Диализ и гель-фильтрация

Обессоливание. Раствор обессоливают перед нанесением на колонку с КМ-целлюлозой. Это можно осуществить либо диализом, либо гель-фильтрацией через большую колонку с сефадексом 0-25. Диализ следует проводить против проточной воды в течение по крайней мере [c.265]

Для того чтобы предотвратить диффузию компонентов пробы вверх и тепловую конвекцию, было предложено [912] помещать над пробой еще один слой геля. Рекомендуется исследуемые вещества растворять в том же буфере, на котором приготовлен концентрирующий гель. Если образец сильно разведен, то для концентрирования белков путем изотахофореза [281] или методом скачка напряжения [570] требуется более толстый слой концентрирующего геля. В случае высокого исходного содержания солей в анализируемом препарате следует либо удалить их с помощью диализа, гель-фильтрации или каким-то другим способом, либо, если позволяет концентрация макромолекул, развести пробу. Для получения воспроизводимых результатов необходимо, чтобы во всех опытах наносимый раствор имел совершенно одинаковые ионную силу, pH и объем. [c.98]

Для их определения применяют особые методы, например диализ, гель-фильтрацию, электрофорез Вне-и внутриклеточные концентрации определяют расчетными методами, применяя для оценки внеклеточного объема распределения физиологические индикаторы. [c.95]

После добавления органического растворителя рекомендуется продолжать перемешивание еще 15—20 мин при температуре фракционирования. Образовавшиеся осадки отделяют центрифугированием при той же температуре. При более высокой температуре часть осадка может раствориться, а при более низкой часть белков из раствора может выпасть в осадок. Осадки обычно оседают легко, однако увеличение скорости центрифугирования даст возможность снизить его продолжительность. После центрифугирования осадок, содержащий фермент, необходимо растворить в воде или буфере, чтобы снизить концентрацию органического растворителя. Перед последующей обработкой для удаления органического растворителя проводят диализ или используют гель-фильтрацию. [c.203]

Исходный препарат в большинстве случаев вносят на хроматографическую колонку растворенным в том же буфере, каким уравновешена сама колонка. Перевести препарат в этот буфер можно диализом или гель-фильтрацией. Надо проследить за тем, чтобы раствор препарата был прозрачен, т. е. свободен от частиц осадка или пыли. При необходимости его следует осветлить центрифугированием или отфильтровать. [c.77]

Выбрав таким образом буфер, в него переводят как аффинный сорбент, так и вносимый на него препарат. Последнюю операцию легко осуществить диализом или гель-фильтрацией, а иногда и просто разбавлением. [c.406]

В этом, да и во всех остальных случаях неспецифической элюции, экспериментатор пе должен упускать из по.чя зрения возможности необратимой денатурации очищаемого белка или белкового лиганда. Нередко приходится искать компромисс между эффективностью элюции и опасностью такой денатурации. По этой причине элюированный с колонки препарат следует немедленно путем диализа или гель-фильтрации перевести в подходящий буфер, а сорбент — промыть. Выяснение эффективности того или иного метода неспецифической элюции можно провести, как обычно, с помощью предварительных опытов в пробирках. Опасность необратимой денатурации следует оцепить, наблюдая динамику инактивации раствора вещества в элюенте. Эта оценка должна предшествовать выяснению эффективности элюции, если наличие вещества в элюенте выявляется по его биологической активности. [c.408]

В связи с этим при построении калибровочного графика для определения белка по Лоури в растворитель для стандартного белка необходимо включать все компоненты, содержащиеся в анализируемых пробах. В некоторых случаях целесообразно предварительное осаждение белков из растворов, например трихлоруксусной кислотой, с последующим растворением их в щелочных растворах, или очистка белковых растворов от низкомолекулярных компонентов путем диализа или гель-фильтрации на сефадексе G-25. [c.81]

При групповом разделении смеси высокомолекулярные соединения не фракционируются. Гель-фильтрация в данном случае, подобно диализу, используется для отделения белков от низкомолекулярных примесей и может заменить его. Обессоливание белков можно проводить на сефадексах G-25 и G-50, а также на биогелях Р6 и РЮ. Для обессоливания пептидов следует применять сефадексы G-10 и G-15 или биогели Р2 и Р4. [c.221]

Осадки белков, полученные при высаливании, обычно очищают от примеси солей методом диализа или методом гель-фильтрации. В основе этих методов лежит различие в молекулярной массе белка и соли. [c.26]

Гель-фильтрация обладает рядом преимуществ по сравнению с диализом как метод очистки растворов от солей. Метод позволяет легко отделять от макромолекул не только соли, но и другие молекулы с низкой молекулярной массой. Например, при помощи гель-фильтрации можно отделять нуклеиновые кислоты от нуклеотидов и фенолов, полисахариды от сахаров, белки от аминокислот и других низкомо лекулярных соединений. [c.477]

Диализ и гель-фильтрация [c.397]

При подготовке образцов для хроматографирования и дальнейшей обработки обычно целесообразно удалить избыток солей и низкомолекулярных веществ (например, мочевина), так как они могут мешать последующему разделению и анализу. Диализ и гель-фильтрацию (основные методы обессоливания нуклеиновых кислот) применяют в этой области ограниченно. Обычно используют экстракцию смесью ацетон—спирт [17, 18] или адсорбцию на активированном угле [15, 19]. При очистке на колонке адсорбцию ведут при pH 4—5, а элюирование проводят спиртом, содержащим аммиак. Для очистки нуклеотидов и их [c.37]

Поскольку реакции с участием высокомолекулярных соединений протекают сравнительно медленно, для их осуществления требуется значительный избыток реагентов. Этот избыток вместе с побочными продуктами реакции следует удалить. Метод гель-фильтрации, позволяющий осуществить групповое разделение в мягких условиях, как нельзя более подходит для этой цели. Его превосходство перед диализом наглядно демонстрируют тщательно поставленные опыты по маркировке антител флуоресцеин-изо-тиоцианатом (см. литературу, приложение I). В то время как для полного отделения низкомолекулярного красителя от окрашенного белка с помощью диализа требуется 5—6 дней, на сефадексе G-25 или G-50 такую очистку удается осуществить менее чем за 1 час. При этом, можно пользоваться очень [c.143]

После того как смесь белков будет освобождена от малых молекул в ходе диализа, белки можно рассортировать по их размерам при помощи гель-фильтрации. В ходе этой операции, представляющей [c.144]

Растворы белков обладают многими свойствами, которые характерны для лиофильных коллоидных растворов. Молекулы белков не проходят через полупроницаемые мембраны, и это используется для их очистки от низкомолекулярных примесей при помощи диализа. Представляет большой интерес определение размеров, формы белковых молекул и молекулярных весов белков. Для этой цели используется целый ряд физико-химических методов. Так, белки в растворах седиментируют в ультрацентрифугах при ускорениях до 200 ООО g , величины констант седиментации колеблются от 1 Ю до 90—100 сек. Коэффициенты диффузии — в пределах от 0,1 10 до 10- 10 средний удельный объем — около 0,75 см г. Размеры и форму (асимметрию) частиц белка определяют, кроме того, методами светорассеяния, двойного лучепреломления в потоке, измерениями вязкости, коэффициента вращательной диффузии, но, по-видимому, наиболее точно — прямым наблюдением в электронном микроскопе в тех случаях, когда молекулы белка достаточно велики и когда удается преодолеть технические затруднения. Молекулярные веса, кроме названных выше способов, определяют методами осмометрии, гель-фильтрации, исследованием монослоев белков на поверхности жидкой фазы, светорассеяния и др. [c.30]

Число связывающих центров и их сродство можно определить прямыми методами, такими, как равновесный диализ [2] или хроматографическая гель-фильтрация [3]. Во всех исследованиях такого типа число связанных ионов металла определяется непосредственно анализом концентрации комплекса металла с белком как функции равновесной концентрации свободного иона металла. При изучении связывания с металлом особенно важны значения pH как для получения достоверных данных, так и для их интерпретации (разд. 3), и в зависимости от цели исследования значения pH могут поддерж иваться постоянными или изменяться. По возможности следует избегать большинства буферов из-за конкуренции между белком и буфером за металл, а также из-за возможности образования тройного комплекса, включающего металл, белок и буфер [4]. Со спосо бами обработки первичных данных с целью определения числа различных центров связывания и оценки их сродства можно ознакомиться в специальных руководствах [c.275]

Для разрушения пептидной части гликопротеинов широко применяется протеолиз, особенно часто под действием проназы (обычно из 81гер1от св5 г15тч), которая является набором мощных протеиназ, способных разрушать пептидные цепи, устойчивые к другим протеолитиче-ским ферментам. Часто употребляются также трипсин, химотрипсин, па-паин. Гидролизат, полученный после обработки протеиназами, подвергают фракционированию с применением диализа, гель-фильтрации и хроматографии (см., например, ), выделяя один или несколько низкомолекулярных гликопептидов, структуру которых устанавливают обычными методами и иногда подтверждают встречным синтезом. Впервые гидролиз гликопротеина трипсином был применен Нейбергером для выделения фрагмента овальбумина, содержащего узел связи олигосахаридной и пептидной части молекулы в дальнейшем для этой же цели использовали также химотрипсин, пепсин и другие фepмeнты " . . Протеолиз проназой очень широко применялся при выделении узловых фрагментов из 7-глобулина , тиреоглобулина фибриногена и особенно му- [c.571]

В соответствии с данным выше определением в последующих примерах речь идет о разделении веществ, сильно различающихся по молекулярному весу. Именно благодаря гель-фильтрации раздёление на пористых гелях успешно конкурирует с давно применяющимся диализом. По сравнению с диализом гель-фильтрация обладает тем преимуществом, что эксперимент не требует столь длительного времени, а если умело подобрать условия, то время разделения не зависит от количества смеси. Этот фактор может оказаться решающим при изучении лабильных природных соединений. Единственный довод против гель-фильтрации— это возможное разбавление высокомолекулярного компонента (при диализе этого не происходит). Однако разбавление имеет место лишь в том случае, когда объем образца не соответствует объему геля. Точное соблюдение объемных соотношений (см. гл. П1) может оказать решающее влияние на успешное разделение. (Далее это положение поясняется на конкретном примере, см. фиг. 22.) [c.135]

Получение вирусов из фракций градиентов. На последней стадии очистки необходимо удалить вещество, образующее градиент. На промежуточных стадиях обычно достаточно развести содержащие вирус фракции равным объемом буферного раствора, чтобы материал можно было непосредственно наносить на следующий изопикнический градиент. Поскольку для зонального центрифугирования объем образца должен быть небольшим, разведение фракций предыдущего градиента в этом случае, как правило, невозможно поэтому предпочтительно проводить зональное центрифугирование перед изопикническим, если используемая схема очистки включает оба варианта центрифугирования. Полного удаления вещества, образующего градиент, достигают диализом, гель-фильтрацией через колонку с сефадексом G-50 или разведением с последующим ультрацентрифугированием. Диализ очищенного материала проводят в нескольких сменах подходящего буферного раствора (например, GTNE, хотя в некоторых случаях для последующего использования очищенного вируса может потребоваться другой буфер). Колонку с сефадексом уравновешивают, пропуская через нее пятикратный по отношению к образцу объем того буферного раствора, в котором должен быть растворен очищенный вирус. Появление вируса в свободном объеме колонки при элюции регистрируют по поглощению в ультрафиолете или [c.103]

Необходимо проверить его полную растворимость в смеси орга нических растворителей с водой или буфером для всех пропорций этой смеси, образующих градиент элюцип. Исходный раствор препарата следует отфильтровать через фильтр с отверстиями размером не более 0,5 мкм. Препарат должен быть по возможности растворен в исходном элюенте, которым уравновешена колонка, поэтому па предшествующих этапах очистки препарата желательно х спользо-вать летучие буферы и удалять их лиофилизацией. Если в препарате содержатся нелетучие соли, их следует убрать диализом или гель-фильтрацией. Моя<но использовать предколонку для защиты основной колонки. [c.193]

Малые моноламеллярные Л. получают из многослойных при обработке их ультразвуком, при впрыскивании спиртового р-ра липидов в волную среду, продавливанием под большим давлением воднолипидных дисперсий через небольшое о1верс1ие, а также удалением детергента, солюбилизирующего липид, диализом или гель-фильтрацией. Такие Л. содержат 0,2-1,5 л воды на 1 моль липида. Малые [c.604]

Диализ [121] и ультрафильтрация [122] основаны на применении в качестве полупроницаемого барьера тонкой мембраны (например, из ацетата целлюлозы — целлофана), имеющей поры диаметром 1—10 нм (чаще всего 5 нм). Малые молекулы такая мембрана пропускает, а крупные задерживает. Диализ определяется диффузией, и его можно ускорить перемешиванием раствора, а скорость фильтрования зависит от разности давлений по разные стороны мембраны. Более сложный характер имеет гель-фильтрация [123]. Колонку наполняют материалом типа декстрана с большим числом поперечных сшивок (сефадекс ) . обычно он имеет вид спрессованных мягких шариков. Шарик представляет собой трехмерную сеть из углеводных цепей (рис. 2-18). Пространство между цепями (оно зависит от числа сшивок, образующихся в геле при его химической обработке) недостаточно для проникновения туда крупных молекул, но в нем вполне могут задерживаться малые молекулы. При пропускании через такую колонку смеси разных моле- [c.162]

В тех случаях, когда это возможно, первая стадия включает солюбилизацию в водном илн апротонном растворителе, например в этиленгликоле или диметилсульфоксиде эту операцию необходимо проводить с осторожностью, чтобы быть уверенным, что в условиях данного метода и при применении выбранного растворителя макромолекулы не модифицируются и не разрушаются. Лоэтому на данной стадии нельзя применять кислоты, основания или ферменты. Низкомолекулярные примеси легко удаляются диализом (разделение по размеру молекул), ионообменной хроматографией (разделение по заряду молекул) или гель-фильтрацией (разделение по размеру молекул) (см. разд. 26.3.2.6). Последние два метода широко применяются также для отделения макромолекулярных примесей. Макромолекулы выделяют из раствора [c.216]

Реакцию цитраконилирования проводят так же, как и реакцию малеинирования, в 8 М растворе мочевины, содержащем 10 мг/мл белка, в автотитраторе. Величина pH поддерживается на постоянном уровне с помощью непрерывной подачи 10%-ного раствора NaOH. К раствору белка в три приема при тщательном перемешивании прибавляют 30 молярных эквивалентов цитраконового ангидрида (в расчете на количество аминогрупп). В конце реакции смесь обессоливают диализом или гель-фильтрацией. [c.112]

Лучший результат (6-кратное увеличение активности) был получен при хроматографировании на геле фосфата кальция (рис. 36.5), иногда в сочетании с гель-фильтрацией. Сорбент получали по модифицированной методике Тизелиусй [58, 59]. Фракции, содержаш,ие фермент, объединяли, диализовали в присутствии мочевины и меркаптоэтанола. Данные электрофореза [c.18]

Пигменты вина выделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-25 в водно-спиртовой НС [86] или в водном ацетоне [87]. Полимерные фракции легко отделялись в виде узкой зоны, однако ввиду сильной адсорбции полного разделения антоцианов не достигли. Хорошее разделение антоцианов получено при распределительной хроматографии на сефадексе в системе -бутанол—уксусная кислота—вода (4 1 5) [88]. При работе в препаративных масштабах этому методу свойственны те же недостатки, что и хроматографии на порошкообразной целлюлозе. Антоциан, полученный при диализе пигмента ирИса Prof. Blaauw , был очишен на сефадексе LH-20 (колонка 1,5x30 см) в подкисленном метаноле (1% НС1) при скорости подачи 1 мл/мин [89]. [c.131]

Само собой разумеется, что методом гель-фильтрации можно обессоливать не только белки, но также и любые высокомолекулярные водорастворимые соединения. Так, например, удается полностью удалить соли (и фенол) из суспензий различных вирусов [5]. Наличие ионов хлора мешает, например, количественному определению гуминовых кислот [6] или мукопо-лисахаридов (гепарин) [7]. Их можно легко отделить на сефадексе 0-25. Кроме того, в этом случае выход лабильных полисахаридов значительно выше, чем при диализе [7]. Опыт по разделению растворимых компонентов семян злаков показывает, какие количества исследуемого материала могут быть обработаны в определенных условиях за один прием [8]. [c.139]

При групповом разделении методом гель-фильтрации удается в значительной мере избежать разбавления, если учитывать объемные соотношения, подробно рассмотренные в разделе Обессоливание . При очистке суспензии вируса (выделенного из столовой свеклы) от сопутствующих пигментов путем гель-фильтрации на 4—6-кратном (по отнощению к объему образца) объеме сефадекса 0-75 разделение составляло лишь 20—30% [14]. Свободные от белков катехоламины — адреналин и норадреналин — были выделены без разбавления из 20 мл сыворотки (27% объема колонки) гель-фильтрацией на сефадексе 0-25 (2X25 сж, 78 мл) [15]. Кислюк [16] показал, что с помощью гель-фильтрации на сефадексе 0-50 удается гораздо легче отделить фермент от его кофакторов, чем с помощью диализа. Таким путем удается получить кофакторы в сравнительно небольшом объеме и изучить эффект их вторичного присоединения к ферменту. После гель-фильтрации был выделен совершенно неактивный белок, активность которого вновь восстанавливалась (до 86% исходной) после добавления низкомолекулярной фракции. При диализе активность фермента снижалась только до 38% [16]. Групповое разделение гель-фильтрацией оказалось чрезвычайно удобным методом отделения низкомолекулярных антигенов от антител. Диссоциацию комплекса антиген — антитело часто осуществляют, добавляя избыток гаптена, который затем можно легко отделить от белка гель-фильтрацией [17]. В бактериологии гель-фильтрация на сефадексе 0-75 или биогеле Р-100 может служить для удобного выделения экстрацеллюлярных токсинов. Перед засевом культуральную среду освобождают от высокомолекулярных примесей гель-фильтрацией. Затем на той же колонке после удаления бактерий можно вновь отделить высокомолекулярные токсины от культуральной среды [18]. [c.142]

Для сорбции лучше всего образец выделяемого вещества растворять непосредственно в буфере, из которого будет производиться сорбция, и, если необходимо, проводить замену состава солей, присутствующих в образце, с помощью диализа или гель-фильтрации. Если вещество, образующее в данных условиях прочный комплекс с иммобилизованным аффинным лигандом, выделяют колоночной хроматографией, то объем образца, вводимого в колонку, может быть любым. Однако, если выделяют аффинной хроматографией вещество с низким сродством к связанному аффинному лиганду, объем наносимого образца не должен превышать 5% удерживаемого объема, для того чтобы предотвратить элюирование выделяемого вещества неадсорбированным материалом. Если выделяют вещество с низким сродством к связанному аффинному лиганду, его элюирование с колонки происходит часто даже без замены буфера. В этом случае выделяемое вещество получают в разбавленном растворе. Для иллюстрации сказанного можно сопоставить хроматографию химотрипсина на сефарозе с присоединенным метиловым эфиром е-аминокапронил-О-триптофана с хроматографией этого же вещества на сефарозе с непосредственно связанным метиловым эфиром О-триитофаиа (рис. 5.4) [8]. Для элюирования химотриисина с нерастворимого носителя, на котором ингибитор укреплен через е-аминокапроновую кислоту в качестве прострапственной группы, необходимо изменение pH, при этом фракция химотрипсина элюируется в виде острого пика. Если ингибитор присоединен непосредственно к нерастворимому носителю, его пространственная доступность понижена, и химотрипсин только замедляет свое движение через колонку. Фермент элюируется в значительно большем объеме, при том же pH, в непосредственной близости к неактивному материалу. [c.264]

Если аффинный лиганд присоедипен к матрице с помощью азосвязи или сложноэфирными связями тиолов или спиртов, с нерастворимой матрицы можно снять комплекс аффинного лиганда с выделяемым веществом, а затем аффинный лиганд отделить диализом или гель-фильтрацией. Этот способ, однако, не позволяет повторно использовать аффинную матрицу. Носители такого типа детально обсуждены в разделе о ковалентной хроматографии (разд. 7.2). [c.272]

Для отделения белков от амфолитов-носителей и сахарозы существует ряд методов а) гель-фильтрация на сефадексе или био-геле [123] б) исчерпывающий диализ в течение нескольких суток против разбавленного солевого раствора. Описание аппаратуры для диализа большого числа образцов приводится в работах Раста [22] и Теппана [23] в) ультрафильтрация [124] на мембранах фирмы Аткоп (США) г) осаждение белка сульфатом аммония [125]. [c.306]

Многие из общих подходов к исследованию механизма действия ферментов также применимы и к изучению роли ионов металлов в ферментативном катализе. Схемы координации, описывающие взаимодействие фермента, металла и лиганда, могут быть изучены методами, применяемыми при определении стехиометрии и сродства связывания белками небольших молекул. Эти методы включают гель-фильтрацию в присутствии или в отсутствие небольших молекул [49], метод скоростного диализа [50], ультрафильтрацию, метод ультрацентрифугирования по Хейесу — Велику [52], равновесный диализ [53], а также методы для измерения только сродства взаимодействия [54—58]. Выбор схемы координации ионов металлов и лигандов с ферментами с помощью этих методов возможен только при отсутствии влияния других факторов. Например, если образуется комплекс Е — лиганд — М +, фермент должен проявлять значительное сродство к иону металла только в присутствии лиганда. И, наоборот, если образуется комплекс Е — М + — лиганд, то не должно происходить значительного связывания лиганда в отсутствие иона металла. Однако практически ферменты часто проявляют склонность к связыванию обоих компонентов комплекса, невзирая на выбранную схему координации. Следовательно, важны данные, полученные с учетом стехиометрических и кинетических критериев. Такие важные типы комплексов, как Е — лиганд — М + и Е — М + — лиганд, обычно содержат все три компонента в эквимолярных количествах. Более [c.449]

Скорость диффузии растворенного материала в инертную незаряжен ную трехмерную структуру зависит как от размера пор этой структуры, так и от размеров молекул диффундирующего вещества. Это явление служит основой для проявления эффекта молекулярных сит [1], который изменяется в тех случаях, когда материал сита содержит ионные группы, как в ионообменных смолах, или при взаимодействии диффундирующего вещества с ситом за счет адсорбции или комплексообразования. С практической точки зрения желательно, чтобы сито имело либо форму мембраны, что используется при проведении диализа (стр. 299) и не будет здесь рассматриваться, либо форму колонки из дискретных частиц. Наиболее удобным материалом для этого последнего применения является сефадекс — поперечно сшитый декстран разной степени пористости. Методика разделения аналогична методике хроматографирования на колонках и называется гель-фильтрацией [2] (см. стр. 273). [c.280]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология