РНК-зонды синтез, методы

Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК - источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена. [c.67]

Нозерн-блоттинг. Метод переноса РНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр, на котором положение определенной молекулы РНК выявляют с помощью гибридизации с радиоактивным зондом. Обратная транскрипция. РНК-зависимый синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой. Палиндром. Участок двухцепочечной ДНК, в которой последовательность одной из цепей идентична последовательности другой цепи, прочитанной в обратном направлении. [c.51]

С разработкой быстрых и недорогих методов химического синтеза фрагментов ДНК методология молекулярно-биологических исследований ДНК существенно изменилась. Химически синтезированные олигонуклеотиды можно использовать для конструирования целых генов или их фрагментов, для амплификации специфических фрагментов ДНК, для направленных мутаций изолированных ДНК, а также в качестве зондов при гибридизации и в качестве линкеров, облегчающих клонирование. [c.47]

В этой главе рассматриваются методы синтеза и использования в экспериментальных целях РНК, полученной in vitro с помощью РНК-полимераз фагов SP6, Т7 и ТЗ. Основное внимание мы уделили использованию радиоактивных РНК-зондов для рутинного анализа нуклеиновых кислот и не пытались изложить, кроме как в самых общих чертах, более специальные аспекты их применения, например для гибридизации in situ, в качестве смысловой мРНК или трансляционных матриц. По таким вопросам мы постарались дать ссылки на ключевые работы, которые позволят хорошо разобраться в технических возможностях этих методов. [c.12]

Степень сохранения парамагнитной моделью исходной активности обычно определяют с помощью биологических или фармакологических тестов [2—5]. Однако в ряде случаев перед синтезом парамагнитной модели бывает важна предварительная оценка изменения структуры молекулы при модификации тех или иных ее участков нитроксильным радикалом. Эта информация полезна также и при использовании полученных таким образом радикалов в качестве спиновых меток и зондов. С целью применения для решения этой задачи развиваемого нами метода — структурно-информационного анализа, а также для опробования и определения ограничений этого метода на конкретной группе химических соединений мы и предприняли данную работу. [c.119]

Ко времени возникновения метода спинового зонда уже имелся ряд существенных исследований по теории формы спектра ЭПР свободных радикалов [1, 2]. К этому же времени был осуществлен синтез первых стабильных органических нитроксильных радикалов [c.5]

Химические свойства нитроксильных радикалов определяют возможности синтеза разнообразных зондов и меток, определяют их стабильность в исследуемых системах, а также служат основой для создания ряда специфических технических приемов исследования в методе спинового зонда. Поэтому ниже будут кратко изложены самые основные сведения по химии нитроксильных радикалов. Значительно полнее эти вопросы освещены в монографии [21]. [c.8]

Были сконструированы специальные векторы, в которых содержались промоторы для РНК-полимераз фагов 5Р6, Т7 пли ТЗ, расположенные в непосредственной близости от сайтов клонирования распространенных фаговых и космидных векторов. Наличие таких промоторов делает возможным быстрый синтез радиоактивных РНК-зондов, специфичных по отношению к концам клонированного фрагмента ДНК полученные зонды представляют собой идеальный инструмент для прогулки по геному . Это общий метод выделения фрагментов ДНК, располагающихся в геноме по соседству с уже клонированным в составе соответствующего вектора участком ДНК. Постановка таких экспериментов с использованием космид описана в работе [26] и гл. 2 этой книги. [c.37]

С помощью метода Саузерна можно составить рестрикционную карту генома в участке исследуемого гена и установить, несет ли данный ген какие-либо дефекты. Так, разработаны эффективные методы синтеза искусственных ДНК-зондов, которые используются в [c.36]

Полимеразная цепная реакция, ПЦР (Polymerase hain rea tion) Метод амплификации специфического сегмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-поли-меразы с использованием олигонуклеотидных ДНК-зондов, комплементарных последовательностям противоположных цепей ДНК, фланкирующим амплифицируемый сегмент. Процесс состоит из серии циклически повторяющихся реакций денатурации ДНК, отжига зондов, синтеза ДНК. [c.557]

Рис. 4.12. Получение меченого ДНК-зонда методом случайных праймеров. К денатурированной двухцепочечной ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которую предполагается использовать в качестве зонда, добавляют гексануклеотиды (смесь всех возможных комбинаций из шести нуклеотидов) и отжигают смесь. Некоторые из олигонуклеотидов гибридизуются с немеченой денатурированной ДНК, и в присутствии фрагмента Кленова и четырех с1НТР (один из которых меченый [ ]) служат затравкой для синтеза комплементарной цепи. После денатурации синтезированной ДНК получают смесь меченых фрагментов ДНК, которые вместе составляют практически полноразмерную исходную ДНК-матрицу.

С разработкой в начале 80-х гг. быстрых, эффективных и недорогих методов химического синтеза олигонуклеотидов появилась возможность использовать радиоактивно меченные олигонуклеотидные зонды для выявления различий между нуклеотидными последовательностями, в частности для обнаружения мутаций у человека. К тому времени было изолировано относительно небольшое число генов, главным образом в виде комплементарных ДНК (кДНК), поэтому подбор зонда, гомологичного конкретному гену, представлял собой непростую задачу. Но даже если соответствующие кДНК были получены, невозможно было различить нормальный и мутантный гены чело- [c.189]

Данные о кинетике формирования надмолекулярной структуры сетчатых полимеров могут быть получены с помощью различных методов электронной и оптической микроскопии [167—170], электронно- и рентгенографии [171]. Полезную информацию могут дать также и некоторые другие методы [116, 168, 170, 172—176], в частности ИК- и ЯМР-спектроскопия, различные варианты релаксационной спектрометрии, методы парамагнитных и люминесцентных зондов и меток, исследование процессов диффузии различных жидкостей и газов. Эти методы решения указанной выше задачи не имеют принципиальных отличий от приемов решения аналогичных задач для линейных полимеров, однако следует обратить внимание на трудности интерпретации надмолекулярной организации сетчатых полимеров, полученных в виде тонких пленок на различных твердых поверхностях [177]. Эти исследования приобрели большой размах, поскольку сетчатые полимеры широко используются в качестве связующих для композиционных материалов, клеев, покрытий, лаков и т. п. Формирующаяся в процессе синтеза сетчатого полимера на поверхности твердого тела надмолекулярная структура в значительной мере будет определяться не только химическим строением исходных мономеров (олигомеров) и условиями синтеза, но и наличием твердой поверхности. Дифференциация этих факторов является трудной задачей, а пренебрежение влиянием твердой поверхности на процесс С1штеза сетчатого полимера и формирование его надмолекулярной организации может привести к серьезным ошибкам в интерпретации экспериментальных данных [176]. [c.36]

В настоящее время большое количество работ посвящено исследованию методом спинового зопда тех лиотропных жидких кристаллов и коллоидных систем, которые имеют слоистую структуру и могут, хоть в какой-то степени, моделировать липидные области биологических мембран. Успехи в исследовании структуры жидкокристаллических липидных или липидоподобных слоев связаны прежде всего с синтезом радикалов с оксазолиди-новым кольцом, таких, например, как снин-меченые жирные кислоты СП (те, п) или спин-меченые молекулы фосфолипида СПТ(т, п). Подобные зонды, встраиваясь в жидкокристаллические слои лиотропных жидких кристаллов, позволяют получать информацию о различных глубинных участках слоя в зависимости от того, в каком положении углеводородной цепи находится радикальная группа. Существенно также, что эта группа жестко связана с атомами самой цепи, поэтому все сведения, извлекаемые из спектра ЭПР такого зонда о поведении радикального фрагмента, непосредстветтно относятся и к спин-меченому звену углеводородной цепи. [c.172]

Как видно из материала, представленного в книге, за десять лет своего существования техника спинового зонда оформилась практически в самостоятельный метод, который с успехом применяется для исследования структуры и кинетических характеристик всевозможных конденсированнх сред. Так же, как успешное развитие метода за это время, его последующее развитие зависит от уровня развития теории ЭПР, состояния методики эксперимента и успехов в области синтеза соединений, могущих быть использованными в качестве спиновых меток и зондов. [c.196]

Таким образом, исследователи владеют эффективным методом, позволяющим определить время репликации любого гена, для которого имеется ДПК-зонд. Оказалось, что во всех изученных клетках гены домащнего хозяйства (т. е. те. которые активны во всех клетках) реплицируются в ранней 8-фазе. Напротив, гены, активные в некоторых типах клеток, реплицируются рано лищь в тех клетках, где они активны, и позже в других типах клеток. Например, при изучении таким способом длинных последовательностей гена иммуноглобулина размером 300000 нуклеотидных пар оказалось, что в клетках, где этот ген активен, все области хроматина, в состав которого он входит, завершают свою репликацию в начале 8-фазы. Вероятно, это связано с существованием внутри гена нескольких точек начала репликации, активирующихся примерно в одно и то же время. Иная картина наблюдается в тех клетках, где синтез иммуноглобулина отсутствует. С помощью ДИК-зондов была выявлена единственная репликационная вилка, которая возникла на одном конце этого участка хромосомы примерно через час после начала 8-фазы и затем двигалась вдоль ДНК с постоянной скоростью около 3000 нуклеотидов в минуту. [c.140]

Анализ политенных хромосом свидетельствует о том, что в интерфазном ядре каждая хромосома расположена отдельно, т.е разные хромосомы не сильно перевиты друг с другом (рис. 9-98) Более того, установлено, что в интерфазном ядре и другие типы хромосом, а не только политенные, стремятся занять дискретные домены Папример, методом гибридизации in situ с соответствующими ДПК-зондами можно выявить отдельную хромосому в гибридных млекопитающих, растущих в культуре (рис. 9-99). Замечено, что большая часть ДПК такой хромосомы занимает очень небольшую часть интерфазного ядра. Этот факт свидетельствует о том, что каждая отдельная хромосома остается компактной и структурированной, благодаря чему отдельные ее части могут активно участвовать в синтезе РПК. [c.168]

Первым ферментом, широко использовавшимся для синтеза РНК-зондов, стала РНК-полимераза фага SP6 [4]. Это в основном было обусловлено исключительно высокой стабильностью фермента и возможностью получать его в больших количествах с помощью простых методов — в отличие от ферментов фагов Т7 и ТЗ. Однако генетическая организация фагов Т7 и ТЗ исследована достаточно полно, что дало возможность получить их ферменты путем экспрессии клонированных генов, и сейчас они легко доступны. Принцип использования фаговых РНК-полимераз идентичен для всех трех ферментов (рис. 1.1). Обычно полимеразы применяются для транскрипции линейных матриц, но существует и другой подход, основанный на таком природном свойстве этих ферментов, как преждевременная тер-минацня цепи в присутствии низкой концентрации нуклеозид-трифосфатов. Достоинство этого подхода состоит в том, что он не требует линейной матрицы, однако получаемые при этом молекулы-зонды имеют разную длину, что делает их непригодными для работы при использовании приводимых здесь методик. [c.13]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

Специальные компьютерные прогршлмы позволяют повысить эффективность проведения генно-инженерных разработок путем анализа карт рестрикции ДНК и анализа кодируемых белковых продуктов, оптимизации синтеза фрагментов ДНК различными методами, выбора оптимальных зондов для выделения индивидуальных генов и т.д. Неожиданно полезной оказалась методика сравнения вновь расшифрованных последовательностей со всеми последовательностями банка. При этом были отк- [c.5]

В данном разделе мы приводим методики синтеза двух типов зондов равномерно меченных и меченных по концам одно-цепочечных ДНК-зондов. РНК-зонды для ДГГЭ синтезируйте, как описано в разд. 5 2 для метода РНКазного расщепления. [c.167]

Методы, используемые нами для синтеза равномерно меченных и меченных по концам одноцепочечных ДНК-зондов, очень похожи. Принцип их проиллюстрирован на рис. 10. Фрагмент ДНК, который предстоит исследовать, клонируется в репликативной форме бактериофага или в плазмидном векторе, продуцирующем одноцепочечные кольцевые молекулы только одной ориентации. Две наиболее распространенные системы такого типа — бактериофаг М13 и плазмиды, несущие точки начала репликации фага М13. Олигонуклеотидный праймер реассоциируют с одноцепочечной кольцевой молекулой так, чтобы он инициировал синтез ДНК на матрице тестируемой вставки в направлении от 5 - к З -концу. Для равномерно меченных зондов один из используемых при синтезе dNTP метится изотопами Р или в альфа-положении. Для зондов с концевой меткой олигонуклеотид метят по 5 -концу [y- PjATP, а для синтеза ДНК используют холодные dNTP. По окончании синтеза ДНК обрабатывается рестриктазой, расщепляющей кольцевую молекулу у конца вставки, противоположном сайту реассоциации с олигонуклеотидным праймером. В результате такой реакции получается линейный фрагмент ДНК, состоящий частично из двухцепочечного и частично из одноцепочечного участков. Денатурируя ДНК и проводя препаративный электрофорез в поли- [c.167]

Создание зонда для гсиа р-глобина связано с получением матричной РНК р-глобина из созревающих эритроцитов, где активно синтезируется гемоглобин. Затем с помощью фермента обратной транскриптазы, который обеспечивает считывание нуклеотидной последовательности м-РНК в комплементарную последовательность ДНК, получают так называемую к-ДНК с высокой радиоактивной меткой. В настоящее время созданы библиотеки к-ДНК из разных источников. Имеются геномные библиотеки человека, полученные генно-инженерными методами, а также хромосомно-специ-фические библиотеки, полученные из отдельных специфических хромосом или их участков. Создание таких библиотек требует выделения отдельных хромосо.м. В настоящее время это стало возможным благодаря сортировке хромосом цитофлуорометрическим методом. Для синтеза к-ДНК используются также автоматизированные устройства, в том случае, если производится синтез к-ДНК гена определенного белка, аминокислотная последовательность которого известна. [c.69]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология