Вязкость поляризация флуоресценции

Как известно, молекулы в растворе находятся в непрерывном хаотическом движении. Если за время пребывания в возбужденном состоянии молекулы не успеют повернуться на значительный угол, то приобретенная анизотропия раствора не будет утрачена. Поэтому очевидно, что поляризация флуоресценции должна иметь место только у вязких растворов. 11 должна существенно зависеть от вязкости. [c.333]

В диапазоне от -f-20 до —ЮО " С поляризация флуоресценции (т = 10 с) малых молекул в растворителях низкой вязкости изменяется от низких значений до высоких, и, следовательно, [c.372]

Флуоресцирующие материалы часто вводятся в состав пластмасс для увеличения яркости окраски. В этом случае поляризация флуоресценции равна степени ро, соответствующей замороженному беспорядочно-ориентированному состоянию. При растяжении пленки или волокна степень поляризации увеличивается вдоль направления растяжения [41]. Аналогичный эффект наблюдался также при окрашивании флуоресцирующими красителями высокоориентированных волокон, таких, как волокно рами [42—44 ]. Степень поляризации в направлении растяжения увеличивается с увеличением процента удлинения, а в перпендикулярном направлении уменьшается [37], что скорее указывает на большую ориентацию молекул красителя, чем на простое увеличение локальной вязкости. Такие работы по изучению флуоресцентной поляризации дополняют метод дихроизма, но не требуют полу- [c.185]

Принцип метода поляризации флуоресценции заключается в следующем скорость выхода флуоресцентного красителя, связанного с белковой молекулой из плоскости поляризации возбуждающего флуоресценцию света, зависит при постоянной вязкости и температуре раствора от объема молекулы. Поэтому по зависимости параметра, характеризующего эту скорость, от вязкости раствора можно рассчитать эффективный радиус Стокса или эффективный объем моле -сулы. Они непосредственно связаны с временем корреляции молекулы. Подробнее об этом параметре сказано ниже. [c.14]

Свет, испускаемый возбужденными молекулами немедленно после его поглощения, всегда частично поляризован независимо от того, был ли плоскополяризован возбуждающий свет. Со временем, после того как молекулы примут беспорядочную ориентацию, поляризация люминесцентного излучения исчезает. Зная степень деполяризации флуоресценции, можно получить ценную информацию о скорости вращения макромолекул, с которыми связан флуоресцирующий хромофор, а также о подвижности хромофорных групп внутри макромолекулы, клеточной мембраны и т. д. [52, 53, 55, 61]. Скорость вращения, получаемая из данных по измерению степени поляризации, сильно зависит от вязкости [c.30]

Следовательно, поляризация определяется, с одной стороны, временем жизни возбужденного состояния т, а с другой — вязкостью и температурой раствора, объемом и формой молекул. Если среднее время вращательной релаксации молекул (т. е. среднее время поворота на 90°) равно или меньше т, то флуоресценция полностью деполяризована. Максимальная (предельная) поляризация имела бы место при полном отсутствии броуновского движения. [c.337]

Основываясь на измерениях поляризации в четырех растворителях различной вязкости, Перрен [11] нашел, что время жизни флуоресценции хлорофилла составляет 3 10-8 сек. [c.162]

Для измерения абсолютной величины локальной вязкости поляризационным ме тодом нет необходимости в определении квантового выхода флуоресценции. Следовательно, измеряемые относительные величины перпендикулярных и параллельных компонентов интенсивности флуоресценции дают степень поляризации р [согласно уравнению (У-6)]. Если графически представить зависимость у от Т/г), при использовании низкомолекулярного растворителя получается прямая, отсекающая на оси отрезок, равный искомой величине ро флуоресцирующего вещества. Наклон В прямой определяется из следующего соотношения [c.180]

Перреном и Яблонским установлена связь между степенью поляризации (Р) флуоресценции и вязкостью среды (т ) [c.212]

Это так называемые уравнения Перрена. При подстановке выражения для времени вращательной корреляции (г ) использовано уравнение (8.73). Именно эти выражения для степени поляризации и анизотропии чаще всего применяются на практике. При этом исследуют зависимость стационарной поляризации или анизотропии раствора макромолекул от температуры Т или вязкости ч. При графической обработке данных, проводимой в соответствии с уравнениями (8.80) и (8.81), должна получиться прямая, из наклона которой находят молекулярный объем (У щр) при условии, что известно время затухания флуоресценции (тр). Пересечение прямой с осью ординат при Г/ч — О дает предельную анизотропию или поляризацию. На рис. 8.24 приведен соответствующий график для химотрипсина. Предельное значение степени анизотропии (=0,3) свидетельствует о практически жестком закреплении флуоресцентной метки. Время вращательной корреляции (15 не) согласуется со значением, полученным из данных по измерению зависимости спада степени анизотропии от времени. Экспериментально найденное значение достаточно близко к теоретическому, оцененному ранее для жесткой сферической белковой молекулы. [c.111]

Адзуми и Мак-Глинн [64] описали другие методы корректировки. Один из этих методов основан на том, что при довольно малой вязкости растворителя и большом времени испускания наблюдается полная вращательная деполяризация. Они измерили кажущуюся поляризацию флуоресценции 10 М раствора фенантрена в метилциклогексане и нашли, что Рц и / х меняются с изменением длины волны как монохроматора возбуждения, так и монохроматора люминесценции. Однако при постоянной длине волны монохроматора люминесценции отношение Яц/Я остается постоянным по всему спектру возбуждения. Они сделали вывод, что в действительности флуоресценция была не-поляризована и что изменение / ц и / х вызвано прибором. В этом случае отношение Я /Р равно требуемой величине Т. [c.283]

Несмотря на большое значение, которое представляет знание длительности возбужденного светом состояния молекулы хлорофилла для изучения первичных фотохимических процессов при фотосинтезе, до настояш его времени не было проведено измерений этого времени наиболее надежными прямыми методами [1]. Время жизни х возбужденных молекул хлорофилла было оценено Перреном [2] и Ступпом и Куном [3] с помоп1 ью измерений относительной степени поляризации флуоресценции в растворителях различной вязкости. Полученные значения (3-10 и 1.5 X Х10 сек.), деленные на известный квантовый выход (приблизительно 0.25) позволяют оценить верхний предел естественного времени жизни 0 хлорофилла в растворах. Это последнее может [c.414]

Изучение вращения макромолекул позволяет получить параметры, связанные с и т , но, к сожалению, ни один из перечисляемых ниже методов ЯМР, дихроизм в электрическом поле, двойное лучепреломление в потоке, диэлектрическая релаксация и поляризация флуоресценции — не позволяет определить и т , прямым способом. В некоторых случаях и т определяются одновременно с некоторыми другими величинами, о которых нет количественных данных. Определение т ит/,с помощью метода, основанного на поляризации флуоресценции, представляет огромные трудности. Затухание анизотропии определяется не только величинами и этот процесс определяется рядом экспонент, в коэффициенты которых помимо прочих факторов вносит вклад ориентация флуоресцентных зондов относительно главных осей эллипсоида (гл. 8). Другие методы, такие, как метод статистической политизации флуоресценции или неньютоновской вязкости, позволяют определить только среднюю гармоническую величину Тд и т ,. Для вытянутого эллипсоида гкдр ], и соответствующее среднее значение вращательного коэф- [c.200]

Если возбуждение флуоресценции происходит в диапазоне главной полосы поглощения и энергия не теряется в результате межмолекулярных взаимодействий, то степень поляризации флуоресценции зависит от броуновского движения. Маленькие молекулы в водной среде вращаются очень быстро и между поглощением и эмиссией равновероятно принимают любую ориентацию, что приводит к полной дешхпяризации сигнала эмиссии. Так, в водном растворе флуоресценция флуоресцеина практически неполяризова-на, однако при повышении вязкости раствора степень ее поляризации возрастает. , [c.141]

Работа флуоресцентной системы детектирования зависит от нескольких параметров (Soini, Hemmila, 1979). Правильно выбрав длины волн возбуждения и испускания, можно уменьшить помехи и увеличить отношение сигнала к фону. Вещества, не способные к флуоресценции, под действием фермента превращаются в флуоресцирующие продукты. Детектирование может быть основано и на туш(ении флуоресценции субстрата. Оптимизация температуры, pH, состава раствора, ионной силы и вязкости позволяет усилить сигнал, а также улучшить характеристики работы фермента. При создании системы детектирования могут оказаться полезными такие инструментальные приемы, как поляризация флуоресценции и разрешение по времени. [c.162]

Пример 15-Т. Определение вязкости внутри живых клеток.. Если флуоресцирующая молекула очень быстро по сравнению со временем жизни возбужденного состояния меняет свою ориентацию, то поляризации флуоресценции не будет или она будет очень слабой (следствие 1 в табл. 15-2). Однако, если она находится в очень вязкой среде, так что ее движение сильно замед ленно, поляризация будет наблюдаться. При приблизительно известном времени жизни флуоресценции (и, действительно, времена жизни могут быть измерены) можно определить вязкость среды. Отметим, что в данном случае мы не рассматриваем свойства макромолекулы, а лишь определяем вязкость жидкости, чего нельзя сделать путем прямых вискозиметриче-ских измерений. Была измерена внутриклеточная вязкость в асцитных клетках мыши и в бактерии Е, соИ, причем предварительно эти клетки поглотили флуоресцирующую аминокислоту, аминонафтилаланин. Появляется небольшая поляризация так как известно, что эта аминокислота не связывается ни с какими большими молекулами в клетках, наблюдаемую поляризацию можно использовать для подсчета внутриклеточной вязкости. Это представляет интерес, поскольку появляется возможность оценить скорости диффузии в пределах клетки и определить, могут ли некоторые реакции, лимитируемые диффузией, входить в последовательности реакций, которые составляют различные регуляторные метаболические пути. [c.444]

Флуоресцентный поляризационный анализ может быть использован для количественного определения коэффициентов враща-тельной диффузии. Применение для этой цели стандартного метода измерения поляризации флуоресценции имеет два неудобства 1) с его помощью измеряется усредненная величина, что нежелательно, когда молекула имеет два вращательных коэффициента (например, палочкообразная молекула может вращаться вокруг своей длинной оси или переворачиваться так, что вверху оказывается то один конец, то другой), и 2) он требует измерения собственной поляризации, что выполняется путем изучения поляризации в растворах с возрастающей вязкостью и экстраполяции к бесконечной вязкости. Такая экстраполяция часто не имеет успеха, потому что вещества, добавляемые для увеличения вязкости, иногда оказывают влияние на конформа- [c.444]

Физико-химические методы анализа близко подходят к физическим методам, основанным на измерении только физических свойств вещества. И в физических, и в физико-химических методах используют разнообразную аппаратуру, поэтому их объединяют под общим названием инструментальных методов. Измеряют такие свойства, как теплоты реакций, плотность, поверхностное натяжение, вязкость, показатели преломления,. иолуэлектродные потенциалы, электрическую проводимость, флуоресценцию, вращение плоскости поляризации, помутнение, из-,лучение радиации, поглощение лучистой энергии и др. [c.327]

Таким образом, если поляризация и вязкость раствора измерены в интервале температур, в котором изменения т малы (как это имеет место для многих веществ с высокой эффективностью флуоресценции прп комнатной температуре, см. раздел II, Б, 5), то график зависимости lip от Т/г будет представлять собой прямую линию с наклоном (1/ро + Уз) т/У и отсечением 1/Ро. Следовательно, из этих данных можно определить как ро (при этом не обязательно проводить измерения при очень низких температурах), так и молярный объем V. Если т сильно зависит от температуры (например, в случае Г] 5о-фосфоресцепции в жидких средах), то для получения прямой линии по оси абсцисс нужно откладывать величину тГ/т]. Больщинство молекул не являются строго сферическими, но обычно и для них график зависимости 1/р от Т/г представляет собой достаточно хорощую прямую, из которой можно найти эффективный молярный объем V [308]. [c.372]

Диапазон температур и вязкостей, в котором происходят заметные изменения поляризации, определяется отношением RTxIVx]. При больших временах жизни, при высоких температурах и в растворителях с низкой вязкостью испускание будет почти полностью деполяризовано, а р будет слишком мало для того, чтобы его можно было измерить. При малых т и Г в сильно вязких растворителях р будет практически постоянным и равным ро. Поэтому полезно выяснить, какими могут быть значения р при разных условиях и какие значения четырех параметров (Т, t, V, т)) дают поляризации, заметно отличающиеся от ро и от нуля. В табл. 43 приведены некоторые данные для типичной малой флуоресцирующей молекулы, имеющей молярный объем порядка 500 см (флуоресцеин), и для большой полимерной молекулы с V = 5-10 см (белок). Времена жизни соответствуют флуоресценции (10 с) и фосфоресценции (Ю с). [c.372]

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА — условное название большого числа колич. методов анализа, основанных на измерении различных физич. свойств соединений илп простых веществ с пспользованием соответствующих приборов. Измеряют плотность, поверхностное натяжение, вязкость, поглощение лучистой энергип (рентгеновских лучей, ультрафиолетового, видимого, инфракрасного излучений и микроволн), помутнение, излучение радиации (вследствие возбуждения), комбинационное рассеяние света, вращение плоскости поляризации света, показатель преломления, дисперсию, флуоресценцию и фосфоресценцию, дифракцию рентгеновских лучей п электронов, ядерный и электронный магнитный резонанс, полуэлектродпые потенциалы, потенциалы разложения, электрич. проводимость, диэлектрич. постоянную, магнитную восприимчивость, темп-ру фазовых превращений (темп-ра кипения, плавления и т. п.), теплоты реакцпп (горения, нейтрализации и т. д.), теплопроводность и звукопроводность (газов), радиоактивность и другпе фпзпч. свойства. В настоящее время все чаще фпзико-химич. методы анализа называют (более правильно) инструментальными методами анализа. [c.214]

В данном выражении Pq обозначает поляризацию флуоресцирующего пучка, когда флуоресцирующая молекула вращаться не может, а Хгп — среднее гармоническое время релаксации, выражаемое в виде == = 2тгТг/(Тг + т г), где %г и i r — времена релаксации вращения вокруг экваториальной оси и оси симметрии соответственно. Значение Ро может быть получено путем измерения деполяризации флуоресценции в среде с возрастающей вязкостью и линейной экстраполяции зависимости Р от до значения r = 0 [724]. Для сфер Тг = = Ггн, и, следовательно, в соответствии с уравнениями (VI-24), (VI-25) и (VI-43) Хгп пропорционально объему частицы. Для очень вытянутых эллипсоидов вращепия гидродинамическое сопротивление намного меньше при вращении вокруг оси симметрии, чем при вращении вокруг экваториальной оси, и, таким образом, Тг > Тг, а t,./i 2х г, для частиц равного объема с увеличением осевого отношения р будет возрастать, но очень медленно [723]. Следует отметить, что это явление находится в резком противоречии [c.251]

Может оказаться, что полученное значение степени анизотропии меньше, чем теоретически рассчитанное для сферической молекулы известной молекулярной массы. Это обстоятельство указывает на гибкость макромолекулы как целого или на нежесткое присоединение хромофора к макромолекуле. Иногда эти эффекты можно различить, если провести поляризационные измерения при высоких значениях Т/г . 1 гидр хромофора составляет приблизительно 1% или меньше от объема типичной макромолекулы. Если хромофор свободно сочленен с макромолекулой, его время вращательной корреляции будет составлять примерно /100 от соответствующего времени для макромолекулы. При низкой вязкости за небольшой по сравнению с характерным временем затухания флуоресценции период времени хромофор успевает принять все возможные ориентации. Если угол, на который поворачивается хромофор, достаточно велик, наблюдаемая поляризация будет равна нулю. Если, однако, быстрое движение хромофора происходит в ограниченном диапазоне углов вращения, некоторая остаточная поляризация все же будет наблюдаться. Чтобы хромофор смог принять все возможные ориентации, он должен участвовать в движении макромолекулы как целого. Таким образом, при низкой вязкости зависимость остаточной поляризации от Г/т будет отражать движение макромолекулы. Экстраполяция графика зависимости Р от Г/т к Г/т — О позволяет найти конус углов, в котором происходит быстрое движение хромофора. [c.111]