Дезоксирибонуклеиновые кислоты денатурация

Интересное явление, которое отличает механохимическую деструкцию от других видов расщепления, — это так называемая денатурация нуклеиновых кислот. Известно, что при обычных методах расщепления дезоксирибонуклеиновая кислота разрывается на два одинаковых фрагмента вследствие разрыва водородных связей. Изменение pH или повышение температуры вызывает разрыв многочисленных водородных связей, вследствие чего макромолекулярные цепи ДНК теряют гибкость и перестраиваются в более компактную структуру, сохраняя постоянный первоначальный молекулярный вес. [c.243]

В области биохимии Гроссман и др. [78] нашли, что структура термически денатурированной и облученной ультрафиолетовым светом дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) согласуется с гипотезой, Б соответствии с которой денатурированная ДНК благодаря внутримолекулярным водородным связям с участием аминогруппы пуриновых и пиримидиновых оснований существует в виде хаотически свернутой спирали. Для определения структуры ДНК были изучены реакции денатурации, реактивации и ультрафиолетовое облучение. Было найдено, что быстрое охлаждение после термической денатурации способствует образованию межмолекулярных водородных связей. При повторном нагревании до 45° эти связи могут опять разрушиться. Образование межмолекулярных водородных связей при быстром охлаждении может быть ингибировано формальдегидом, который реагирует с аминогруппами оснований. [c.222]

При охлаждении оптическое поглощение понижается до более низкого значения, причем окончательная величина ма с зависит от скорости охлаждения и ионной силы. При этом полной обратимости обычно не наблюдается, а величина оптического поглощения у ДНК, полностью денатурированной нагреванием, составляет 70—80% (а не 60%) от вычисленной величины, т. е. емакс приблизительно равна 7500—8500 [264, 266]. Вследствие того, что это увеличение оптической плотности происходит при тепловой денатурации, кривые для критических температур денатурации могут быть также получены путем нагревания растворов ДНК в течение 1 час с последующим охлаждением до комнатной температуры и определением оптического поглощения, хотя этот метод и менее изящен [264[. Тем не менее в ранних работах, в которых использовался этот метод, было показано, что дезоксирибонуклеиновые кислоты из различных источников (зобная железа теленка, лягушка и оболочка морской звезды) различаются по своей чувствительности к нагреванию и что увеличение концентрации соли (от 10"- М до 1 М хлористого натрия) оказывает защитное влияние против денатурации при 100°. С полной очевидностью было показано-также, что при температурах вплоть до температуры денатурации оптическая плотность ДНК остается постоянной [264[. [c.585]

Денатурированные кислотой, щелочью или нагреванием дезоксирибонуклеиновые кислоты при спектрофотометрическом титровании ведут себя совершенно иным образом. Оптическая плотность увеличивается значительно меньше, это увеличение происходит в более широкой области значений pH, и как кислотная, так и щелочная ионизация смещены в сторону значений pH, более близких к нейтральным, чем у нативной ДНК при той же ионной силе. Титрование в значительной мере обратимо, так же как и кривые обратного титрования от pH 2,5 или pH 12 после титрования (или денатурации) нативной ДНК при комнатной температуре. [c.594]

Основания нуклеиновых кислот, несмотря на их большие дипольные моменты, гидрофобны. Действительно, их растворимость в воде обычно мала (т. е. взаимодействие их молекул между собой в твердой фазе сильнее, чем с молекулами воды) и возрастает при добавлении к воде таких веществ, как спирты, которые повышают растворимость гидрофобных соединений в воде. Растворимость аденина в воде возрастает с увеличением углеводородного заместителя в добавляемых спиртах, амидах, мочевинах и карбаматах, причем солюбилизирующая способность коррелирует с ростом эффективности этих соединений в качестве денатурирующих агентов для ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) [8]. Таким образом, одним из факторов, способных вызывать денатурацию ДНК, является такое изменение в природе растворителя, при котором он начинает предпочтительно взаимодействовать с основаниями нуклеиновых кислот, становящимися при денатурации более доступными. Это подтверждается экспериментально повышением растворимости и понижением коэффициента активности оснований нуклеиновых кислот в таких растворителях. [c.305]

Метод светорассеяния использовали также для изучения конформационного превращения макромолекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) при переходе ее из нативного в денатурированное состояние (см. обзор [516] ). Резкое изменение гидродинамических и оптических свойств растворов ДНК в узком интервале температуры (пли под действием другого денатурирующего фактора) принято трактовать как проявление плавления двунитевой спиральной структуры с последующим разделением на две однонитевые молекулы [516, 517]. Механизм денатурации ДНК, связанный с постепенным [c.256]

Дегидроциклизация 458, 503 Дезоксиадениловая кислота 661 Дезоксирибоза 613 Дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) 6(i2 Дезоксирибофураноза 613 Дезокснцитиди.юаая кислота 661 Дейтерий 62 Декан 450 Декстрины 624 Денатурация болка 652 Денсиметр, см. ареометр Детергенты 604 Детонационная устойчивость бензина 521 Децил 450 [c.703]

Описаны [518—520] искусственные комплексы дезоксинуклеиновых кислот с протаминами 1515], гистонами [516], полилизином, поливиниламином [517] и разнообразными белками. Образование комплекса с альбумином сыворотки крови быка, вызванное нагреванием, происходит в результате термической денатурации обеих компонентов, причем связывание осуществляется главным образом водородными связями [521]. Одна молекула ДНК может связать до 1800 альбуминовых молекул [521, 522], и защитное действие дезоксирибонуклеиновой кислоты из зобной железы на тепловую коагуляцию растворов альбумина [520] может быть приписано этому связыванию, которое предотвращает самоагрегацию. Подобным образом можно объяснить тормозящее действие ДНК на расщепление белков трипсином, т. е. действие направлено на субстрат, а не фермент [523]. Однако изучение подавления ДНК активности химотрипсина с применением синтетических субстратов позволяет предположить, что между ферментом и нуклеиновой кислотой также образуются стехиометрические комплексы. Максимальное торможение происходит при отношении белка к ДНК, равном 20 1, соответствующем приблизительно четырем нуклеотидным звеньям на молекулу химотрипсина [524]. Для трипсина это отношение равно 7 1. [c.449]

Помимо обычных трудностей, присущих применяемым методам, истинные значения определяемых молекулярных весов и их связь с длинами цепей ДНК in vivo не могут быть легко определены вследствие легкого разрыва цепей крайне высокого молекулярного веса. Так, по существу монодисперсная ДНК была получена пропусканием раствора полимера через атомизатор. При этом денатурации не происходило, но молекулярный вес ДНК уменьшался, а распределение констант седиментации сужалось [166, 167]. Другие исследования влияния гидродинамического сдвига на ДНК показали, что в условиях перемешивания, которые обычно используются при выделении дезоксирибонуклеиновых кислот, легко происходит фрагментация ДНК путем разрыва двойной цепи, причем ее спиральная структура остается незатронутой [168—170[. Силы разрыва, вызывающие разрезание двойной спирали, были определены путем воздействия контролируемых сил гидродинамического сдвига на ДНК (меченную Р ) из бактериофага Т2. Было найдено, что напряжение, созданное градиентом потока при критическом сдвиге, составляет приблизительно 11-10" дин. Расчет показывает, что это напряжение сравнимо с прочностью связей [c.558]

Несмотря на то что область температурного перехода для ДНК относительно узкая, она все же шире, чем можно было бы ожидать для длинной идеально уложенной спиральной структуры. Внутри этой области с помощью метода электронной микроскопии удалось обнаружить только полностью денатурированные или совершенно нативные структуры [239]. И вновь внутри этой области понижение вязкости быстро достигает предельного значения, а дальнейшее понижение вязкости происходит только при повышении температуры, что указывает на существование известного распределения специфических температур денатурации. Вполне обоснованное объяснение этого заключается в том, что вклад двух типов пар оснований в стабильность спирали различен. В таком случае тепловая денатурация должна была бы зависеть от относительного состава либо всей двуспиральной структуры, либо ее отдельных больщих участков. Показано, что температуры плавления (т. е. точки перегиба на кривых зависимости оптической плотности от температуры), определенные в стандартных условиях (0,15 М хлористого натрия в 0,015 М цитрата натрия) для большого числа дезоксирибонуклеиновых кислот, различающихся по составу оснований, прямо пропорциональны содержанию гуанина и цитозина в нуклеиновой кислоте (рис. 8-20) [240]. Линейная зависимость температур плавления от содержания гуаиин-цитозиновых иар исключительно точна, и поэтому измерение этих температур может быть использовано для определения нуклеотидного состава данной ДНК [241, [c.574]

Что касается низкой гетерогенности бактериальных ДНК по составу (но не обязательно по последовательности), то она очевидна также из данных по определению плотности ДНК методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности [245, 246[. При изучении большого числа дезоксирибонуклеиновых кислот вновь была найдена линейная зависимость между плотностью ДНК и содержанием гуанина и цитозина. Экстраполирование этих результатов показало, что двойная спираль из аденин-тиминового полидезокси-нуклеотида должна иметь плотность 1,662, а плотность соответствующего гуанин-цитозинового полимера должна быть 1,764. Если известна плотность нативной ДНК и ее величина укладывается между этими крайними значениями, то это позволяет точно определять состав ДНК. Соответствующие денатурированные ДНК имеют плотность на 0,015 выше. Если гетерогенность двух препаратов ДНК из животных тканей удалось выявить по увеличению ширины полос, то бактериальные нуклеиновые кислоты характеризуются узким распределением по составу (половина ширины полосы соответствует 3—5 мол. % гуанина + цитозина по сравнению с 11 % для ДНК из зобной железы теленка), а распределение по составу ДНК бактериофага настолько узко, что его не удалось измерить. Избирательная тепловая денатурация ДНК из зобной железы теленка (с низким содержанием гуанин-цитозиновых пар) дает фракцию нативного препарата с более высокой плотностью, чем плотность исходного препарата, из которого она была выделена [245[. [c.577]

Характер зависимости ультрафиолетового поглощения от температуры для многоцепочечного спирального комплекса, образованного ферментативно синтезированными полирибонуклеотидами, находится в полном соответствии с двуспиральной структурой ДНК [238]. Был изучен ряд всевозможных комбинаций, и все они обладали относительно узкими областями структурных переходов, характерными для кооперативного процесса тепловой денатурации. Двухцепочечный комплекс из полиадениловой и полиуридиловой кислот в тех условиях (0,15 М раствор хлористого натрия), которые использовали для тепловой денатурации дезоксирибонуклеиновых кислот, имел т. пл. 61 . И в этом случае ионная сила очень сильно влияла на температуру тепловой денатурации в 1 М растворе хлористого натрия температура плавления для поли-аденилил-полиуридилового комплекса повышалась приблизительно до 82 [c.578]

Оптическая активность нативных дезоксирибонуклеиновых кислот заметно выше оптической активности составляющих их мононуклеотидов [259]. Удельное вращение мономеров (появляющееся благодаря наличию остатка сахара) лежит в области от +50" до —50° со средним значением около О" для эквимолярных количеств основных нуклеотидов. Для дезоксирибонуклеиновых кислот [а]о лежит между гЮО и - -150°, а типичная величина [Л4р[п (молярное вращение, рассчитанное по числу фосфатных остатков) равна приблизительно +42000°. Величины удельного вращения для ди- и олигонуклеотидов позволяют предположить, что изменения, которых можно ожидать в результате этерификации мононуклео-тидфосфата, весьма. малы [260, 261]. Например, соответствующая величина [Мр1в для тимидилил-5 3 -тимидин-5 -фосфата составляет в нейтральном растворе +2800°. Однако для спиральных структур значительная часть общей оптической активности может определяться особыми и нескомпенсированными взаимодействиями, которые возможны благодаря соответствующим конформациям этих структур. Таким образом, разрушение упорядоченной спиральной структуры должно приводить к снижению оптической активности препарата [238]. Было найдено, что дело обстоит именно так. Далее, изменение оптического вращения ДНК в зависимости от температуры можно непосредственно сравнивать с ранее описанной зависимостью ультрафиолетового поглощения от температуры. Для ДНК из зобной железы теленка [а]о уменьшается от +126 при комнатной температуре до +28° при 92 причем температура тепловой денатурации, определенная в этом случае по точке перегиба кривой перехода, очень близка к значению, полученному из соответствующих опытов по изучению изменения ультрафиолетового поглощения. [c.582]

Ультрафиолетовое поглощение нуклеииовых кислот зависит от ряда факторов, среди которых ие последнее место занимает характер предварительной обработки препарата. Современные методы выделения рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот позволяют избежать большей части условий, которые вызгл-вают денатурацию, например, низких или высоких значений pH, низкой ионной силы или высоких температур, ведущих к необратимым изменениям в спектрах поглощения [263—267]. Для так называемой нативной ДНК значение экстинкции (бмакс), отнесенное к числу фосфатных остатков (т. е. средняя величина экстинкции, приходящейся на один нуклеотид) в 10 Л4 (или выше) растворе хлористого натрия и нейтральном значении pH, лежит между 6000 и 6500. В бессолевом растворе даже при pH 7 происходит глубокая денатурация и между pH 6,5 и 7,5 изменения в ультрафиолетовом поглощении достаточно велики [265], по-видимому, за счет смещения значений рК в результате протонирования адениновых и цитозиновых остатков в этой области значений pH. Экстинкция соответствующей смеси мононуклеотидов должна быть равна приблизительно 10500, и, следовательно, для ДНК характерны значительные гипохромные эффекты. Существенно, что изменения ультрафиолетового поглощения полинуклеотидов в результате изменений pH, температуры и ионной силы отражают большие или малые конформационные изменения (несомненно, наряду с другими физическими свойствами), которые увеличивают или уменьшают гипо-хромный эффект. [c.584]

Как известно, молекулы белка построены из большого числа аминокислот. Поэтому при изучении структуры белка методом ИК-спектроскопии нельзя просто воспользоваться теми данными, которые были получены при исследовании полипептидов. В работе [137] изучали зависимость конформации от состава аминокислот для тех синтетических полипептидов, которые моделируют составные части белков. Было показано [1895, 1896], что при денатурировании дезоксирибонуклеиновых кислот в их спектрах исчезают полосы при 1645 и 1680 см и вместо них появляются полосы при 1660 и 1690 см- . Первые две полосы соответствуют регулярным водородным связям между звеньями пурина и пиримидина, которые придают прочность двойной спирали. Исследования проводили с использованием растворов в тяжелой воде. В работе [136] обсуждается необходимость спектроскопического изучения биополимеров, находящихся в Н2О и ВгО, поскольку эти жидкости являются их естественными растворителями. Там же рассмотрены соответствующие методики исследования. Изучены конформацион-ные изменения, происходящие при денатурации белков плазмы крови [1314, 1315J. Исследованы колебания пролинового кольца в пoли-L-пpoлинe [257, 259], который является составной частью многих белков. Был сделан вывод, что полосу при 1440 см можно использовать только для определения содержания остатков иминокислот в молекуле полипептида. [c.344]

В этом отношении можно ограничиться пока лишь некоторыми предположениями. Возможно, что нуклеиновые кислоты и белки, образуясь в клетке, вначале находятся в особом, так называемом нативном состоянии, в котором они недоступны действию ферментов. Давно известно, что белки в нативном состоянии очень устойчивы к действию про-теолитических ферментов. В то же время денатурация белков резко изменяет их отношение к ферментам, делает их легкопереваримыми. То же самое было недавно обнаружено в работе С. Н. Александрова и М. А. Преснова (1954) для дезоксирибонуклеиновой кислоты. Можно предположить, что и в условиях живой клетки часть молекул белков и нуклеиновых кислот подвергается денатурации и становится благодаря этому материалом для про цессов распада, [c.69]

Помимо нолиэлектролитов с гибкими цепными полиионами, которые могут иметь широкий набор конформаций, рассмотрению подлежат заряженные макромолекулы, принимающие специфические конформации, обсужденные в гл. III. Белки имеют разнообразное множество ионогенных групп в боковых цепях аминокислотных остатков, а именно карбоксильные группы глутаминовой и аспарагиновой кислот, имидазольпые группы гистидина, аминогруппы лизина, фенольные группы тирозина, тиольные группы цистеипа и гуанидиновые остатки аргинина. Поэтому в зависимости от состояния ионизации они могут обладать суммарным положительным или отрицательным зарядом. Третичная структура глобулярных белков обычно достаточно устойчива для того, чтобы допустить значительное увеличение суммарного заряда до начала денатурации. Другим полиэлектролитом со специфической конформацией является нативная форма дезоксирибонуклеиновой кислоты. Мы видели, что она существует в растворе в виде двойной спирали, которая ведет себя почти так же, как и жесткая стержневидная частица. В нейтральном растворе вследствие ионизации функциональной группы фосфорной кислоты частица имеет один отрицательный заряд, приходящийся на нуклеотидный остаток. В кислой или щелочной среде в установлении ионизационного равновесия принимают участие пуриновые и пирамидиновые остатки, что, как будет показано ниже, влияет на устойчивость нативной формы ДНК. [c.268]