Белки, комплексы с металлами методы исследования

Из 102 элементов периодической системы в живых организмах обнаружено не менее 60. Многие из них относятся к металлам и встречаются в живых клетках в виде разнообразных комплексных соединений. Уже давно стало ясно, что металлы, даже встречающиеся в живых тканях в крайне низких концентрациях (так называемые микроэлементы), и их комплексы — это не случайные примеси, а биологически важные компоненты клетки. Множество патологических нарушений, связанных с недостаточностью в клетке железа, меди, цинка, марганца, молибдена, кобальта, не говоря уже о более распространенных в живых тканях металлах кальции, магнии и др., имеют большое значение для биохимии животных и растений, а также для прикладных областей. Исследования биохимических процессов, в которых участвуют ионы металлов, представляют сравнительно новую, но уже вполне определившуюся и быстро развивающуюся область науки, называемую бионеорганической химией. К ней относится также и моделирование структурных и функциональных параметров природных комплексов металлов. Несмотря на значительные различия выполняемых физиологических функций, типов катализируемых реакций и структур реакционных центров, ферменты, являющиеся предметом исследования в бионеорганической химии, объединяет одна особенность— участие ионов металлов или в самом каталитическом акте, или в поддержании третичной или четвертичной структуры белка, необходимой для оптимального функционирования фермента. Это определяет известную общность подходов к изучению ферментов указанной группы и выбор некоторых методов исследования, заимствованных, с одной стороны, из арсенала энзимологии, а с другой - из химии координационных соединений. [c.5]

В предыдущих разделах были кратко рассмотрены причины значительно более поверхностного описания деталей стереохимии при рентгеноструктурном анализе белков по сравнению с описанием малых низкомолекулярных соединений. Однако для успешного исследования зависимости между структурой и активностью требуется более высокая точность структурных данных. Поскольку мы стремимся к более глубокому пониманию поведения активного центра или функциональных областей этих биологических макромолекул, необходимо повысить разрешающую способность дифракционных методов. Малые изменения конфигурации аминокислотных остатков в области центра связывания металла и изменения стереохимии комплексов металла в ходе каталитического процесса должны быть тщательно изучены, в особенности при исследовании ферментов, требующих участия иона металла. Как указывалось в разд. 1.2.1, описание этих структурных изменений позволяет определить стереохимическую природу электронных перестроек, происходящих при взаимодействии молекул субстрата и фермента и ответственных за каталитическое действие. [c.24]

РАССМОТРЕНИЕ КОМПЛЕКСОВ МЕТАЛЛОВ С БЕЛКАМИ И МЕТОДЫ ИХ ИССЛЕДОВАНИЯ [c.275]

Число связывающих центров и их сродство можно определить прямыми методами, такими, как равновесный диализ [2] или хроматографическая гель-фильтрация [3]. Во всех исследованиях такого типа число связанных ионов металла определяется непосредственно анализом концентрации комплекса металла с белком как функции равновесной концентрации свободного иона металла. При изучении связывания с металлом особенно важны значения pH как для получения достоверных данных, так и для их интерпретации (разд. 3), и в зависимости от цели исследования значения pH могут поддерж иваться постоянными или изменяться. По возможности следует избегать большинства буферов из-за конкуренции между белком и буфером за металл, а также из-за возможности образования тройного комплекса, включающего металл, белок и буфер [4]. Со спосо бами обработки первичных данных с целью определения числа различных центров связывания и оценки их сродства можно ознакомиться в специальных руководствах [c.275]

Таким образом, исследование ДОВ, АДОВ и КД эффективно при определении а-спиральности белков и полипептидов. С другой стороны, весьма перспективно изучение ИОА комплексов белков с красителями и ионами металлов, ИОА коферментов и простетических групп. Такие исследования дают сведения о конформациях и в сочетании с химией позволяют расшифровать события, протекающие в активном центре ферментов (см. гл. 6 и [135]). Изучению структуры белков методом КД посвящен обзор [272]. [c.319]

Для карбоксипептидазы А (КПА) из поджелудочной железы быка известны и трехмерная структура [1—3], и полная аминокислотная последовательность [4]. Роль существенно важного металла установлена менее определенно, но она доступна изучению с помощью разнообразных спектроскопических [5, 6] и кинетических [7, 8] методов. Следовательно, этот фермент можно включить во все увеличивающийся список белков, для которых возможно провести корреляции структуры и функции. Любой предлагаемый механизм катализа под действием КПА должен теперь учитывать как накопленные химические данные, так и взаимодействия, наблюдавшиеся при структурном исследовании кристаллов комплекса карбоксипептидазы с модельным субстратом глицил-ь-тирозином [3, 9]. [c.504]

Развитие рентгеноструктурного анализа — это увлекательная история, начинающаяся с выяснения структуры одноатомных металлов и минеральных солей. В настоящее время этот метод используют для изучения очень сложных молекул, таких, как белки и вирусы. Число органических и металлорганических соединений, изученных с помощью рентгеноструктурного анализа, приближается к 50 ООО. Результаты этих исследований собраны в банке структурных данных [136], обеспечивающем порядок и полноту информации [137]. Целью этой главы являлось рассмотрение факторов, определяющих развитие метода, а именно наличие автоматических дифрактометров, цифровых вычислительных. машин, систем и комплексов кристаллографических программ. Прогресс в кристаллографии тесно связан с прогрессом в технологии компьютеров и ди-фрактрометров (пример — успешная разработка координатного детектора [138]), а также с развитием новых методов решения и уточнения структуры. Благодаря доступности метода и программ современная кристаллография стала популярным методом исследования. В исследовательских проектах, требующих точных структурных данных, неспециалисты в кристаллографии получают результаты, которые невозможно получить другими методами. Мы не пытались рассмотреть здесь многочисленные публикации, посвященные изучению разнообразных химических соединений. [c.269]

Следовательно, вызывает удивление тот факт, что нуклеаза стафилококка не проявляет гидролитической активности в присутствии Ьа(1П),У(111) или Еи(П1) [296]. Однако сравнительное исследование [309] влияния катионов лантанидов на активацию а-амилазы — Са(П)-содержащего металлофермента — показывают, что не все катионы лантанидов одинаково эффективны при замещении Са(И). Как указывали Смолка и др. [309], прямое сравнение ионных радиусов редкоземельных элементов с радиусом Са(И) затруднено, поскольку при определении радиусов катионов металлов методами дифракции рентгеновских лучей были использованы различные кристаллические соли и окислы. Кроме того, для комплексов лантанидов с ЭДТА [314, 315], которые могут рассматриваться как аналоги многофункционального центра связывания в белке, характерны высокие координационные числа, вплоть до 10. Дополнительные по сравнению с большинством комплексов Са(П) координационные места обычно заняты молекулами растворителя. Этот структурный фактор может оказаться существенным при связывании лантанидов с нуклеазой стафилококка. [c.121]

Определить число имеющихся связывающих центров и оценить их относительное сродство, кроме того, можно непрямыми методами исследования, в которых за связыванием наблюдают по изменению некоторого свойства системы при координации металла с белком. Такие методы, из которых наиболее типичными являются потенциометрическое титрование (разд. 3) и различные спектроскопические методы, требуют знания некоторых количественных соотношений между величиной эффекта и степенью связывания. И преимущества этих методов и их ограничения зависят от степени различия в свойствах комплексов, образующихся при координации металла к различным центрам. Например, таким путем можно четко идентифицировать слабый связывающий центр, который МОЖНО и не обнаружить с помощью прямого метода исследования для этого иеобходимо лищь, чтобы свойства этого центра были достаточно характерными. [c.276]

Вследствие сложности экспериментальной техники и ограниченного набора ядер, способных к мессбауэров-скому взаимодействию, ядерную С. начали использовать для исследования полимеров лишь недавно. Метод м. б. использован для изучения химич. строения катализаторов и механизма инициирования при твердофазной полимеризации природы химич. связей мессба-уэровских ядер, входящих в макромолекулы поверхностных явлений на границе раздела полимер — субстрат, если в последнем имеются мессбауэровские ядра (напр., адгезии полимеров к субстратам, содержащим металлы) локальных магнитных полей вблизи атомов железа, входящего в виде малых примесей в состав природных полимеров (ДНК и ее комплексов с белками) свойств армированных пластиков, наполнитель к-рых одержит мессбауэровские ядра (напр., стеклопластиков, если в состав стекла входят атомы Sn или W). [c.235]

Исследование лигандного окружения атомов металла в ксантин-оксидазе затрудняется тем, что ни Мо, ни Fe не удается обратимо заменить на другие атомы металлов, которые могли бы служить спектроскопическими зондами [9, 33, 34]. Однако нативный фермент поглощает в видимой области. В литературе имеются некоторые разногласия относительно природы хромофорной группы, определяющей это поглощение, но, по-видимому, все исследователи согласны в том, что поглощение определяется не молибденсодержащим компонентом. Имеется сообщение о том, что ксантиноксидаза, в значительной мере очищенная от железа (до 0,3 г-атом Fe на 1 моль белка), характеризуется спектром поглощения, почти совпадающим с таковым для исходного фермента [35]. Сходство в спектрах поглощения, кругового дихроизма и дисперсии оптического вращения ксантиноксидазы и ферредоксина шпината (рис. 36) привело к заключению, что оба фермента содержат одинаковые хромофоры, а именно серусодержащие комплексы железа. Более высокая интенсивность поглощения ксантиноксидазы может рассматриваться как следствие того, что в ее молекуле содержится восемь атомов железа, тогда как в молекуле ферредоксина шпината имеются только два атома железа. Методом ЭПР показано, что в ксантиноксидазе, инактивированной метанолом, молибден находится в состоянии Mo(V). Окисленный фермент в активном состоянии, вероятно, содержит Mo(VI). Можно было бы ожидать различий в оптических спектрах активного и неактивного фермента, определяемых перехо- [c.274]

К числу прямых методов, используемых для идентификации атомов или боковых цепей, к которым присоединяются ионы металлов, относятся рентгеноструктурный анализ (см. исследование миоглобина) и ядерный магнитный резонанс (см. изучение ион металла — РНаза, разд. 4.6). Кроме того, для этой цели используются различные непрямые методы. К числу последних относятся исследование влияния модификации боковой цепи специфического бел-ка на связывание с металлом, титриметрические определения значений рКа. участвующих в координации лигандных групп (разд. 3), и, по мере щозможности, корреляция спектров комплекса иона металла с белками со спектрами подходящих модельных систем. Хотя в случае металлопротеинов это последнее и рискованно, оно оказалось особенно плодотворным для изучения неспецифических комплексов ионов металлов с белками. Исследование влияния модификации белка на связывание с металлом несомненно играет полезную роль, однако при этом необходимо учитывать возможность того, что модификация боковой цепи, которая ранее не участвовала в связывании, может повлиять на него 1В результате изменения либо общего заряда на белке, либо его конформации. [c.276]

Характеристическая красная и желтая окраски комплексов железа и меди с сидерофилинами не развиваются в отсутствие бикарбоната. Отсюда следует, что этот ион играет главную роль в комплексообразовании металлов с белками [5]. Прямое измерение количества двуокиси углерода, выделяющейся при кислотной денатурации комплексов с железом [42], медью [69], хромом, марганцем и кобальтом [45], подтвердило сделанное ранее предположение Шэйда [5] о том, что на каждый связанный ион металла связывается один бикарбонатный ион. Связывание бикарбоната не является обязательным, и это было продемонстрировано серией исследований связывания металла с трансферрином методом спектроскопии электронного парамагнитного резонанса, которые показали, что специфическое связывание, по крайней мере железа и меди, может происходить и в отсутствие бикарбоната [70]. Образующиеся при этом комплексы были бесцветны и поэтому недетектируемы до появления метода ЭПР. Очевидно, в отсутствие бикарбоната связь железо — белок гораздо слабее, чем в его присутствии, так как при стоянии не содержащего бикарбоната комплекса железа с трансферрином при нейтральных или более высоких значениях pH наблюдается гидролиз железа с образованием нерастворимого гидроксида железа(III). Возможная физиологическая роль этого эффекта будет обсуждена в разделе, посвященном биологическим функциям сидерофилинов. [c.344]

Многие из общих подходов к исследованию механизма действия ферментов также применимы и к изучению роли ионов металлов в ферментативном катализе. Схемы координации, описывающие взаимодействие фермента, металла и лиганда, могут быть изучены методами, применяемыми при определении стехиометрии и сродства связывания белками небольших молекул. Эти методы включают гель-фильтрацию в присутствии или в отсутствие небольших молекул [49], метод скоростного диализа [50], ультрафильтрацию, метод ультрацентрифугирования по Хейесу — Велику [52], равновесный диализ [53], а также методы для измерения только сродства взаимодействия [54—58]. Выбор схемы координации ионов металлов и лигандов с ферментами с помощью этих методов возможен только при отсутствии влияния других факторов. Например, если образуется комплекс Е — лиганд — М +, фермент должен проявлять значительное сродство к иону металла только в присутствии лиганда. И, наоборот, если образуется комплекс Е — М + — лиганд, то не должно происходить значительного связывания лиганда в отсутствие иона металла. Однако практически ферменты часто проявляют склонность к связыванию обоих компонентов комплекса, невзирая на выбранную схему координации. Следовательно, важны данные, полученные с учетом стехиометрических и кинетических критериев. Такие важные типы комплексов, как Е — лиганд — М + и Е — М + — лиганд, обычно содержат все три компонента в эквимолярных количествах. Более [c.449]

Поглощение излучения растворами, содержащими макромолекулы или низкомолекулярные растворенные вещества, можно исследовать в трех участках электромагнитного спектра, соответствующих различным типам поглощения излучаемой энергии системой. В области видимого и ультрафиолетового (УФ) света излучение вызывает возбуждение электронов. Органические молекулы поглощают видимый свет лишь в том случае, если они содержат большие резонирующие системы, а макромолекулы этого типа в растворе не изучались. Однако в некоторых случаях сильное поглощение видимого света обусловлено образованием комплексов ионов переходных металлов с макромолекулами, как, например, при исследовании гемоглобина и других белков, содержащих железо-порфириновый комплекс, связанный с макромолекулой [488]. Узко специфические проблемы, касающиеся спектроскопии таких материалов, рассматриваться не будут, и наше обсуждение будет ограничено применением УФ-спектроскопии, которая находит широкое применение при исследовании макромолекул. Спектральное поглощение в инфракрасной (ПК) области возникает в результате переходов между вращательными и колебательными уровнями. Как УФ-, так и ИК-спектроско-пия являются мощными средствами анализа полимеров. В качестве примера можно привести использование УФ-спектров для анализа сополимеров стирола или винилпиридина с неароматическими сомономерами, а также применение ИК-снектроскопии для исследования 1,А-цис-, 1,А-транс- или 1,2-присоединения в полибутадиене. Такой анализ основан на предположении, что вклады, вносимые мономерными остатками в измеряемую оптическую плотность, аддитивны. Для большого числа случаев это предполон<ение, но-видимому, является очень хорошим приближением. Однако следует заметить, что такие спектроскопические исследования в целом не зависят от растворимости образца и поэтому выходят за рамки нашего обсуждения, предметом которого УФ- и ИК-спектры являются лишь постольку, поскольку они специфически характеризуют растворенные молекулы. Совершенно иным является положение для поглощения в радиочастотной области, вызванного квантованными переходами в ориентации магнитных моментов некоторых атомных ядер во внешнем магнитном ноле. Разрешение, достигаемое нри исс. те-довании методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР), значительно выше для жидких образцов, чем для твердых. Следовательно, изучение спектров ЯМР растворов макромолекул необходимо для выяснения таких данных о полимере, которые нельзя получить для твердых образцов. [c.172]