Лизин, идентификация

Вопросу анализа аминокислот методом хроматографии на бумаге посвящено большое число работ советских и иностранных авторов. Однако почти все они связаны с разделением аминокислот белков и других биологических препаратов [61. Наша попытка применить их для анализа мелассы не дала положительных результатов, что можно объяснить мешающим действием остальных компонентов мелассы, ио отношению к которым содержание отдельных аминокислот составляет лишь 0,1—3 вес. %. Описанный в литературе метод 17, 81, состоящий в сорбции аминокислот на катионите с последующей их элюцией и идентификацией на бумаге неудобен, так как требует сложной специальной аппаратуры и чрезмерно длителен. Первой частью нашего исследования было хроматографическое разделение искусственной смеси из десяти аминокислот, приблизительно имитирующей аминокислотный состав мелассы [1, 81. Смесь включала лизин, аргинин, серии, глицин, аспарагиновую и глютаминовую кислоты, а-аланин, валин, метионин и лейцин. Растворы аминокислот готовили в 15%-ном этиловом спирте с концентрацией 0,5—1 у аминокислоты в 1 мкл. [c.212]

Идентификация мутантного гемоглобина. Препарат мутантного гемоглобина подвергли трипсиновому гидролизу, а затем получили пептидную карту. При этом выяснилось, что мутантный гемоглобин отличается от нормального гемоглобина А тем, что содержит в одном из пептидов вместо остатка аспарагина остаток лизина. [c.225]

Более того, поскольку эти группировки характеризуются различными значениями теплот ионизации (эти значения приведены на фиг. 22 в скобках) и различной чувствительностью величин р/С к изменениям ионной силы и диэлектрической проницаемости, широкое исследование рН-функций позволяет получить достаточно экспериментальных данных для идентификации активных групп фермента. Так, например, значение р/С5 свидетельствует о том, что в механизме действия фермента участвует сильно ионизированная карбоксильная группа или слабо ионизированный ион имидазолия. Чтобы произвести выбор между этими группировками, нужно изучить температурную зависимость р/С, так как теплоты ионизации этих двух групп существенно отличаются друг оТ друга. Другой пример р/СЮ,5 может относиться либо к е-аминогруппе лизина, либо к фенольному гидроксилу тирозина эти группировки можно дифференцировать, исследуя влияние ионной силы, поскольку величина р/С гидроксила (и карбоксила) в отличие от р/С аммониевой группировки весьма чувствительна к этому параметру. [c.214]

На основе этой реакции разработан метод идентификации некоторых аминокислот. Реакцию проводят в ледяной уксусной кислоте и затем исследуют поглощение полученных веществ в УФ-области спектра. Так, фурфурол реагирует с большинством аминокислот с ноявлением максимума поглощения при 360—380 ммк. Диаминокислоты ли.зин и орнитин дают нри этом второй максимум поглощения при 515—530 ммк, что позволяет четко различать данные аминокислоты. 1,3,5-Триоксан (тример формальдегида) реагирует специфично с оксипролином, давая максимум поглощения при 492—494 ммк другие оксиаминокислоты (оксилизин, серин и треонин) реагируют в этих условиях очень медленно. Таким образом, этот метод позволяет качественно определять лизин, орнитин и оксипролин, причем как в виде индивидуальных веществ, так и в белковых гидролизатах. [c.40]

Молекулярная масса и изоэлектрическая точка - характерные параметры белка. Однако в основе точной идентификации белковой молекулы лежит определение аминокислотной последовательности. Уже на первом этапе этого процесса, включающего расщепление белка на мелкие фрагменты, можно получить значительную информацию о данном белке. В настоящее время в продаже имеются протеолитические ферменты и химические реактивы, расщепляющие белки по определенным аминокислотным остаткам (табл. 4-10). Так, фермент трипсин отщепляет остатки лизина и аргинина со стороны карбоксильных групп химический реактив бромистый циан расщепляет пептидные связи, расположенные после остатков метионина. Поскольку такие специфические ферменты и реактивы расщепляют в белковой молекуле ограниченное количество связей, при их воздействии образуется смесь больщих пептидов. Разделив эту смесь методом электрофореза или хроматографии, можно получить пептидную карту, характеризующую исследуемый белок. Такие пептидные карты называют иногда фингерпринтами (отпечатками пальцев) белка (рис. 4-53). [c.219]

В основе метода динитрофенилирования лежит реакция свободных ЫНг-групп белка или пептида с 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ) в щелочной среде, при которой образуются соответствующие динитрофенильные производные (ДНФ-производные). В реакцию с ДНФБ, кроме свободных а-ЫНг-групп, вступают также е-ННг-группа лизина, 5Н-группа цистеина, ОН-группы оксиаминокислот и имидазольный гетероцикл гистидина. ДНФ-производное белка или пептида подвергают полному кислотному гидролизу. Ы-концевые ДНФ-амино-кислоты экстрагируют из гидролизатов эфиром, отделяя их от свободных аминокислот и ДНФ-производных по другим функциональным группам аминокислот, которые растворимы в воде. Идентификацию [c.145]

Тот факт, что восстановление (24) полностью подавляет активность фермента, является существенным доказательством того, что это соединение является истинным интермедиатом реакции. Дальнейшие эксперименты позволяют поместить данный остаток лизина в первичную последовательность белка и в случае известной трехмерной структуры могут привести к идентификации активного центра. [c.481]

Расщепление полипептидной цепи на фрагменты проводят обычно при помощи протеолитических ферментов, таких, как трипсин, химотрипсин или пепсин. Эти ферменты действуют на различные участки полипептидной цепи, так как имеют повышенное сродство к различным аминокислотным остаткам. Необходимо учитывать также соседние аминокислотные остатки, т. е. пространственное окружение атакуемой пептидной связи. Оказалось, что трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа лизина или аргинина, а химотрипсин гидролизует связи по фенилаланину, триптофану и тирозину Обычно протеолитические ферменты, гидролизующие полипептидные цепи, предварительно иммобилизуют на нерастворимых матрицах для более легкого отделения их от продуктов гидролиза. Далее определяют аминокислотные последовательности каждого полипептидного фрагмента. Для этого чаще всего используют метод Эдмана, заключающийся в анализе полипептида только с Ж-конца. Концевая аминокислота при взаимодействии с фенилизотиоцианатом в щелочной среде образует стойкое соединение, которое можно отщепить от полипептида без его деградации. Фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное аминокислоты идентифицируется хроматографическим методом. После идентификации концевого Ж-амино-кислотного остатка метка вводится в следующий аминокислотный остаток, [c.41]

Разделительный эффект в двумерных опытах. Для надежной идентификации ДНФ-производных, принадлежащих к относительно большой группе нерастворимых в кислоте и экстрагируемых эфиром ДНФ-аминокислот, как правило, требуется двумерная хроматография. Для этого в первом направлении мы применяем толуол -систему Бизерте и Остё [45] (система № 1), а во втором направлении — системы № 2—5 на выбор. На рис. 165 показано разделение стандартной смеси по 2 (хз ДНФ-аминокислот при комбинации растворителей № 1 и 2. Не делятся группа лейцина, руппа валина, ди-ДНФ-лизин и ди-ДНФ-тирозин. [c.420]

Абдергальден и Стикс [131] впервые получили динитрофенильные производные аминокислот при кипячении щелочных растворов аминокислот с 1-хлор-2, 4-динитробензолом. Соответствующее фторпроизводное, рекомендованное Сангером [132, 133], реагирует с аминокислотами в растворе бикарбоната при комнатной температуре и потому практически более удобно. Все N-динитрофенильные производные аминокислот скрашены в желтый цвет, что облегчает их идентификацию на хроматограммах. Некоторые аминокислоты реагируют более чем с одним молем реагента так, в реакцию с 1-фтор-2,4-динитробензолом вступают как а-, так и со-аминогрупны лизина и орнитина, имино-азот гистидина, фенольная группа тирозина и сульфгидрильная группа цистеина. Поэтому перечисленные аминокислоты образуют бис-динитрофенильные производные. [c.35]

Аргинин 1 фенилаланин ] пролин ] лейцин + изолейцин I валин лизин тирозин I аланин 1 треонин 1 глицин дженколевая кислота 1 серин лан-тионин I глутаминовая кислота аспарагиновая кислота цистин цистиновая кислота. Идентификация (порядок — в первой, фенольной, хроматограмме) [c.271]

Новая аминокислота тирозин триптофан I фенилаланин [ метионин лейцин I изолейцин валин 1 новая аминокислота пролин треонин гистидин I аланин новая аминокислота I серинI глицин аргинин лизин I глутаминовая кислота ] аспарагиновая кислота. Идентификация и определение (порядок — в первой, коллидиновой, хроматограмме) [c.271]

При изучении стрептотрицинов бумажную хроматографию использовали не только для анализа компонентного состава различных препаратов, но также для препаративного разделения [1643], контроля выделения и очистки [231, 240, 245], количественного анализа компонентов смесей стрептотрицинов [231, 369, 1662], при изучении биосинтеза [413] и влияния состава сред на образование стрептотрицинов [1665]. Также разработаны методы хроматографической идентификации продуктов гидролиза антибиотиков группы стрептотрицинов гулозамина, стрептоли-дина, р-лизина и др. [1663, 1664, 1666—1668]. [c.260]

Эта окраска вовсе не является характерной только для аминокислот пептиды, белки н другие аминосоединения также дают ее . Однако она позволяет открывать на бумаге исключительно малые количества аминокислот и пептидов с короткой цепью. Порядок определяемых величин можно видеть по данным табл. 6, хотя абсолютные количества несколько зависят от условий опыта. Тем не менее весьма поучительно сравнить получаемые результаты. Например, можно видеть, что в случае глицина проба с нин-гидрином в 15 раз чувствительнее, чем в случае аргинина, тирозина, лизина или глутаминовой кислоты следовательно, простого взгляда на хроматограмму недостаточно для оценки относительного количества аминокислоты. Иногда при идентификации аминокислоты может помочь оттенок окраски пятна. [c.127]

Применение динитрофенильных производных, введенных в практику Зангером [25] с целью идентификации и количественного определения концевых аминогрупп, позволяет получить ценные сведения о количестве открытых цепей в белке. Кроме того, такие меченые аминокислоты служат в качестве реперных точек при исследовании неполного гидролиза (1346). В этом отношении полезными являются также е -аминогруппы лизина. Путем неполного гидролиза, осуществляемого с помощью кислоты и различных типов ферментов, оказалось возможным разрывать длинные полипептидные цепи в различных точках и путем анализа установить единственно возможную конфигурацию. Этим способом Зангер и Таппи[99]и Зангер и Томпсон [100] определили порядок чередования аминокислот в двух типах цепей, входящих в состав инсулина (табл. 27). Такой подход к проблеме структуры белка был облегчен широким применением новейших микрометодов хроматографии на бумаге и силикагеле и ионофореза. Таким образом, оказывается, что одна из крупнейших проблем химии белка поддается изучению с помощью весьма простых и экономичных методов. Цепи в инсулине имеют различную длину, причем цепь с N-концевым фенилаланином (цепь В) состоит из 30 остатков, а соответствующая глициновая цепь (цепь А) — из 21 остатка. Порядок чередования аминокислот и их содержание даны в табл. 27. Можно отметить следующее. Цепь А не содержит лизина, гистидина, аргинина, треонина, фенилаланина и пролина все эти компоненты входят в состав цепи В, в которой, в свою очередь, совсем нет изолейцина. Не наблюдается ни регулярного чередования аминокислот, ни тенденции к чередованию полярных и неполярных групп. Три ароматические аминокислоты (фен.фен.тир.) расположены последовательно, и два остатка глутаминовой кислоты связаны с двумя остатками ци-стеина (глу.глу.цис.цис.). В обеих цепях содержится шесть цистеиновых остатков, четыре из которых расположены врозь, а только что упомянутые два — рядом друг с другом в молекуле нативного белка все они существуют в форме цистина, но какие из них расположены между пептидными цепями, а какие в самих пептидных цепях — неизвестно. Часть дикарбоновых кислот присутствует в виде амидов — четыре в цепи А и две в цепи В. [c.255]

Для идентификации аминокислот наиболее широко используются их ФТГ-производные. В работе [54] описано разделение двадцати пяти ФТГ-аминокислот градиентным элюированием на колонке с ультрасфер-ODS (рис. 2.3). Как показывают данные этой работы, разрешающая способность колонки сильно зависит от pH и ионной силы элюента, скорости потока, а также от температуры предварительной и основной колонок. По этой причине часто трудно установить точное положение пиков, отвечающих ФТГ-производным основных и кислых аминокислот. Даже незначительное изменение pH сильно сказывается на времени удерживания ФТГ-Asp и ФТГ-Glu, а ФТГ-His и ФТГ-Arg могут при этом элюироваться одновременно. С увеличением pH от 3,5 до 6,0 уменьшается время удерживания производных кислых и основных аминокислот, тогда как увеличение концентрации ацетат-ионов при постоянном значении pH приводит к уменьшению времени удерживания только ФТГ-произвОдных основных аминокислот. Установлено также, что оптимальное разрешение пиков, отвечающих ФТГ-производным метионина, валина, лизина и изолеицина, достигается при скорости потока 1,3 мл/мин. Полный анализ занимает 32 мин, коэффициент вариации составляет от 0,3 для ФТГ-валина до 2,9 для ФТГ-(5-карбоксиметил)цистеина (приведенные значения получены по результатам 27 опытов). [c.54]

Мюллер [21] исследовал осаждение нитроиндандионом протеиногенных аминов, аминокислот, бетаинов и подобных биологических веществ и нащел, что бетаин, коламин, лизин и мочевина не осаждаются, между тем как р-аланин, кадаверин, путресцин, гистамин и гистидин тотчас дают осадок, а аргинин, карнозин, креатинин, тирамин и гликоколь, хотя и дают хорошие кристаллические осадки, но образуются они несколько медленно, так что часто осадок появляется только на следующий день. Точки плавления этих солей не резки. На применение нитроиндандиона для выделения и идентификации оснований животного организма указывают также Акерман и Мауэр [22]. [c.34]

Методы выделения и идентификации мономеров дают информацию о молекулярной массе олигомера и его субъединиц, их количестве и свойствах, позволяют получать препараты для определения первичной структуры. Если удается получить белок в виде кристаллов, изучение первичной структуры удобно вести параллельно с помощью секвенирования и физических методов (например, рентгеноструктурного анализа), поскольку сопоставление получаемой информации существенно ускоряет ход анализа [158]. Однако такая возможность представляется редко. Часто именно получение достаточно чистых препаратов белка или субъединиц, пригодных для проведения аминокислотного анализа, и составляет одну из главных проблем, поскольку исследуемый белок может присутствовать лишь в незначительных количествах в сложной смеси сопутствующих белков и продуктов их деградации или же исходная смесь может содержать белки с очень близкими свойствами. Если белок плохо растворим и требует более жестких условий для солюбилизации, гетерогенные препараты могут быть получены уже на начальном этапе выделения. Причиной появления гетерогенности можег быть, по-видимому, изменение суммарного заряда из-за дезамидирования амидных групп аспарагина и глутамина, карбами-лирование е-аминогрупп некоторых остатков лизина ионом цианата, присутствующим в растворах мочевины [38], неспецифическая модификация остатков метионина и гистидина при алкилировании цистеина. [c.16]

Если изменение аллеля в локусе приводит к замене аминокислоты, принадлежащей к одному классу, на аминокислоту другого класса, то изменяется и изоэлектрическая точка белка, и его суммарный заряд при любом данном значении pH. Например, замена в молекуле ДНК кодона ААЦ на кодон ААА приведет к замещению нейтрального аспарагина положительно заряженным лизином. К еще более резкому изменению — замещению положительно заряженного лизина отрицательно заряженной глутаминовой кислотой — приведет замена ААГ на ГАГ. Подобные изменения суммарного заряда можно использовать для разделения белков, а следовательно, и для идентификации аллельных форм одного гена. Такое разделение достигается методом гель-электрофореза. [c.112]

Рнс. 4.9. Реакция аминокислоты с 1-фтор-2,4-динитробензолом (реагентом Сенгера). Реагент назван в честь нобелевского лауреата (1958 г.) биохимика Фредерика Сенгера, который использовал его для определения первичной структуры инсулина. Вначале арилируют (с количественным выходом) всех свободные аминогруппы, после гидролиза пептида образуются 2,4-динитрофенил-производные аминокислот, обладающие яркой желтой окраской. Количественный анализ этих производных осуществляют спектрофотометрическими методами. С динитрофторбензолом реагируют также Е-аминогруппа лизина, имидазольная группа гистидина, ОН-группа тирозина и 8Н-группа цистеина. Динитрофе-нильные группы не отщепляются при кислотном гидролизе и используются для идентификации N-кoнцeвыx аминокислот в полипептидах. [c.38]