Хромофоры флуоресцирующие

Свет, испускаемый возбужденными молекулами немедленно после его поглощения, всегда частично поляризован независимо от того, был ли плоскополяризован возбуждающий свет. Со временем, после того как молекулы примут беспорядочную ориентацию, поляризация люминесцентного излучения исчезает. Зная степень деполяризации флуоресценции, можно получить ценную информацию о скорости вращения макромолекул, с которыми связан флуоресцирующий хромофор, а также о подвижности хромофорных групп внутри макромолекулы, клеточной мембраны и т. д. [52, 53, 55, 61]. Скорость вращения, получаемая из данных по измерению степени поляризации, сильно зависит от вязкости [c.30]

ГО полосу поглощения с тах = 430 нм (23 300 СМ ) и флуоресцирующего при еще меньших длинах волн [52, 70]. Поскольку Ктах флуоресценции равна 530 нм, был сделан вывод, что хромофор имеет структуру Б. [c.35]

Интенсивность флуоресценции обычных оснований нуклеиновых кислот очень мала, хотя некоторые минорные основания (например, основание V) флуоресцируют достаточно сильно, что позволяет проводить рутинные измерения. Слабость собственной флуоресценции оснований поначалу обескураживала, но во многих случаях она обернулась благом. Один из подходов к решению подобной проблемы состоит в присоединении к системе флуоресцентной метки — интенсивно флуоресцирующего хромофора, который специфически связывается с исследуемым объектом или ковалентно присоединяется к нему. [c.93]

Рассмотрим вначале жесткую изотропную систему такой системой может быть, например, замороженный раствор флуоресцирующих молекул или хромофоры, жестко связанные с хаотически ориентированными молекулами столь большого размера, что за времена, характерные для флуоресценции (обычно < 100 не), не происходит заметных молекулярных вращений. Обозначим через ц вектор момента перехода для поглощения i i дУ) одного хромофора в лабораторной системе координат. Вероятность того, [c.104]

Исследование структуры белков. Поскольку некоторые белки содержат флуоресцирующие хромофоры, например тирозин и ФАД, по изменению их флуоресценции можно исследовать связывание белков с такими веществами, как ингибиторы, коферменты и аллостерические факторы. С помощью флуоресценции исследуют также конформацию и полимеризацию белков. [c.162]

При флуоресцентном анализе макромолекул используются два типа флуоресцирующих хромофоров собственные флуоресцирующие хромофоры (содержащиеся в самих макромолекулах) и внесенные флуоресцирующие хромофоры (добавленные в систему и обычно связывающиеся с одним из компонентов). Вначале рассмотрим собственную флуоресценцию. [c.421]

Белки содержат только три собственных флуоресцирующих хромофора — остатки триптофана, тирозина и фенилаланина (перечислены в порядке убывания Q). Флуоресценцию каждого из них можно отличить по соответствующей длине волны, при которой она возбуждается и при которой она наблюдается. На практике больше всего изучают флуоресценцию триптофана, потому что фенилаланин имеет очень низкий Q, а флуоресценция тирозина часто очень слаба из-за тушения. Флуоресценция тирозина почти полностью потушена, если он ионизован или расположен недалеко от аминогруппы, карбоксильной группы или триптофана. В особых ситуациях, однако, ее можно обнаружить, проводя возбуждение при 280 нм. [c.421]

Рассмотрим систему, содержащую два флуоресцирующих хромофора (/ и 2), спектры поглощения и испускания которых показаны на рис. 15-10. Чтобы измерить спектр возбуждения (или действия) флуоресценции, выбирается длина волны (например, Яз), лежащая в спектре испускания (например, в максимуме) [c.431]

Спектры двух флуоресцирующих хромофоров (сплошные кривые представляют спектры поглощения или возбуждения, а штриховые линии — спектры испускания). [c.432]

Отметим, что при наличии переноса энергии происходит уменьшение интенсивности флуоресценции хромофора I (возбуждение проводят при длине волны, лежащей в спектре поглощения хромофора 1), Ясно, что это своего рода тушение, особенно в том случае, если молекула акцептора не является флуоресцирующим хромофором. Однако перенос энергии легко обнаружить, снимая полный спектр флуоресценции, потому что будет видно (рис. 15-10, Д), что спектр флуоресценции, возбуждаемый при Яь содержит новую, более длинноволновую полосу. Другими словами, нужно проверять, имеет ли место безызлучательный перенос энергии всякий раз, когда наблюдаемый спектр испускания нельзя отнести за счет возбуждения при длине волны, которую используют для возбуждения данного хромофора. [c.433]

До сих пор рассматривался перенос энергии между различными флуоресцирующими хромофорами, но перенос энергии может также иметь место между идентичными флуоресцирующими хромофорами, поскольку спектры поглощения и испускания хромофора часто перекрываются. Признаком такого переноса служит следующее наблюдение когда в образец вводятся возрастающие количества флуоресцирующего хромофора, интенсивность флуоресценции понижается без понижения поглощения при длине волны возбуждения, т. е. Q уменьшается. (Чтобы это происходило, должны выполняться не только обычные условия, необходимые для переноса энергии, но, кроме того, Q должен быть меньше, чем 1.) Очевидно, что этот вид переноса энергии является своего рода тушением. [c.433]

Важность явления переноса энергии для биохимических исследований состоит в том, что эффективность переноса зависит от расстояния и взаимного расположения флуоресцирующих хромофоров и поэтому может использоваться для измерения расстояний между молекулами. Эффективность переноса энергии 5 описывается следующим уравнением [c.433]

Образование эксимера — явление, зависящее от концентрации, II его можно использовать, чтобы показать наличие высоких локальных концентраций флуоресцирующего хромофора. До сегодняшнего дня оно очень мало использовалось в биохимии, но, несомненно, найдет применение в будущем. Например, путем исследования эксимеров флуоресцирующих хромофоров можно получить информацию о наличии везикулы или какой-то субчастицы, способной концентрировать некоторые вещества. [c.436]

У. Поляризация фактически не проявляется для несвязанных флуоресцирующих хромофоров в растворе, так как они быстро и свободно вращаются Однако, если они связываются с молекулой, имеющей небольшой молекулярный вес, их поляризация возрастает вследствие некоторого уменьшения подвижности [c.440]

Если флуоресцирующий хромофор связан с макромолекулой, поляризация может стать значительной благодаря сильному уменьшению подвижности. Степень поляризации зависит не только от подвижности всей макромолекулы, но также от подвижности места связывания. Например, если флуоресцирующий хромофор интеркалирует между основаниями ДНК, он прочно удерживается на месте, так что его подвижность — это подвижность молекулы ДНК если он связан с длинной боковой цепью аминокислоты, его поляризация будет отражать как подвижность всего белка, так и свободу движения боковой цепи по отношению к полипептидной цепи [c.440]

Если с макромолекулой связан флуоресцирующий хромофор и макромолекула агрегирует (например, димеризуется) или связывается с большой молекулой, поляризация возрастает вследствие понижения подвижности частиц [c.440]

Если с макромолекулой связан флуоресцирующий хромофор, и макромолекула претерпевает конформационную перестройку (например, переход спираль — клубок), поляризация уменьшается, когда молекулярная структура становится более беспорядочной, и увеличивается, когда она становится более упорядоченной [c.440]

Связывание флуоресцирующего субстрата ферментом приводит к увеличению поляризации за счет уменьшения подвижности флуоресцирующего хромофора (следствие 2 в табл. 15-2). Этот эффект является чувствительной пробой на наличие фермент-субстратного связывания и может быть использован для определения тех параметров, измерение которых зависит от точного знания количества связанного субстрата (например, констант связывания, стехиометрии). [c.440]

Пример 15-0. Изучение перехода спираль — клубок в белках. Для некоторых белков отсутствует простой оптический метод наблюдения перехода спираль — клубок. Если к белку можно присоединить флуоресцирующий хромофор (например, АНС) без изменения конформации, появляется возможность, измеряя поляризацию флуоресценции, наблюдать переход спираль — клубок, потому что, когда белок разворачивается, поляризация [c.441]

Пример 15-П. Структура комплекса ДНК —флуоресцирующий хромофор пример определения ориентации красителя по поляризации флуоресценции. Флуоресцирующий хромофор акридиновый оранжевый прочно связывается с ДНК. Так как он является эффективным мутагеном, структура такого комплекса представляет некоторый интерес. Будучи связанным с ДНК, акридиновый оранжевый не подвергается некоторым свойственным ему химическим реакциям (например, реакции диазотирования), на основании чего можно предположить, что он каким-то образом располагается внутри двойной спирали ДНК. Будучи связанным с ДНК, акридиновый оранжевый флуоресцирует не только при возбуждении в области своей собственной полосы поглощения, но также при возбуждении светом, поглощаемым только основаниями ДНК, что указывает на перенос энергии от оснований. Квантовый выход при этом переносе энергии очень велик, так что акридиновый оранжевый (имеющий плоскую структуру) должен находиться очень близко от оснований. Известно направление плоскости поляризации флуоресценции акридинового оранжевого относительно плоскости его колец и длинной оси, так что, если бы систему лишить подвижности, можно было бы, измеряя плоскость поляризации флуоресценции по отношению к молекулам ДНК (используя свет, поглощенный акридиновым оранжевым, а не основаниями), определить ориентацию молекул акридинового оранжевого относительно ДНК. Флуоресценция акридинового оранжевого сильно поляризована, что указывает на значительное уменьшение подвижности. Если бы он в результате связывания не имел возможности перемещаться относительно спирали ДНК, следовало бы ожидать такую низкую подвижность, поскольку ДНК настолько сильно вытянута, что имеет очень низкий коэффициент диффузии. Недоступность диазотиро- [c.442]

Пример 15-С. Определение ориентации ДНК в хромосомах с помощью поляризации внесенной флуоресценции. В примере 15-П было показано, что флуоресцирующий хромофор акридиновый оранжевый интеркалирует между парами оснований ДНК и что его плоскость перпендикулярна оси спирали. Этот краситель также связывается внутри клеток с хромосомами эукариотов, С помощью флуоресцентного поляризационного микроскопа была измерена поляризация флуоресценции акридинового оранжевого относительно оси вытянутых хромосом, и эти данные были [c.443]

Пример 15-Ф. Флуоресцентная микроскопия. Многие флуоресцирующие хромофоры локализованы внутри клеток и могут быть обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии. Образец освещается светом с длиной волны возбуждения, и далее ведется наблюдение через фильтр, который задерживает возбуждающий свет и пропускает флуоресценцию. Акридиновый оранжевый связывается с нуклеиновыми кислотами и флуоресцирует в зеленой или оранжевой области в зависимости от того, связан он с ДНК или РНК соответственно. Это было использовано в случае эукариотов для обнаружения нуклеиновых кислот и хромосом и для обнаружения РНК в ядре в случае прокариотов — для локализации ДНК. (см. гл. 2 и рис. 2-19 и 2-21.) [c.446]

Многие стимулирующие рост растений флуоресцирующие псевдомонады секретируют си-дерофор, представляющий собой линейный гексапептид, который состоит из чередующихся L-и D-аминокислот и связанного флуоресцентного хромофора (рис. 14.8). Один из таких сидерофоров, так называемый псевдобактин, обладает сродством к Fe(III) s 10 л моль . Сходные сидерофоры синтезируют все флуоресцирующие псевдомонады. [c.322]

Присутствие гидрофобных областей в структуре белков доказано экспериментально по данным растворимости углеводородов в растворах белков [283—286] и по интенсификации флуоресценции реагентов типа К—О—5 или А—О—5, связанных или сорбированных в этих областях. На большое значение флуоресценции при таких исследованиях впервые указывали Остер и Нишид-жима [287, 288]. Они подчеркивали, что молекула основания со свободно вращающейся группой хромофора начинает сильно флуоресцировать, если вращение заторможено вследствие адсорбции. Тушение флуоресценции вследствие теплого рассеяния энергии возбуждения за счет внутреннего вращения может быть уменьшено при фиксации планарной молекулы на биополимере. В последнее время подобное увеличение флуоресценции исследуется в связи с наличием в белках гидрофобных областей. Например, при адсорбции 1-анилино-8-нафталинсульфокислоты (АНС) на апомиоглобине и апогемоглобине, свободных от группы гема, флуоресценция группы претерпевает изменения добавление гема восстанавливает первоначальную флуоресценцию [289]. При адсорбции полоса флуоресценции 515 нм смещается в область 454 нм, а квантовый выход увеличивается в 200 раз, от 0,004 до 0,98. Вообще я — л возбужденные состояния я-электрон-ной системы стабилизуются по сравнению с основным состоянием за счет воздействия молекул растворителя в относительно большей степени, так что снятие этого эффекта интенсифицирует флуоресценцию и вызывает смещение в длинноволновую часть спектра. Опыты с модельными соединениями в растворителях с различными дипольными моментами свидетельствуют в пользу такого объяснения. Доказательством наличия в бычьем сыворо- [c.378]

В некоторых случаях возбужденная молекула, сталкиваясь с идентичной невозбужденной молекулой, образует комплекс—эк-симер. При этом из плоских молекул возникают структуры типа сандвича, которые стабилизированы переносом заряда от одной молекулы к другой. На перенос заряда тратится часть энергии поглощенного кванта, поэтому эксимер флуоресцирует в более длинноволновой области. Степень эксимеризации зависит от концентрации хромофора, температуры и вязкости окружающей среды. [c.78]

Тушение флуоресценции иногда представляет собой результат дальней безызлучательной передачи (так называемого резонансного переноса) энергии. В этом случае система содержит два флуоресцирующих хромофора, причем спектр испускания одного из них (донор) должен перекрываться со спектром поглощения другого (акцептор). При наличии переноса энергии интенсивность флуоресценции донора снижается, а акцецтора увеличивается. Эффективность переноса зависит от дистанции между донором и акцептором, и это явление может быть исполь- [c.78]

Если оптически активная система обладает способностью к флуоресценции (см. следующий раздел), то оказывается возможным измерить еще два параметра оптической активности. Предположим, что для возбуждения используется свет с круговой поляризацией, а весь излученный свет удается регистрировать. Поскольку интенсивность излучения пропорциональна количеству поглощенного света, разность интенсивностей излучения, отвечающих возбуждению при помощи лево- и правополяризованного света, будет давать разностный спектр поглощения (в данном случае — КД) только флуоресцирующих хромофоров. Так, например, если молекула белка содержит два остатка триптофана, из которых лищь один является флуоресцирующим, обычный КД будет просто суммой КД обоих этих остатков. КД, регистрируемый по флуоресценции, будет относиться только к одному из остатков триптофана КД другого можно найти путем вычитания. Для возбуждения можно использовать неполяризованный свет, но измерять разность интенсивностей лево- и правополяризованного излучаемого света. Такой подход позволяет получить КД хромофора, отвечающий его конфигурации в возбужденном состоянии, в отличие от всех прочих методов измерения КД, регистрирующих конфигурации основного состояния (см. Steinberg, 1978). [c.84]

Как показано на рис. 8.19, сразу после переноса и донор, и акцептор находятся в возбужденных колебательных состояних, но из-за колебательной релаксации быстро переходят на основной колебательный уровень. Следовательно, даже если константа скорости прямого переноса (А ) очень велика, обратный перенос (А ) едва ли возможен. Резонансный перенос энергии изменяет относительную заселенность возбужденных уровней доноров и акцепторов. Возбуждение донора снимается, а акцептор переходит в возбужденное состояние и, следовательно, может флуоресцировать. Такое излучение акцептора называется сенсибилизированным. Заметим, что хромофоры не обязательно должны принадлежать одной и той же молекуле. Перенос энергии может происходить и между свободными молекулами в растворе, если их концентрация достаточно высока, чтобы среднее меж-молекулярное расстояние было не более 50 А. [c.98]

Остатки пролина образуют полипролин со спиралью типа II, что подтверждается измерением КД. Поскольку расстояние между донором (нафтилом) и акцептором (дансилом) легко вычислить из известных размеров спирали, измеренные значения эффективности переноса можно непосредственно сравнивать с рассчитанными по теории Фёрстера согласие теории с экспериментом оказалось великолепным (рис. 8.20). После этой пионерской работы перенос энергии был использован для определения расстояния между хромофорами в молекулах тРНК, иммуноглобулинах, родопсине и олигопептидах, а также между белковыми субъединицами в различных ассоциатах — от простых олигомерных белков до рибосом. Самое трудное в этих экспериментах — специфическое включение в исследуемую структуру двух флуоресцирующих хромофоров. Чтобы провести полный набор измерений, необходимо приготовить три образца. Они должны быть по возможности идентичными и различаться лишь тем, что один содержит только донор, другой — донор и акцептор, а третий — только акцептор. [c.103]

Помимо анализа молекулярного движения поляризационные исследования могут использоваться также для обнаружения синглет-синглетного переноса энергии. Предположим, что белок или нуклеиновая кислота содержат два или более идентичных флуоресцирующих хромофора. При возбуждении одного из них может произойти передача энергии на Другой хромофор еще до испускания. Если хромофоры не параллельны, то излучающий диполь уже не будет параллелен поглошаюшему. Согласно уравнению (8.64), степень поляризации системы изменится. Если спектры флуоресценции хромофоров сдвинуты да- [c.112]

Молекулярные маяки . Третий тип зондов, используемых для обнаружения специфических продуктов ПЦР в реальном времени, получил название молекулярных маяков (mole ular bea ons) [305, 306] (рис. 23, б). Такие олигонуклеотиды обладают тремя характерными чертами. К 5 - и З -концам молекулярного маяка присоединены, соответственно тушитель флуоресценции и флуорохром. Последовательности, непосредственно примыкающие к этим красителям, самокомплементарны, поэтому в реакционной смеси такие зонды приобретают структуру типа стебель-петля , в которой тушитель и флуорохром пространственно сближены, и флуоресценция флуорохрома-репортера подавлена. В качестве тушителей флуоресценции в этих системах часто используют нефлуоресцирующие хромофоры, которые, получив энергию от флуорофора, рассеивают ее в виде тепла. Область петли зонда содержит последовательность, комплементарную анализируемому продукту ПЦР. При температурах более низких, чем температура отжига зонда на продукт ПЦР, структура стебля сохраняется и молекулярный маяк находится в выключенном состоянии. После образования гибрида между зондом и продуктом ПЦР или денатурации зонда тушитель и флуорохром пространственно разделяются, флуорохром начинает флуоресцировать, то есть маяк зажигается и начинает функционировать. Возбуждение элек- [c.229]

Зеленый флуоресцирующий белок и его производные. Первоначально обнаруженный в медузе GFP синтезируется и другими морскими организмами. У медузы этот белок осуществляет смещение спектра биолюминесценции из голубой области в зеленую, что сопровождается повышением квантового выхода, уменьшением светорассеяния и распространением света на большие расстояния. Полипептидная цепь GFP построена из 238 а.о. молекулярной массы 27 кДа и организована в 11-цепочечный (3-ствол, внутри которого находится а-спиральный участок (рис. 52, б). Хромофор GFP представляет собой 4-(п-гидроксибен-зилиден)-имидазолидин-5-он, образуемый в результате посттрансляционной модификации полипептидной цепи, в которой участвуют аминокислотные остатки Ser-65, Туг-66 и Gly-67. Образование хромофора происходит в два этапа реакции циклизации между этими аминокислотными остатками и последующего окисления с участием молекулярного кислорода. Путем укорачивания полипептидной цепи было показано, что, за небольшим исключением, для функционирования белка важны все его аминокислотные остатки. Изменение полипептидной цепи GFP с помощью мутаций позволяет повышать или понижать стабильность белка, увеличивать эффективность образования его хромофора и получать молекулы с новыми спектральными характеристиками, представленными в табл. 12. [c.387]

Внутренние факторы обычно не представляют интереса для биохимиков, занимающихся изучением свойств макромолекул факторы окружения имеют более важное значение. Действие этих факторов проявляется в первую очередь в появлении безы-злучательных переходов, которые конкурируют с флуоресценцией и вследствие этого понижают величину это понижение Q называется тушением. В биологических системах тушение обычно является либо результатом столкновений (химическая реакция или просто столкновение с обменом энергии), либо результатом безызлучательного дальнего переноса энергии, называемого резонансным переносом энергии (он будет обсуждаться далее в тексте). В экспериментальных условиях (в растворах) эти три фактора обычно проявляются как эффект растворителя или растворенных соединений (называемых тушителями), температуры, pH, соседних химических групп или концентрации флуоресцирующих молекул. В последующих разделах будет обсуждаться, как можно использовать сведения о влиянии окружения на хромофор для изучения макромолекул. [c.418]

Далее в тексте вместо термина флуорофор будут использоваться более принятые в отечественной литературе термины флуоресцирующий хромофор или флуоресцирующая молекула . — Прим. перев. [c.418]

Пример 15-И. Определение числа цепей полинуклеотидов. При связывании с полинуклеотидами наблюдается увеличение квантового выхода О и сдвиг Ямакс флуоресцирующего хромофора акридинового оранжевого (рис. 15-9). Когда добавлены насыщающие количества акридинового оранжевого, значения Лмако значительно отличаются для двухцепочечных (зеленая флуоресценция) и одноцепочечных (красная флуоресценция) полинуклеотидов. Следовательно, таким простым путем можно различить двух-и одноцепочечные структуры. Если в образце содержатся и одно-, и двухцепочечные полинуклеотиды, в спектре флуоресценции будет два пика, соответствующие двум значениям Ямакс- [c.430]

Пример 15-Ш. Количественное определение ДНК. Флуоресцирующий хромофор этидийбромид прочно связывается с ДНК при этом значительно возрастает его квантовый выход. Это увеличение линейно в широких пределах, и данные по интенсивности флуоресценции раствора, содержащего малые количества ДНК и этидийбромид используют для определения конц. ДНК. [c.448]

Увеличение также использовалось для обнаружения ДНК, которая подвергалась электрофорезу в полиакриламидном и агарозном гелях (см. рис. 9-11). Если гель, содержащий ДНК, погрузить в раствор этидийбромида, он впитает флуоресцирующий хромофор. Если затем гель подвергнуть действию возбуждающего света, станут видны полосы ДНК в виде зон с интенсивной флуоресценцией. [c.448]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология