Цистеин, идентификация

Анализ. Методы анализа белковых макромолекул селективны и осуществляются в зависимости от того, какая структура является объектом исследования, и начинаются с определения аминокислотного состава. Для этого необходимо провести полный гидролиз пептидных связей и получить смесь, состоящую из отдельных аминокислот. Гидролиз проводят при помощи 6 М соляной кислоты при кипячении в течение 24 ч. Так как для гидролиза пептидных связей изолейцина и валина этого может быть недостаточно, проводят контрольный 48- и 72-часовой гидролиз. Некоторые аминокислоты, например триптофан, при кислотном гидролизе разрушаются, поэтому для их идентификации используют гидролиз при помощи метансульфоновой кислоты в присутствии триптамина. Для определения цистеина белок окисляют надмуравьиной кислотой, при этом цистеин превращается в цистеиновую кислоту, которую затем анализируют. Вьщеление и идентификацию аминокислот проводят при помощи аминокислотных анализаторов, принцип действия которых основан на хроматографическом разделении белкового гидролизата на сульфополистирольных катионитах, В основе количественного определения той или иной аминокислоты лежит цветная реакция с нингидрином, однако более перспективным следует считать метод, при котором аминокислоты модифицируют в производные, поглощающие свет в видимом диапазоне. Разделение смеси аминокислот проводят при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, а само определение — спектрофотометрически. Следующим этапом является определение концевых аминных и карбоксильных [c.40]

Первую информацию о наличии высших сахаров, а также обш,ее представление о природе высшего сахара дают качественные цветные реакции в сочетании с данными о хроматографическом поведении. В основе-цветных реакций на высшие моносахариды лежит взаимодействие с минеральными кислотами, которое приводит к образованию производных фурфурола, даюш,их окрашенные соединения с орцином, карбазолом, цистеином, дифениламином. Эти окрашенные соединения имеют максимум погло-ш,ения в ультрафиолетовой части спектра при определенных длинах волн, характерных для данного типа высшего сахара Так, например,, при реакции Дише на гептозы (серная кислота — цистеин) максимум поглош,ения возникаюш,его хромофора находится при 505 ммк, тогда как октулозы образуют хромофор с максимумом поглош,ения при 480 ммк. Высшие кетозы значительно легче, чем альдозы, превраш,аются в производные фурфурола, что используется для идентификации кетоз. Так, при реакции с орцином в присутствии соляной кислоты высшие кетозы дают более интенсивную окраску, чем альдозы, а если соляную кислоту заменить трихлоруксусной, то высшие альдозы не реагируют вообш,е [c.319]

Рис. 9.7.6. Изображение пространствениого строения центральной части участка 3-структуры ОПИТ. Десять остатков аминокислоты обозначены следующими буквами С — цистеин, F — фенилаланин, I — изолейцнн, Q — глутамин, R — аргинин, Т — треонин, V — валин, Y — тирозин. Водородные связи между группами NH и СО обозначены щтриховкой. Отметим, что протоны NH л-го остатка и протоны С"Н (п - 1)-го остатка, обозначенные стрелками, расположены очень близко. Наблюдаемые NOE позволяют провести последовательную идентификацию резонансных сигналов. (Из работы [9.31].)

Ингибирование ферментов определяется также природой иона металла. Большинство ферментов включает металлы 4-го периода. При координировании ионами тяжелых металлов возможно полное подавление ферментной активности. Особенно ядовиты для ферментов ионы Hg2+, например, Н + полностью подавляет активность карбоксипептидазы А. Ртуть обладает исключительным сродством к сере, и поэтому стремится образовать максимально устойчивые комплексы с аминокислотами, содержащими серу (цистеин, цистин, метионин). Ингибирование фермента ионами Hg2+ используется для идентификации (хотя не очень надежной) меркапто-групп [56]. [c.589]

Разделение синтетических диастереомеров сульфоксида 8-метил-Ь-цистеина. Чтобы завершить идентификацию сульфоксида, выделенного из капусты, Синдж и Вуд попытались разделить синтетические диастереомеры сульфоксида 8-ме- [c.51]

В основе метода динитрофенилирования лежит реакция свободных ЫНг-групп белка или пептида с 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ) в щелочной среде, при которой образуются соответствующие динитрофенильные производные (ДНФ-производные). В реакцию с ДНФБ, кроме свободных а-ЫНг-групп, вступают также е-ННг-группа лизина, 5Н-группа цистеина, ОН-группы оксиаминокислот и имидазольный гетероцикл гистидина. ДНФ-производное белка или пептида подвергают полному кислотному гидролизу. Ы-концевые ДНФ-амино-кислоты экстрагируют из гидролизатов эфиром, отделяя их от свободных аминокислот и ДНФ-производных по другим функциональным группам аминокислот, которые растворимы в воде. Идентификацию [c.145]

Цистенн разрушается прп хроматографи . Цистин стабилен в среде. содержаш,ей в атмосфере 1—2% НС1. Для идентификации цистина или цистеина в гидролизате последний обрабатывают прямо на бумаге 2—3 чикролитрами ЗО ) Н2О2. Образуется очень стабильная цистиновая кислота [c.401]

Абдергальден и Стикс [131] впервые получили динитрофенильные производные аминокислот при кипячении щелочных растворов аминокислот с 1-хлор-2, 4-динитробензолом. Соответствующее фторпроизводное, рекомендованное Сангером [132, 133], реагирует с аминокислотами в растворе бикарбоната при комнатной температуре и потому практически более удобно. Все N-динитрофенильные производные аминокислот скрашены в желтый цвет, что облегчает их идентификацию на хроматограммах. Некоторые аминокислоты реагируют более чем с одним молем реагента так, в реакцию с 1-фтор-2,4-динитробензолом вступают как а-, так и со-аминогрупны лизина и орнитина, имино-азот гистидина, фенольная группа тирозина и сульфгидрильная группа цистеина. Поэтому перечисленные аминокислоты образуют бис-динитрофенильные производные. [c.35]

Восстановление и идентификация содержащегося в спарже дисульфида и получение производных. Дисульфид был восстановлен натрием в жидком аммиаке. Осадок, полученный после испарения аммиака и подкисления, представлял собой кислоту состава 4H8O2S2 с т. пл. 61—62°. Титрование п-хлорфенилмеркурибензоатом l 6H4HgO O 6H5 с использованием нитропруссида натрия в качестве внешнего индикатора показало, что эта кислота содержит две SH-группы. Реагент, применявшийся для титрования и содержащий ртуть, стандартизировался по специально очищенному хлор-гидрату цистеина. При титровании протекает следующая реакция [c.60]

Для идентификации аминокислот наиболее широко используются их ФТГ-производные. В работе [54] описано разделение двадцати пяти ФТГ-аминокислот градиентным элюированием на колонке с ультрасфер-ODS (рис. 2.3). Как показывают данные этой работы, разрешающая способность колонки сильно зависит от pH и ионной силы элюента, скорости потока, а также от температуры предварительной и основной колонок. По этой причине часто трудно установить точное положение пиков, отвечающих ФТГ-производным основных и кислых аминокислот. Даже незначительное изменение pH сильно сказывается на времени удерживания ФТГ-Asp и ФТГ-Glu, а ФТГ-His и ФТГ-Arg могут при этом элюироваться одновременно. С увеличением pH от 3,5 до 6,0 уменьшается время удерживания производных кислых и основных аминокислот, тогда как увеличение концентрации ацетат-ионов при постоянном значении pH приводит к уменьшению времени удерживания только ФТГ-произвОдных основных аминокислот. Установлено также, что оптимальное разрешение пиков, отвечающих ФТГ-производным метионина, валина, лизина и изолеицина, достигается при скорости потока 1,3 мл/мин. Полный анализ занимает 32 мин, коэффициент вариации составляет от 0,3 для ФТГ-валина до 2,9 для ФТГ-(5-карбоксиметил)цистеина (приведенные значения получены по результатам 27 опытов). [c.54]

Общее содержание цистина и цистеина можно, однако, определить, окисляя интактный белок надмуравьиной кислотой, которая превращает оба типа остатков в цистеиновую кислоту. Белок затем гидролизуют и сильную цистеиновую кислоту отделяют или на сильноосновной анионообменной смоле, такой, как дауэкс-2 [108], или на сильнокислотной катионообменной смоле типа, обычно используемого для разделений аминокислот [102]. Последний способ более удобен, так как цистеиновая кислота вымывается в виде пика с нулевым удерживаемым объемом (фракции 3—10 на колонке длиной 15 см), но первый метод дает возможность более строгой хроматографической идентификации и отделения цистеиновой кислоты от других сильнокислых соединений, реагирующих с нингидрином. Скорость окисления остатков цистина в белках сходна со скоростью окисления свободной аминокислоты. Нерастворимые белки для полного окисления требуют более продолжительной обработки. [c.148]

Превращение двух сульфгидрильных, или тиольных, групп в дисульфидную представляет собой окислительно-восстановительную реакцию, чувствительную к присутствию в растворе акцептора (донора) электронов. Для кинетического изучения денатурации особенно важно то обстоятельство, что взаимодействия остатков ys в белковой молекуле определяются не столько различиями в химических свойствах их сульфгидрильных групп (они, как правило, незначительны), сколько стереохимическими факторами и конформационными возможностями полипептидной цепи. Скорость образования S-S-связи между любой парой остатков цистеина зависит исключительно от их взаимного расположения в пространстве и, следовательно, может являться количественной характеристикой вероятности соответствующих конформационных переходов. Идентификация дисульфидной связи ведет к обнаружению конформации, обеспечивающей ее образование. Термодинамическое условие состоит в том, что конформационное состояние белковой цепи, стабилизирующее данную дисульфидную связь, должно в той же степени быть стабилизировано наличием этой связи. Следовательно, конформационная основа механизма свертывания проявится благодаря конформациям промежуточных состояний, [c.359]

Ларсен с сотрудниками [24] с успехом применили нитроиндандион для идентификации аминокислот в микроанализе. Для этого нагревают небольшое количество аминокислоты с насыщенным раствором нитроиндандиона на объективном стеклышке. Полученные кристаллы отсасывают, тщательно высушивают над микропламенем и в поляризационном микроскопе определяют коэффициент преломления. По кристаллографическим и оптическим данным можно определить следующие соединения /-аланин, /-аспарагиновую кислоту, /-цистеин, /-глутаминовую кислоту, глицин, /-гистидин, /-оксипролин, 3,5-дийод-/-тирозин, /-изолейцин, /-лнзпн, /-пролин, /,/-сер,ин и /,/-валин. [c.35]

Методы выделения и идентификации мономеров дают информацию о молекулярной массе олигомера и его субъединиц, их количестве и свойствах, позволяют получать препараты для определения первичной структуры. Если удается получить белок в виде кристаллов, изучение первичной структуры удобно вести параллельно с помощью секвенирования и физических методов (например, рентгеноструктурного анализа), поскольку сопоставление получаемой информации существенно ускоряет ход анализа [158]. Однако такая возможность представляется редко. Часто именно получение достаточно чистых препаратов белка или субъединиц, пригодных для проведения аминокислотного анализа, и составляет одну из главных проблем, поскольку исследуемый белок может присутствовать лишь в незначительных количествах в сложной смеси сопутствующих белков и продуктов их деградации или же исходная смесь может содержать белки с очень близкими свойствами. Если белок плохо растворим и требует более жестких условий для солюбилизации, гетерогенные препараты могут быть получены уже на начальном этапе выделения. Причиной появления гетерогенности можег быть, по-видимому, изменение суммарного заряда из-за дезамидирования амидных групп аспарагина и глутамина, карбами-лирование е-аминогрупп некоторых остатков лизина ионом цианата, присутствующим в растворах мочевины [38], неспецифическая модификация остатков метионина и гистидина при алкилировании цистеина. [c.16]

Для однозначной идентификации положения дисульфидных связей важно, чтобы каждый из цистинсодержащих пептидов включал только один дисульфидный мостик. Предварительно необходимо установить число и положение в полипептидной цепи остатков цистеина поэтому к анализу приступают лишь после определения полной аминокислотной последовательности полипептидной цепи или цепей исследуемого белка. Число дисульфидных связей можно определить с помощью различных методов. Для этого наряду с установлением первичной структуры проводят исследование физико-химических свойств белка. Данные относительно внутри- и межцепочечных дисульфидных [c.166]

ФТГ- ys. Методика идентификации остатков ys зависит от природы химической модификации сульфгидрильной группы остатка цистеина до анализа на секвенаторе. Для количественной оценки содержания цистеина наиболее удобно использовать меченое [С ]-карбоксиметильное производное, полученное восстановлением и последующим алкилированием образца [С ]-иодоацетамидом. Все отщепленные остатки проверяют на наличие радиоактивности. Кроме того, можно определить время элюирования соответствующего производного цистсина, оценить количественно его содержание и использовать эти данные для хроматографической оценки содержания ys. Можно анализировать и ФТГ-производное цистеиновой кислоты, однако оно элюируется с колонки очень быстро, и при наличии многих соединений, также выходящих с колонки, содержание ФТГ-производного цистеиновой кислоты трудно оценить (тем более количественно). [c.417]

Обычно мы готовим образцы к анализу на секвенаторе лиофилизацией их из воды, разбавленных растворов кислоты, летучих водных буферов. Образцы хранятся в закрытых сцин-тилляционных баночках в виде белого пушистого порошка. В нашей практике бывали случаи, когда образцы, не имевшие такого внешнего вида, не удавалось анализировать. Причины подобных неудач не ясны, но, возможно, они связаны с нерастворимостью образца и наличием в нем примесей. Из-за трудностей идентификации остатков цистеина большинством обычных методов определения ФТГ-производных аминокислот почти всегда перед анализом последовательности мы восстанавливаем и карбоксиметилируем наши образцы радиоактивными реагентами. Поэтому небольшая аликвота каждого определяемого ФТГ-производного проверяется на наличие радиоактивности. [c.426]

Рнс. 4.9. Реакция аминокислоты с 1-фтор-2,4-динитробензолом (реагентом Сенгера). Реагент назван в честь нобелевского лауреата (1958 г.) биохимика Фредерика Сенгера, который использовал его для определения первичной структуры инсулина. Вначале арилируют (с количественным выходом) всех свободные аминогруппы, после гидролиза пептида образуются 2,4-динитрофенил-производные аминокислот, обладающие яркой желтой окраской. Количественный анализ этих производных осуществляют спектрофотометрическими методами. С динитрофторбензолом реагируют также Е-аминогруппа лизина, имидазольная группа гистидина, ОН-группа тирозина и 8Н-группа цистеина. Динитрофе-нильные группы не отщепляются при кислотном гидролизе и используются для идентификации N-кoнцeвыx аминокислот в полипептидах. [c.38]

Аминокислоты, в количестве обьрпю не менее ста, соединяются между собой пептидными связями, образуя полипептидную цепь, Пептцдная связь соединяет а-карбок-сильную группу одной аминокислоты с а-аминогруппой другой. В некоторых белках отдельные боковые цепи соединяются между собой дисульфидными мостиками, образующимися путем окисления остатков цистеина. Белки состоят из одной или нескольких полипептидных цепей. Каждый белок имеет уникальную последовательность аминокислот, которая детерминируется генетически. Определение последовательности аминокислот в белках проводят следующим образом. Сначала определяют общий аминокислотный состав, подвергая кислотный гидролизат белка хроматографии на ионообменнике, и проводят идентификацию N-кoнцeвoгo аминокислотного остатка с помощью реагента на концевую аминогруппу, например дансилхлорида. Следую- [c.43]