Электрофорез радиоавтография

Рис. 9-9. Замедление в геле. Принцип метода схематически изображен на рис. 9-9, А. Экстракт, полученный из линии клеток, продуцирующих антитела, смешивают с радиоактивными фрагментами ДНК, содержащими последовательность от точки—131 до + 36 (относительно сайта инициации транскрипции в положении +1) гена, кодирующего легкую цепь соответствующей молекулы антитела. Воздействие белков, входящих в состав экстракта, на подвижность фрагмента ДНК определяют методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей радиоавтографией. Свободные фрагменты ДНК быстро передвигаются к концу геля, тогда как фрагменты, связанные с белком, задерживаются. Обнаружение шести зон с замедленным движением указывает на присутствие в экстракте шести различных сайт-специфических ДНК-связывающих белков (обозначенных С1-С6). На схеме Б экстракты фракционировали с помощью стандартной хроматографической методики, каждую фракцию смешивали с радиоактивным фрагментом ДНК, наносили на одну дорожку полиакриламидного геля и анализировали далее, как

Рис. 36.5. Блоттинг-перенос. По методу Саузерна тотальную ДНК, выделенную из культуры клеток или ткани, обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и полученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле. ДНК, несущая отрицательный заряд, мигрирует к аноду. Небольшие фрагменты двигаются быстрее крупных. После окончания электрофореза разделенные фрагменты ДНК подвергают мягкой денатурации, инкубируя гель в растворе щелочи. На следующем этапе гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозу с помощью методических приемов, разработанных Саузерном, и фиксируют полученную нитроцеллюлозную реплику тепловой обработкой. Далее реплику инкубируют с меченым кДНК-зондом, гибридизую-щимся с соответствующим комплементарным фрагментом ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. После интенсивной промывки фильтр помещают на рентгеновскую пленку. Фиксируемые на радиоавтографе сигналы соответствуют расположению фрагментов ДНК, комплементарных последовательности зонда. Метод Нозерн-блот (для анализа РНК) принципиально не отличается от метода переноса по Саузерну (Саузерн-блог анализа). Тотальную РНК подвергают электрофорезу. Сама процедура переноса РНК из геля на фильтр несколько отличается от метода Саузерна, поскольку молекулы РНК менее стабильны, чем молекулы ДНК. Метод Вестерн-блот применяется для выявления определенных белков с помощью

Рис. 2.2, Со5-картирование. Радиоактивные олигонуклеотиды, комплементарные левому или правому липкому концу, гибридизируют с соответствующим сайтом. Затем проводят частичный гидролиз рестриктазой К, разделение фрагментов электрофорезом в агарозном геле и радиоавтографию, позволяющую идентифицировать все меченые фрагменты, полученные в результате неполного гидролиза. Молекулярную массу истинных рестрикционных фрагментов, легко вычислить путем вычитания меньших величин из больших.

Рис. 4.60. Обнаружение глобинового гена. ДНК выделяют из любого препарата клеточных ядер, в ее составе имеются глобиновые гены. Различные рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы) расщепляют ДНК на множество фрагментов (рестриктов), узнавая специфические последовательности нуклеотидов. Фрагменты разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза. Готовят специфический радиоактивный зонд на глобиновый ген и гибридизуют его с фрагментами ДНК Радиоактивный сигнал обнаруживают с помощью радиоавтографии [1252].

Не меньшей популярностью пользуется в настоящее время и метод электрофореза в полиакриламидном геле. Добавляя к раствору акриламида, налитому в стеклянные трубки, различные количества мономеров (например, метиленбисакриламид, этилендиакрилат), образующих в процессе полимеризации поперечные сшивки, можно получить гели с различной степенью связанности [137, 404]. Устойчивость к денатурирующим растворителям, например к 8 М раствору мочевины или 1 %-ному раствору додецилсульфата натрия, составляет еще одно важное преимущество этих гелей. При наложении разности потенциалов белки, пептиды, нуклеиновые кислоты и вирусы передвигаются в этих гелях на характерные расстояния, которые зависят главным образом от их молекулярного веса (или веса частицы), а также от степени связанности сшивок геля. Разделившиеся вещества образуют характерные полосы, которые можно выявить либо с помощью методов окрашивания или локального осаждения, либо (в случае разделения радиоактивных веществ) с помощью метода радиоавтографии (см. гл. XI, разд. Б). Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле такова, что с помощью этого метода можно обнаружить и идентифицировать приблизительно 37 видов рибосомных белков [508]. То, что разделение белка на многочисленные полосы происходит в силу действительного различия между белками, а не в результате каких-то артефактов, теперь уже не вызывает солшений. Однако известно, что разделяться на отдельные полосы могут не обязательно совершенно различные вещества, но и такие близкие между собой вещества, как, например, один и тот же белок, у которого часть молекул содержит одну лишнюю амидную (— СО — NH2 С00 ) группу, а другая часть — ацетильную (—NH+— NH — СОСН3) группу [136]. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле [c.61]

Все методы определения последовательности нуклеотидов основаны на создании исходного набора одноцепочечных фрагментов ДНК, начинающихся в определенной точке и оканчивающихся определенным нуклеотидом, тогда как размеры фрагментов могут быть различны. Каждый такой исходный набор фрагментов затем фракционируют по размерам посредством электрофореза в геле. Фрагменты должны быть помечены радиоактивным изотопом, для того чтобы их размер можно было определять путем радиоавтографии геля. Принципы секвенирования изображены схематически на рис. 9.8. [c.273]

Очень важной областью применения радиоавтографии является обнаружение радиоактивного ДНК-зонда после его гибридизации с препаратом ДНК, подвергнутым электрофоретическому разделению. К сожалению, провести гибридизацию в самом геле невозможно, поскольку зонд не может в него проникнуть. Поэтому ДНК после электрофореза переносят на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр по методу Саузерна (Саузерн-блоттинг) или с помощью элюции. Расположение молекул ДНК на фильтре в точности соответствует таковому в геле. Перенесенную на фильтр ДНК подвергают [c.65]

Секвенирующий электрофорез, радиоавтография и чтение нуклеотидных последовательностей изложены гораздо подробнее в соответствующих главах, специально посвященных этим вопросам. [c.41]

Этот метод широко применяется для локализации радиоактивного материала в клетке, срезе ткани или на пластине геля после электрофореза смеси макромолекул. Для регистрации радиоактивных зон на исследуемый образец накладывают рентгеновскую пленку, в которой под действием радиоактивного излучения из бромида серебра образуется металлическое серебро. Засвеченные участки, соответствующие радиоактивным зонам, наблюдаются визуально после проявления пленки. Одним из вариантов радиоавтографии является флюорография. В этом случае в исследуемый образец импрегнируют сцинтиллятор и вновь накладывают рентгеновскую пленку. Метод основан на том, что низкоэнергетические Р-частицы, образующиеся при распаде изотопа (например, трития), взаимодействуют с молекулами сцинтиллятора, при [c.65]

Используя различные методы окрашивания белков, а в случае радиоактивно меченных белков - метод радиоавтографии (см. разд. 4.5.2), можно выявить следовые количества практически всех полипептидных цепей. За один раз методом двумерного гель-электрофореза можно разделить до 2000 отдельных полипептидных цепей этого достаточно, чтобы выявить большинство бактериальных белков (рис. 4-52). Разрешение этого метода настолько велико, что позволяет разделить два практически идентичных белка, отличающихся одной заряженной аминокислотой. Таблица 4-9 знакомит нас с основными этапами развития методов хроматографии и электрофореза. [c.218]

ТЬ, Ва и 5г на полосе бумаги в результате фокусирующего электрофореза их смеси [1758] (внизу—радиоавтограф полосы) [c.152]

Каждую из четырех смесей фрагментов подвергают электрофорезу на пластинке геля в условиях, обеспечивающих разделение фрагментов в соответствии с числом содержащихся в них нуклеотидных остатков независимо от того, какие это остатки. При таком разделении фрагменты будут двигаться тем быстрее, чем они меньше. Точное положение каждого меченого фрагмента в геле определяют радиоавтографией. Положения меченых фрагментов в каждом из [c.888]

В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу на четырех соседних дорожках в акриламидном геле в денатурирующих условиях затем проводят радиоавтографию, и фрагменты, содержащие радиоактивную метку, оставляют отпечатки на рентгеновской пленке. По их положению можно определить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разрушенное основание, а зная это основание — его положение. Так, по набору полос на рентгеновской пленке определяют нуклеотидную последовательность анализируемого фрагмента ДНК. [c.30]

Характер расположения в мембране того или иного белка можно определить несколькими способами. Один из них основан на том, что меченные (флуоресцентными красителями или радиоактивными изотопами) водорастворимые реагенты не способны проникать через мембрану и поэтому ковалентно связываются со специфическими группами только на ее наружной стороне. После этого мембраны растворяют, белки разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле, а меченые белки идентифицируют либо по радиоактивности (радиоавтография гелей), либо по флуоресценции в ультрафиолетовом свете. Используя такое направленное мечение, можно определить, как конкретный белок (полоса в геле) ориентирован в мембране если он метится одновременно и на внешней стороне (вместе с нативными клетками и тенями без разрывов), и на цитоплазматической стороне (вместе с замкнутыми вывернутыми наизнанку пузырьками), то это, несомненно, трансмембранный белок. Альтернативный подход состоит в обработке либо наружной, либо внутренней поверхности мембраны не проникающими через нее протеолитическими ферментами если какой- [c.363]

Молекула ДНК обладает высоким отрицательным зарядом и, следовательно, в электрическом поле быстро движется к положительному электроду. При электрофорезе в полиакриламидном геле молекулы ДНК разделяются по размеру, так как меньшие молекулы легче и быстрее проходят через поры геля. Молекулы белка, связавшись с ДНК, вызывают уменьшение подвижности ее молекул в геле. Чем больше связавшийся белок, тем медленнее движется связанная с ним ДНК. Это явление лежит в основе метода, регистрирующего сдвиг подвижности в теле. С помощью этого метода удается обнаруживать даже следовые количества сайт-специфического ДНК-связывающего белка. Короткие фрагменты ДНК, длина и последовательность которых известна (полученные либо при клонировании ДНК, либо путем химического синтеза), метят радиоактивной меткой и смешивают с экстрактом клеток полученную смесь наносят на полиакриламидный гель и проводят электрофорез Если фрагмент ДНК соответствует области хромосомы, с которой связываются многие сайт-специфические белки, то при радиоавтографии выявляется серия полос, обладающих разной подвижностью. Белки, связанные с ДНК в каждой из полос геля, можно отделить, фракционируя затем клеточные экстракты (рис. 9-9). [c.102]

Таким образом, для полного анализа последовательности любого полинуклеотида необходимо иметь, во-первых, метод получения четырех наборов специфических концевых продуктов, подобных тем, которые приведены втаблице 12, и, во-вторых, метод, позволяющий проводить сравнение длин этих продуктов. Различие современных методов анализа заключается в способах получения наборов специфических фрагментов. Общность — в способе сравнения длин, которое во всех случаях производится путем электрофореза радиоактивных концевых продуктов в пластинках полиакриламидного геля. По окончании электрофореза положение продуктов в геле определяют путем радиоавтографии. Каждый продукт проявляется в виде темной полосы на рентгеновской пленке сравниваются относительные подвижности полос в разных дорожках, подобно тому как сравнивались длины продуктов в таблице I. Картина распределения полос на рисунке 180 соответствует последовательностн олигонуклеотидов в таблице 12. Это следует нз анализа относительных подвижностей продуктов самый подвижный и, следовательно, самый короткий продукт обнаруживается в дорожке С, следующий по подвижности н длине — в колонке Т, далее — в колонке С, следующие два — в колонках Т и А соответственно и т. д. Выписывая таким образом названия колонок в порядке, в котором в них обнаруживаются последовательно удлиняющиеся продукты, получают формулу исходного олигонуклеотида. [c.321]

Тотальную ДНК из клеток человека гидролизуют эндонуклеазой примерно на 500000 фрагментов длиной от 10 до 10 нуклеотидных пар. Затем фрагменты разделяют по молекулярной массе с помощью гель-электрофореза в агарозе, после чего ДНК денатурируют щелочью прямо в геле, чтобы получить одноцепочечные фрагменты. Их переносят на нитроцеллюлозный фильтр и фиксируют высушиванием при 80°С. В результате получается отпечаток (реплика) картины разделения фрагментов ДНК по их размеру. Эти фрагменты можно идентифицировать методом гибридизации с радиоактивными ДНК-зондами, специфичными для определенных генов или хромосом. Любой фрагмент, содержащий всю последовательность зондируемого гена или его часть, будет выглядеть на радиоавтографе в виде темной полосы (рис. 4.60). [c.126]

Для обнаружения рибосомных белков после электрофореза можно использовать любой применяемый после электрофореза в геле метод выявления белков (например, окрашивание амидовым черным 10 В, кумасси ярким синим К-250 или 0-250, а в случае радиоактивных белков -радиоавтографию). Недавно [c.314]

Очень часто для решения биотехнологических и некоторых других задач бывает необходимо знать полную нуклеотидную последовательность клонированного гена. Для секвенирования используют несколько методов один из них - ди-дезокси-метод, разработанный Сангером и др. В его основе лежит остановка синтеза цепи после присоединения к ней дидезоксинуклеотида. У такого нуклеотида отсутствует 3 "-гидроксильная группа, и дальнейший рост цепи становится невозможным. Для секвенирования в разных пробирках одновременно проводят четыре реакции синтеза ДНК, каждая - в присутствии одного из четырех дидезоксинуклеотидов. Продукты реакций разделяют с помощью гель-электрофореза, проводят радиоавтографию и считывают с радиоавтографа нуклеотидную последовательность синтезированного фрагмента ДНК. [c.103]

Для анализа РНК. кодирующих альбумин, с помощью ДНК-зонда используется метод Нозерн-блоттинга. На первом этапе с помощью гель-электрофореза, фракционируют интактные молекулы РНК дефектных и контрольных клеток печени и пол чают набор полос. Для гого чтобы молекулы РНК, содержащиеся в геле, сделать более доступными ДНК-зонду, осуществляют перенос (блоттинг) фракционированных молекул РНК из геля на лист нитроцеллюлозы. На следующем этапе лист нитроцеллюлозы инкубируют с раствором, содержащим меченый ДНК-зонд. Полосы РНК, гибридизующиеся с зондом, выявляют методом радиоавтографии (рис. 4-72). Известно, что скорость движения молекул нуклеиновых кислот в геле зависит от их размера при электрофорезе малые молекулы перемещаются быстрее, чем большие. Сравнивая [c.239]

Известно, что каждый нуклеотид в ДНК несет фосфатную группу, которая заряжена отрицательно, поэтому фрагменты ДНК различной длины заряжены неодинаково. Эти различия можно использовать для разделения фрагментов ДНК в электрическом поле методом гель-электрофореза (рис. 25.4). Как следует из названия метода, он предполагает использование агарозного (для очень больших фрагментов) или полиакриламидного (для фрагментов меньших размеров) геля. Поскольку ДНК бесцветна, положение того или иного фрагмента в геле после электрофореза выявляют либо с помошью окращивания, либо используя радиоактивно меченную ДНК и проводя радиоавтографию, в ходе которой на гель накладывают фотографическую пленку. Радиоактивное излучение засвечивает пленку в том месте, где расположена ДНК. [c.219]

Методы секвенирования различаются в первую очередь по способу радиоактивного мечения, и кроме того по способу вьщеления исходного набора фрагментов. Представленная на рис. 9.8 схема основана на методе, разработанном Максамом и Гилбертом. Рестрикционный фрагмент метят радиоактивным изотопом Р в 5 -конце с использованием [у - Р] АТР и фермента, называемого полинуклеотидкиназа. Затем комплементарные цепи разделяют и в них независимо определяют последовательность нуклеотидов. На рис. 9.8 изображена одна цепь звездочка обозначает радиоактивную метку Р на 5 -конце. Четыре отдельных образца этого фрагмента подвергают действию различных реагентов, в результате чего образуется четыре исходных набора фрагментов различной величины. Фрагменты каждого из этих наборов на 5 -конце содержат радиоактивную метку, а на другом конце - определенный нуклеотид (см. рис. 9.8). (При этом образуются также наборы фрагментов с одинаковыми З -кон-цами, однако, эти фрагменты не попадают в поле зрения исследователя, поскольку не содержат радиоактивной метки). Затем четыре исходных набора фрагментов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле бок о бок . Положение каждого фрагмента в геле можно зафиксировать на обычной рентгеновской пленке. При этом обнаруживается набор полос, каждая из которых соответствует фрагменту определенного размера. Изображенная на рис. 9.8 последовательность фрагментов позволяет прямо с рентгеновской пленки считывать последовательность нуклеотидов, начиная с 5 -конца (т. е. снизу). На рис. 9.9 представлены реальные результаты радиоавтографии геля после электрофореза фрагментов. Как указывается в подписи к рисунку, в действительности нет необходимости в том, чтобы разрезание фрагментов исходного набора производилось по одному и тому же нуклеотиду. [c.273]

Применение радиоактивных изотопов значительно повышает чувствительность аналитических методов и позволяет проводить такие исследования, которые иначе было бы невозможно выполнить. Поэтому было приложено немало усилий, чтобы разработать методы выявления радиоактивных веществ после электрофореза в различных поддерживаюии1Х средах. Чувствительность определения радиоактивности зависит преимущественно от следующих факторов во-первых, от энергии и природы излучения и, во-вторых, от свойств поддерживающей среды. Па-пример, у-лучи легко обнаружить в любой электрофоретической среде, тогда как для обнаружения р-излучателей, особенно Н, и 5, требуется либо тщательная подготовка опыта, если они определяются с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика, либо высокая концентрация этих изотопов или длительное время экспозиции, если применяется радиоавтография. [c.204]

С использованием полинуклеотид-киназы осуществляют перенос от [у = = "Р] АТР к 5 -концу интактной молекулы ДНК фага X. Затем необходимо провести полное расщепление меченой ДНК рестриктазой Яш dlll. Рестрикщсонные фрагменты разделяют с помощью электрофореза и идентифицируют положение каждого из фрагментов после окрашивания геля в растворе бромистого этидия. После этого гель накладывают на рентгеновскую пленку для идентификации двух меченых концевых фрагментов с помощью радиоавтографии. [c.282]

Для электрофореза в полиакриламидном геле используются разнообразные выпускаемые промышленностью и самодельные приборы. Мы предпочитаем те приборы, которые позволяют проводить разделение в тонких пластинах геля, что обеспечивает оптимальное разрешение. Лучшее разрешение на пластинах обусловлено тем, что возникающее во время электрофореза тепло здесь легко рассеивается, а также тем, что гель после электрофореза можно быстро фиксировать. Последнее важно для того, чтобы свести к минимуму диффузию белка в полосах. Пластины позволяют одновременно сравнивать много проб, и их легко сохранять после высушивания на листах фильтровальной бумаги. Радиоактивность в пробах выявляют радиоавтографией и фотофлюорографией, а высушенные на фильтровальной бумаге гели можно легко нарезать ножницами или резаком и после повторного насыщения водой вырезанных сухих полосок просчитывать на сцинтилляционном счетчике. Если не требуется большая разгонка в геле, электрофорез, фиксацию, окраску и высушивание успевают проводить за один день. [c.156]

Pu . 81. Двухмерный электрофорез белков E. oli 5333 [935]. Первое направление— изоэлектрофокусирование (ИЭФ) в амфолинах с pH 5—7 второе направление-электрофорез в ДСН-содержашем полиакриламидном геле с градиентом концентрации геля 9—15%. Нанесено около 15 мкг белка (300000 имп./мин). Белки локализовали методом радиоавтографии. [c.233]

Показано, что описанный метод обладает высокой воспроизводимостью и большой разрешающей способностью. Он позволяет обнаружить и количественно определить с помощью радиоавтографии белок, составляющий 10 —10 % общего количества белков в образце, что свидетельствует о его высокой чувствительности. Проведение двухмерного электрофореза не требует специального оборудова1ния. Первый этап разделения осуществляют обычно в цилиндрических гелях, для которых подходит любой прибор, предназначенный для диск-электрофореза. Точно так же на втором этапе используют любой тип приборов, пригодных для электрофореза на пластинах геля. Сконструированы также специальные приборы для двухмерного электрофореза. Кальтшмидт и Витманн, [654] описали прибор, в котором одновременно можно проводить электрофорез на 5 пластинах геля. [c.234]

Смотреть страницы где упоминается термин Электрофорез радиоавтография: [c.252] [c.109] [c.67] [c.92] [c.378] [c.344] [c.56] [c.56] [c.62] [c.78] [c.182] [c.185] [c.48] [c.344] [c.274] [c.285] [c.156] [c.233] [c.142] [c.33] [c.133] [c.170] [c.50]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология