в упомянутой статье. [c.73]

    В 34 главах изложены методы определения, выделения и очистки антител (включая дансилироваиие, двумерную хроматографию, изоэлектрофокусирование, электрофорез в полиакриламидном геле и изотахофорез) методы определения констант равновесия (равновесный диализ, равновесная фильтрация и седиментация) способы маркировки реагентов изотопами и флуоресцентными красителями и определение компонентов клеточной поверхности меры предосторожности при работе в изотопной лаборатории методы химической модификации белков, гаптенов и нерастворимых носителей приемы получения аитн-сывороток к аллотипам и антигенам гистосовместимости и получения антител доминирующего клонотипа методы оценки гистосовместимости и реакций в смешанной культуре лимфоцитов методы разделения клеток на гелях, несу- [c.7]

    Оборот мембранных рецепторов трансферрина изучали с помощью изотопной метки, которую вводили в рецепторы, расположенные на поверхности клетки, чтобы определить их даль-нейщие превращения в условиях инкубации при О и 37°С. Интактные клетки обрабатывали радиоактивным иодом при 0°С в условиях, благоприятных для мечения белков клеточной поверхности. Если после этого клетки инкубировали на льду и затем обрабатывали трипсином, который разрушает рецепторные участки, не нарушая целостности клетки, то радиоактивно меченные рецепторы трансферрина полностью разрушались. (Немеченые рецепторы к трансферрину выявлялись как отдельное пятно после разделения клеточных белков путем двумерного электрофореза в полиакриламидном геле.) Если же клетки сначала инкубировали при 37°С в течение 1 ч, а затем обрабатывали трипсином (на льду), то в соответствующем пятне обнаруживалось около 70% первоначальной радиоактивности. Сама по себе инкубация при обеих температурах, судя по результатам электрофореза, не вызывала повреждения большей части рецепторов. [c.66]

    NS-Белок представляет собой фосфопротеин при двумерном электрофорезе в полиакриламидном геле разрешается до 13 полос фосфорилированных молекул [12]. Возможно, уровень фос-< )орилирования влияет на функцию NS-белка [14]. Молекулы этого белка можно разделить на две фракции с высоким и низким уровнем фосфорилирования. Высокофосфорилированная фракция стимулирует транскрипцию in vitro, в то время как фракция с низким уровнем фосфорилирования неактивна в [c.426]

Рис. 4-52. Фракционирование белков клетки . соИ методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Каждое пятно соответствует отдельной полипептидной цепи. Сначала белки разделяли соответственно их изоэлектрическим точкам методом изоэлектрического фокусирования слева направо. Затем в присутствии ДСН их разделяли методом электрофореза сверху вниз в соответствии с молекулярной массой их субъединиц. Отметим, что содержание разных бежов в клетке неодинаково. (С любезного разрешения Patri k О Farrell.) Рис. 4-52. <a href="/info/15400">Фракционирование белков</a> клетки . соИ <a href="/info/1554457">методом двумерного</a> электрофореза в <a href="/info/105837">полиакриламидном геле</a>. Каждое пятно соответствует отдельной <a href="/info/31816">полипептидной цепи</a>. Сначала <a href="/info/235179">белки разделяли</a> соответственно их <a href="/info/995842">изоэлектрическим точкам методом изоэлектрического</a> фокусирования слева направо. Затем в присутствии ДСН их <a href="/info/444957">разделяли методом</a> электрофореза <a href="/info/1721851">сверху вниз</a> в соответствии с <a href="/info/532">молекулярной массой</a> их субъединиц. Отметим, что <a href="/info/33482">содержание разных</a> бежов в клетке неодинаково. (С любезного разрешения Patri k О Farrell.)
    Разделение белков рибосомной 50 S-субчастицы с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. (Печатается с любезного разрешения д-ра harles antor.) [c.98]


Смотреть страницы где упоминается термин Электрофорез в полиакриламидном двумерный: [c.183]    [c.173]    [c.175]    [c.195]    [c.195]    [c.217]    [c.233]    [c.170]    [c.89]    [c.159]    [c.206]    [c.217]    [c.298]   
Установление первичной структуры нуклеиновых кислот (1975) -- [ c.86 ]




ПОИСК





Смотрите так же термины и статьи:

Двумерные

Электрофорез



© 2025 chem21.info Реклама на сайте