Карбоксипептидаза специфичность

Об использовании экзопептидаз, таких как аминопептидаза и карбоксипептидаза, для определения аминокислотной последовательности вблизи N- и С-концов белков говорилось в разд. 23.3.4. Эндопептидазы являются протеолитическими ферментами, которые избирательно расщепляют пептидные связи в точках, удален ных от концов белковой молекулы. Эндопептидазы сильно различаются по своей специфичности. Обычно сами аминокислотные остатки с любой стороны расщепляющейся пептидной связи являются наиболее важными детерминантами специфичности протеолитических ферментов. Так, трипсин разрывает пептидные связи, в образовании которых участвует карбонильная группа остатков Arg или Lys схемы (25), (26) . [c.274]

Из всех методов определения С-концевых аминокислот этот метод самый специфичный. Пользуясь карбоксипептидазой также, как при действии аминопептидазой, можно определять не только С-коицевую аминокислоту, но и последовательно отщеплять аминокислотные остатки с С-конца пептида. Реакция обрывается, когда в пептидной цепи встречается пролин, так как карбоксипептидаза не гидролизует связь СО—N. [c.513]

В отличие от карбоксипептидазы большая часть природных белков не содержит ионов металла в активном центре. Ионы металлов часто образуют с белками обратимые комплексы. Бычий сывороточный альбумин (БСА) связывает до 20 ионов переходных металлов на молекулу. В соответствии с данными фиг. 78 можно ожидать, что при физиологических pH происходит связывание с имидазолом или карбоксильными группами, расположенными благоприятно для образования комплексов, что, по-видимому, и имеет место в данном случае. Однако из фиг. 78 следует также, что единственная сульфгидрильная группа в БСА должна быть местом преимущественного связывания металла. Так, каждый третий ион меди, приходящийся на молекулу БСА, по-видимому, связывается с сульфгидрильной группой. На высокую специфичность связывания с ионами металлов указывает также возможность получения для целей рентгеноструктурного-анализа производных гемоглобина и миоглобина, содержащих тяжелые атомы. [c.414]

Карбоксипептидаза Y из дрожжей обладает широкой специфичностью и отщепляет все аминокислоты, кроме Gly, связанного с Pro. [c.368]

Благодаря специфичности триптического гидролиза возникающие в ходе его пептиды имеют на С-конце лизин или аргинин, за исключением С-концевого пептида самого белка (если, конечно, на его С-конце не находится ни лизин ни аргинин). Карбокси-пептидаза В специфически отщепляет С-концевые основные аминокислоты, что приводит к потере зарядов в концевых пептидах. Если пептид не имеет на С-конце ни лизина, ни аргинина, т. е. действительно является С-концевым пептидом белка, то после обработки карбоксипептидазой он не потеряет своего заряда. [c.113]

Карбоксипептидаза Y отщепляет практически все аминокислоты, включая пролин, и ее специфичность аналогична специфичности СРС. Гидролиз проходит наиболее эффективно при pH 5,5 — 6,5. Оптимальное значение pH для отщепления лизина и аргинина — 7,0. [c.68]

Две карбоксипептидазы — А и В — участвуют в переваривании белков в двенадцатиперстной кишке. Карбоксипептидаза А проявляет максимальную каталитическую активность в отношении ароматических С-концевых аминокислот, а карбоксипептидаза В специфична в отношении основных С-концевых аминокислот. [c.429]

ПРОНАЗА, смесь частично очищенных протеолитич ферментов из микробов 31гер1отусе5 gri.seus, содержащая нейтр. и щел. протеиназы (см. Протеолитгтеские ферменты), а также протеиназы, близкие по характеру действия химотрипсину и карбоксипептидазам. Мол. м. компонентов 16 000—20 ООО. Обладает широкой субстратно специфичностью, при pH 7—8 гидролизует в казеине и альбумине 80—85% пептидных связей. Активность разл. комнонентов П. подавляется хелатами, диизопропилфторфосфатом, хлоркетонами. Активизируется Са +, Со +, Мп +, Примен. при исследовании строения белков ПРОПАЗИН. триазин [c.480]

Различают экзопептидазы, расщепляющие связи вблизи С- или N-конца цепи (соотв. карбоксипептидазы и аминопептидазы) и эндопептидазы (протеиназы), гидролизующие связи, удаленные от концевых остатков (напр., трипсин). Лишь ограниченное число П. ф. обладает строгой субстратной специфичностью. К ним относят, напр., ренин, гидролизующий связь между остатками лейцииа в положениях 10 и 11 в ангиотензиногене (предшественник ангиотензина пептида, участвующего в регуляции кровяного давления), или энтеропептидазу отщепляющую N-концевой гексапеп- [c.112]

Специфичность каждого конкретного фермента определяется той аминокислотой, которой принадлежит свободная карбоксильная группа. Вторая аминокислота, участвующая в образовании расщепляемой пептидной связи, не оказывает влияния на специфичность данного фермента. Так, например, карбоксипептидаза А легко расщепляет пептидную связь С-концевого -аминокислотного остатка многих пептидов, кроме тех, у которых С-концевым остатком является диаминокислота или пролин. Карбоксипептидаза В гидролизует С-концевые пептидные связи, образованные лизином или аргинином. [c.222]

Наиболее широко распространенным методом является, вероятно, анализ С-концевых групп, основанный на специфичности фермента панкреатической карбоксипептидазы, которая гидролизует пептидную связь, ближайшую к карбоксильной группе белка [135]. Образующуюся свободную аминокислоту идентифицируют хроматографией на бумаге. Этот метод имеет много ограничений, но успешно использовался для большого числа белков и пептидов. [c.155]

В этом уравнении указана только концевая часть пептидной цепи. Карбоксипепти-даза атакует только амидную группу иа конце цепи. Однако ее активность не зависит от природы боковых цепей К и К. Карбоксипептидазы катализируют гидролиз пептидов, но не обладают никакой активностью в гидролизе жиров последнюю реакцию катализирует совершенно другая группа ферментов. Присущая ферментам высокая степень специфичности необходима для того, чтобы все реакции, протекающие в сложных организмах, были в определенной мере независимы друг от друга. [c.451]

Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфичности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) присоединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители). Для уменьшения пространственных трудностей при взаимодействии фермента с матрвдей лиганд присоединяют к носителю через промежуточное звено (вставку, ножку, спейсер). Присоединение лигандов к поперечносшитой агарозе — сефарозе обычно проводят, активируя ее бромцианом (см. с. 91). Связывание с сефарозой, активированной бромцианом, л-амино-бензилянтарной кислотой, используемой в качестве лиганда, обеспечивает взаимодействие сорбента с каталитическим центром только карбоксипептидаз благодаря сходству лиганда с субстратами карбоксипептидазы [c.82]

Специфичность обеих экэопептидаз различна. Карбоксипептидазой А, впервые использованной Ленсом в 1949 г. для определения С-концевых остатков в инсулине, отщепляются все аминокислоты, кроме Lys, Arg, Pro-и His. Карбоксипептидаза В отщепляет Lys, Arg, Orn и S-аминоэтилцистеин. Оба фермента взаимно дополняют друг друга и, как правило, применяются в комбинации. [c.368]

Этот фермент может быть выделен из экстрактов поджелудочной железы в чистом виде [128], но до использования для определения последовательности аминокислот его рекомендуется инкубировать с диизопропилфторфосфатом, чтабы инактивировать возможные примеси химотрипсина, трипсина и субтилизина [122, 267, 300]. Основные свойства и специфич-кость действия карбоксипептидазы подробно рассмотрены в ряде работ [228 293]. В Других работах [114, 136, 226, 320] приводятся данные об использовании фермента для определения последовательности аминокислот в белках. Карбоксн-Пептйдаза специфична в отношении С-концевых аминокислот [c.232]

Активность лейцинаминопептидазы, выражаемая числом молей субстрата, расщепляемых в минуту весовой единицей фермента, значительно выше активности карбоксипептидазы, которая в свою очередь активнее папаина—одной из наиболее эффективных протеиназ [297]. Вследствие высокой активности лейцинаминопептидазы даже менее чувствительные связи в полипептидных цепях могут гидролизоваться с заметной скоростью. Кроме того, специфичность действия лейцинаминопептидазы не ограничивается остатками определенного типа, как в случае карбоксипептидазы. Так, фермент освобождает полуцистиновые остатки из пептидных связей. Пролин и аминокислоты с полярными боковыми группами также отщепляются, хотя скорости гидролиза могут быть небольшими. В некоторых случаях подобный широкий спектр активности выгоден, но он увеличивает трудности при попытках установить последовательность сцепления аминокислот на основании данных о скорости отщепления аминокислот при разрыве пептидных связей [149]. [c.236]

Существует несколько методов, с помощью которых можно обнаружить аминокислотные остатки, ответственные за биологическую активность белков. В первом методе белок необходимо подвергнуть частичной деградации, в особенности вблизи Л/- и С-кон-цов соответственно с помощью аминопептидаз и карбоксипептидаз. Например, удаление (с помощью карбоксипептидазы) трех остатков с С-конца рибонуклеазы не влияет на ее активность. Более глубокая деградация в этой части молекулы, однако, приводит к инактивации. По второму методу необходимо подвергнуть химической модификации боковые группы аминокислотных остатков белка. Естественно, что результаты такого рода экспериментов проще интерпретировать в том случае, когда эта модификация специфична. Например, легко идентифицировать область связывания кофермента пиридоксальфосфата в аминотрансферазе. Альд-имин, образующийся в результате конденсации кофермента с е-аминогруппой остатка лизина, восстанавливают борогидридом натрия и идентифицируют, так как он не затрагивается при гидролитическом распаде. Аналогично, ферменты, содержащие тиольные группы, такие как алкогольдегидрогеназа, 3-фосфоглицераль-дегиддегидрогеназа и папаин, обычно ингибируют реакцией с п-хлормеркурибензойной или иодуксусной кислотой. Специфичность модификации белков можно усилить, если структура реаген- [c.282]

Хотя выдвинутая Фишером гипотеза ключа и замка оказалась весьма плодотворной и объясняет многие общие закономерности субстратной специфичности, по мере накопления в последние годы детальной информации о взаимодействиях типа фермент-молекула ее недостатки становились все более очевидными. В буквальном смысле эта теория подразумевает наличие жесткого центра связывания. В то же время имеется большое число данных, как рентгеноструктурных, так и прямых спектрофотометрических и кинетических исследований ферментов в растворе, о конформационной мобильности белков. Мы видели, что тирозин-248 карбоксипептидазы при связывании глицилтирозина сдвигается не менее чем на 1,2 нм, явно меняя природу и форму как участка связывания, так и каталитического центра (см. разд. 24.1.3.4). Это, возможно, крайний случай, однако при наличии рентгеноструктурчых [c.515]

Такие направленные изменения в белках (белковая инженерия) стали важным инструментом для установления роли отдельных аминокислотных остатков в формировании пространственной структуры белка и выполнении им своих функций. В качестве примера можно привести результаты исследования роли остатка тирозина-248, входящего в активный центр карбоксипептидазы А (см. 6.1). После установления пространственной структуры этого фермента с помощью рентгеноструктурного анализа высказывалась точка зрения, что гидроксигруппа этого остатка принимает участие в подаче протона на атом азота гидролизуемой пептидной связи и одновременно в удалении протона от молекулы атакующей воды. Однако, когда методом сайт-специфичного мутагенеза была осуществлена замена этого остатка тирозина на фенилаланин, оказалось, что каталитичесюш свойства фермента практически не изменились. Таким образом, роль гидроксигруппы тирозина-248 в катализе не подтвердилась. [c.306]

Нужно отметить, что специфичность карбоксипептидазы по отношению к субстрату в значительной мере определяется природой С-концевого остатка. Большинство эффективно расш,епляемых субстратов имеет ароматические С-концевые остатки, тогда как концевой пролин блокирует пептид от действия карбоксипептидазы. У а-кортикотропина освобождаются только три аминокислоты, потому что четвертой аминокислотой является пролин. [c.32]

Карбоксипептидаза В, специфичная в отношении концевых пептидных связей, образованных остатками лизина или аргинина, также, вероятно, представляет собой металлонротеид. Это заключение вытекает из того факта, что карбоксипептидаза В ингибируется хелатообразуюш ими агентами, например 1,10-фенантролином. [c.429]

В слизистой кишечника содержатся помимо лейцинаминопептидазы и карбоксипептидаз также и некоторые другие пептидазы. Многие из них, в особенности дипептидазы и трипептидазы, проявляют специфичность в отношении длины цепи субстрата. Функция таких ферментов заключается, по-видимому, в завершении процесса переваривания белков, начинающегося под влиянием ферментов, рассмотренных выше. Некоторые сведения о ферментах, участвующих в процессе пищеварения у человека, суммированы в табл. 49. [c.430]

Карбоксипептидазы А и В образуются при гидролизе трипсином соответствующих прокарбоксипептидазных предшественников, синтезируемых в поджелудочной железе [187J. Из этих двух ферментов более подробно изучена карбоксипептидаза А, и проведено ее детальное исследование методом рентгеноструктурного анализа [29, 188, 189]. Карбоксипептидаза А быка (КПА) представляет собой фермент, содержащий 307 аминокислот в единственной полипептидной цепи, которая прочно связывает 1 г-ион Zn(II) на 1 моль фермента. Необходимость Zn(ll) для ферментативной активности была впервые продемонстрирована тем, что КПА, свободная от иона металла, неактивна, но активность восстанавливается при добавлении Zn(II) [190, 191]. По-видимому, фермент, не содержащий металла, в основном сохраняет структурные свойства активной КПА [191]. Позже на основе данных рентгеноструктурного анализа [29] было четко установлено, что роль иона Zn(ll) при гидролизе пептидов заключается в связывании субстрата. При протеолизе фермент проявляет стереохимическую специфичность, отщепляя С-конце-вую аминокислоту от пептидной цепи только в том случае, если С-концевая карбоксильная группа свободна и если аминокислота имеет L-конфигурацию [192, 193]. Обычно наблюдается более высокая активность, если остаток С-концевой аминокислоты содержит ароматическую группу или разветвленную цепь [194]. [c.76]

Влияние природы атома металла в каталитическом центре распространяется не только на активность, но и на специфичность действия. Б. Л. Валле указывает, что карбоксипептидазы, содержащие кадмий, ртуть и свинец, не обладают способностью гидролизовать пептидные субстраты, но проявляют экстеразную активность. Цинк, кобальт и кадмий соединяются с одним и тем же центром молекулы белка, причем на [c.128]

Так, например, трипсин расщепляет быстрее метиловый эфир бензоиларгинина, чем амид бензоиларгинина [24], а карбоксипептидаза расщепляет с одинаковой скоростью как гиппурил-фенилмолочную кислоту, так и пептид гиппурилфенилаланин [25], Эти опыты сильно поколебали основы классификации ферментов. Поскольку мы не можем классифицировать ферменты иначе, как по их действию на определенные субстраты, мы подразделяем их в зависимости от субстратов на протеазы, эсте-разы, карбогидразы и т. д. Если, однако, трипсин и карбоксипептидаза способны расщеплять эфирные связи и если это расщепление протекает с большей скоростью, чем расщепление соответствующих пептидов, то следует отвергнуть представление о том, что специфичность ферментов характеризуется только типом расщепляемых связей. [c.279]

В то же время цикламы очень слабо захватывают щелочные и щелочноземельные металлы, а из переходных металлов заметно взаимодействуют лишь с Со и Ациклические полиамиды вообще не проявляют никакой избирательности. Таким образом, специфичность к Си достигается на низкомолекулярном уровне. Следует отметить, что в большинстве металлсодержащих ферментов (таких, как карбо-ангидраза, щелочная фосфатаза, карбоксипептидаза и т. д.) имеются соединения (типа имидазола, цистеина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и т. д.), создающие в целом активные центры для удерживания ионов металлов. Для придания полимерам избирательной способности к захвату ионов Си " могут использоваться два следующих метода [c.97]

Некоторые амино- и карбоксипептидазы обладают специфичностью действия, т. е. отщепляют строго определенные Ы- или С-коицевые аминокислоты 3) ускоряют гидролиз дипептидов—дипептидазы (дипептидгидролазы). Последних известно около десяти, они завершают гидролиз белков. [c.121]

Различают несколько типов специ(]щчности абсолютная, абсолютная групповая, относительная групповая и стереохимическая, или оптическая. Абсолютной специфичностью обладают ферменты по отношению только к данному субстрату и не взаимодействуют даже с близкородственными молекулами. Такая специфичность хара р-на, например, для уреазы, асцартазы, аргиназы. Абсолютная групповая специфичность выражается в том, что фермент может действовать на ряд близких субстратов, имеющих о ий тип строения, причем имеет значение не только определенный тнп связи, но и структура прилегающего к ней радикала или радикалов. Примером могут служить глюкозидазы, карбоксипептидаза. [c.128]

Ферменты с карбоксипептидазной активностью выделены из ряда источников [21, 158]. Некоторые из них, как, например, ферменты свиньи [19, 141] и колючей акулы, обитающей в Тихом океане [159, 160], по специфичности очень похожи на карбоксипептидазы быка [21], тогда как другие отличаются от них. Фермент из Pseudomonas, названный карбоксипептидазой G, быстро отщепляет глутамат от С-конца пептидов [161, 162]. Все вышеупомянутые карбоксипептидазы содержат цинк [21] или по крайней мере нуждаются в нем для проявления активности [161]. Модификация тирозина в некоторых из них влияет на активность [21]. Молекулярные массы в тех случаях, когда они определены, близки к [c.554]

Работа Бергмана и сотрудников [47] увеличила наши сведения о специфичности протеиназ, но еще многое осталось сделать в отношении их очистки и выделения. Такие ферменты, как карбоксипептидаза, аминопептидаза и протамииаза особенно пригодны для структурных исследований. Можно надеяться, что доступность кристаллической карбоксипептидазы может открыть путь для строгой проверки однородности этого фермента и затем для экспериментальной оценки специфичности его субстрата, что позволит найти этому ферменту более широкое применение. [c.220]

Групповой специфичностью обладают, например, а-аминоацилпеп-тид—гидролазы (карбоксипептидазы), которые расщепляют в белках и пептидах пептидные связи, находящиеся рядом со свободной карбоксильной группой, и, следовательно, действуют на С-концевые группировки пептидной цепи. В общем виде действие карбоксипептидазы может быть выражено следующим уравнением [c.222]

Металлы входят в активный центр металлофермента и участвуют в образовании фермент-субстратного комплекса, образуя координационные связи с субстратом. Возможно, что ион металла играет роль мостика при образовании фермент-субстратного комплекса. Субстрат взаимодействует при этом с металлом по крайней мере двумя группами, расположенными по обе стороны от связи, расщепляемой при ферментативной реакции. В качестве примера можно рассмотреть механизм действия карбоксипептидазы А, специфичной по отношению к С-концевой аминокислоте, имеющей свободную карбоксильную группу. В этом случае в образовании хелатного комплекса принимает участие концевая карбоксильная группа и карбонильный кислород пептидной связи. Металл — цинк, оттягивая на себя электроны, ослабляет пептидную связь. На основании этой гипотезы структура фермент-субстратного комплекса в случае карбокси-лептидазы А может быть представлена следующим образом [c.245]

Характер металла оказывает влияние на специфичность действия ферментов. Например, карбоксипептидаза А обладает двояким каталитическим действием. Она катализирует гидролиз пептидных и слоншо-эфирных связей. При замене в ферменте цинка кобальтом значительно повышается пептидазная активность и уменьшается эстеразная. Если цинк в карбоксипептидазе А заменить на кадмий, то увеличивается эстеразная активность и резко снижается пептидазная активность. [c.245]

Вторая группа ферментов включает протеазы с химотрипсиновой специфичностью. Сюда также входят ферменты с разной позиционной специфичностью - аминопептидазы [985,1769,18231, карбоксипептидазы [250,252,18241 и эндопептидазы - химотрипсины из разных источников 11715,1825-18271, мышечные протеиназы [1827-18291, пищеварительные ферменты - пепсин [1749,1750,1830-18331 и гастриксин [1832,18331, микробные протеиназы, например входящие в комплекс "проназа" [369,18341, и др. Эти ферменты, как правило, обладают довольно ш1фокой специфичностью, гидролизуя связи, образованные не только ароматическими, но и различными алифатическими аминокислотными остатками. К этой же группе относятся АТР-зависимые протеиназы Es heri hia oll - протеиназы La и Т1, а также, по-видимому, некоторые мышечные высокомолекулярные проте- [c.164]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология