Комплексы буферов с белками

Вообще говоря, перенос белков, обработанных ДСН, можно проводить в том же буфере, в котором проводят собственно электрофоретическое фракционирование. Это подтверждают наши результаты, приведенные в предыдущем разделе. В качестве буфера для переноса мы использовали наш рабочий буфер для электрофореза (0,424 М трис-НС1, pH 9,18) с добавлением 20% метанола. Полученные при этом результаты по качеству не уступают результатам переноса в трис-глициновом буфере. Единственным неудобством использования электрофорезного буфера для переноса является его более высокая проводимость. Ток при переносе в этом буфере значительно выше, вследствие чего требуется гораздо более интенсивное охлаждение. Снизить значение тока (до 1,2 А при 100 В) без потерь при переносе удается, вдвое уменьшив молярность буфера, т. е. работая с 0,212 М трис-НС1, pH 9,18, содержащим 20-% метанола. Включение метанола в буфер для переноса предотвращает разбухание геля. Кроме того, метанол может помогать извлечению ДСН из комплекса с белками и тем самым способствовать их ренатурации. В то же время в присутствии метанола некоторые белки преципитируют в геле, что осложняет их количественное извлечение из геля, особенно в случае крупных белков. [c.357]

При электрофорезе в первом направлении для улучшения растворимости белков нередко вводят неионный детергент, например 1%-ный раствор Тритона Х-100. Можно вести электрофорез в агарозе и в присутствии ДДС-Na (также только в интересах растворимости, ведь разделение белков по размерам в геле агарозы производить не целесообразно). ДДС-Na при перекрестном иммуноэлектрофорезе под действием поля может переходить в слой агарозы, смешанной с антисывороткой. Этого следует избегать, так как уже упоминалось, что ДДС-Na мешает образованию иммунного комплекса антиген — антитело. В этом случае гель первого направления предварительно вымачивают в буфере, содержащем избыток Тритона Х-100, а иногда его вводят и в состав геля агарозы с антисывороткой. Тритон Х-100 вытесняет ДДС-Na из комплекса с белком й образует с ним смешанные мицеллы, не препятствующие иммунопреципитации. [c.149]

В этом разделе описываются этапы аффинной элюции. Образец уравновешивают в соответствующем буфере и наносят на ионообменную колонку, заполненную, например, КМ-целлюлозой. Нужный фермент полностью адсорбируется колонку с нанесенным образцом промывают небольшим количеством исходного буфера. Если эффект аффинной элюции значителен, то pH исходного буфера может быть тем же, что и pH буфера для элюции. Однако чаще pH в колонке повышают до соответствующего значения, при ротором нужный фермент только начинает двигаться, например когда а = 0,95—0,90 (рис. 4,23 и 4.24). Затем на колонку наносят раствор лиганда, концентрация которого должна превышать по величине константу диссоциации-комплекса фермент — лиганд, и если фермента много, то общее количество лиганда, выраженное в молях, должно быть больше количества (в молях) центров связывания. С другой стороны,, концентрация лиганда не должна существенно изменять ионную-силу буфера. Максимальное количество используемого лиганда часто определяется соображениями стоимости, но если константа диссоциации его комплекса с белком достаточно высока и требуемые концентрации лиганда приводят к повышению ион-ной силы буфера, то может потребоваться введение стадии вымывания подставным лигандом . В этом случае на этапе, предшествующем элюции, используют соединение, имеющее.л от же заряд, что -И лиганд, но не связывающееся с ферментом. Все-белки, которые выходят из колонки при повышении ионной си- [c.139]

Получение комплекса 1П. Все операции проводят на холоде 0... —4° С). Сукцинат цитохром с-оксидоредуктазу, полученную как описано на с. 426, суспендируют в фосфатном буфере (калиевые соли) с pH 7,4 до конечной концентрации белка 5 мг/мл. Суспензию помещают в небольшую трехгорлую колбу, снабженную насадкой для деаэрирования, рН-электродом (комбинированный электрод, пропущенный через герметически закрытый шлиф) и делительной воронкой. Колбу охлаждают в сосуде со льдом, помещенном на магнитную мешалку. [c.429]

Число связывающих центров и их сродство можно определить прямыми методами, такими, как равновесный диализ [2] или хроматографическая гель-фильтрация [3]. Во всех исследованиях такого типа число связанных ионов металла определяется непосредственно анализом концентрации комплекса металла с белком как функции равновесной концентрации свободного иона металла. При изучении связывания с металлом особенно важны значения pH как для получения достоверных данных, так и для их интерпретации (разд. 3), и в зависимости от цели исследования значения pH могут поддерж иваться постоянными или изменяться. По возможности следует избегать большинства буферов из-за конкуренции между белком и буфером за металл, а также из-за возможности образования тройного комплекса, включающего металл, белок и буфер [4]. Со спосо бами обработки первичных данных с целью определения числа различных центров связывания и оценки их сродства можно ознакомиться в специальных руководствах [c.275]

IV), серебро, ртуть (I) и ртуть (И), кадмий, кобальт, свинец, кремний литий, железо (lil), цинк и лантан. Титан можно связать в комплекс добавлением перекиси водорода при рН>12 раствор этого комплекса бесцветен. Марганец окисляется кислородом воздуха этого можно избежать, добавляя солянокислый гидроксиламин, который, кроме того, стабилизируют окраску от магния. В большей или меньшей степени мешают образованию окраски сурьма (П1), мышьяк (П1) и мышьяк (V). Ионы аммония в больших количествах (больше 500 мг л) мешают, так как они создают в растворе буфер, препятствующий получению требуемого рн. Мешают также белки. Оксалат-ноны не оказывают заметного влияния. [c.699]

Нанесите на колонку экстракт, содержащий гибридный белок, при 4 С для уменьшения протеолиза. Промойте колонку буфером PBS (его состав указан в сноске к табл. 5.2) в объеме, равном объему колонки, при 4°С. Все последующие стадии проводите при комнатной температуре. Промывайте колонку буфером BBS-твин (состав указан в сноске к табл. 5.2) до тех пор, пока в элюирующем растворе не останется белка. Уравновесьте колонку буфером PBS. Проведите элюцию раствором, содержащим 4 М гуанидин-НС1, 10 мМ трис-НС1 (pH 8,0), соберите пик и диализуйте его против нескольких смен буфера PBS. Основная часть белка выпадает в осадок и может быть собрана с помощью центрифугирования. Для проведения иммунизации ресуспендируйте преципитат в небольшом объеме PBS и далее следуйте методике, приведенной в разд. 5.4. Сразу же после использования снова уравновесьте колонку PBS. При работе возможно использование и других элюирующих растворов, но более слабые элюенты не смогут разрушить прочные связи комплексов антиген—антитело, и в результате емкость колонки уменьшится, так как большое число участков аффинного связывания окажется занятым. [c.158]

Другой способ осуществления реакции между белками и ДСН после первого этапа электрофореза предложили Метц и Богорад [865, 866]. Они применили процедуру (см. подробное описание в разделе, посвященном электрофорезу рибосомных белков), в которой буфер, используемый при электрофорезе в первом направлении, играет роль концентрирующего буфера в неоднородной буферной системе, применяемой во втором направлении. Сразу же после первого этапа электрофореза гель заплавляют в пластину геля и начинают электрофорез в направлении, перпендикулярном первому, В верхний электродный буфер добавляют ДСН, который под действием электрического поля входит в гель и образует комплексы с белками, разделенными при электрофорезе в первом направлении. [c.231]

В электродных резервуарах обычно используют тот же буфер. что и в геле. В буферы вносят и ДДС-Na до концентрацир/о, Необходимость присутствия ДДС-Na в рабочем буфере геля одно время оспаривалась [Stoklosa Latz, 1974]. Авторы цитируемой работы утверждали, что ДДС-Na образует с белком прочный комплекс, не разрушающийся в процессе электрофореза. В более поздней работе, напротив, подчеркивается необходимость введения ДДС-Na в буфер геля или хотя бы в катодный буфер, откуда он будет поступать в гель. Показано, что ДДС-Na может выходить из комплекса с белком. В тех случаях, когда скорость миграции детергента в геле намного больше, чем бел- [c.61]

Х-100 с добавлением в него либо цетавлона до 0,5%, либо дез-оксихолата натрия (ДОХ) до 0,25%. Тритон Х-100 образует мицеллы, которые связываются с гидрофобными участками белка в количестве, пропорциональному размеру этих участков. Цетавлон или ДОХ объединяются с Тритоном Х-100 в смешанные мицеллы, привнося тем самым в комплекс с белком соответственно положительный или отрицательный заряд, существенно превышающий собственный заряд белка. При электрофорезе белки мигрируют со скоростью, обусловленной знаком и величиной привнесенного заряда. Такой прием можно назвать электрофорезом со сдвигом заряда . Необычное введение в буфер геля 0,1 М Na l по-видимому, способствует как растворимости белков, так и образованию мицелл. Напряженность поля при этом приходится снижать до 4,5 В/см. [c.87]

Буфер для переноса должен обеспечить эффективное вымывание белков из матрицы геля и связывание их с мембраной. Поскольку оптимальные условия для переноса различных белков отличаются, имеются несколько систем буферов, пригодных для данной цели. Наиболее часто применяется буферная система, впервые описанная Towbin с соавт. (25 тМ Трис, 193 тМ глицин, 20% метанол, 0.05 - 0.1%о ДДС-Na, pH 8.3). Для переноса большинства белков в этом буфере достаточно проводить процесс при напряжении 7.5 В/см и токе от 200 до 800 мА в течении 3 часов. Добавление в буфер для переноса метанола позволяет предотвратить разбухание геля, а также способствует извлечению SDS из комплекса с белками и обеспечивает их ренатурацию. В то же время, поскольку белки плохо переносятся вблизи их изоэлектрической точки, для переноса используются и другие буферные растворы по Davis с соавт. (20 тМ трис -ацетат, 2 тМ [c.64]

Ко второму варианту отнесем те случ аи, когда очищаемый белок сильно отличается по своему заряду (т. е. по кислотности или основности) от всех остальных белков исходной смеси. В этом случае нередко удается так подобрать условия хроматографии, чтобы только нужный белок сорбировался на обменнике, а все примеси сравнительно легко вымывались исходным буфером. По существу это — процесс экстракции. Сорбированный белок затем выбивают пз колонки в минимальном объеме, как при концентрировании. Может быть и обратная ситуация очищаемый белок свободно проходит через колонку, на которой задерживаются примесные белки. Иногда такие резкие различия в хроматографическом поведении приводят еще и к освобон<дению нун<ных белков из их природных комплексов. [c.305]

Изучают влияние НАД, пирувата и АДФ на флуоресценцию аурамина О, связанного с ЛДГ. Для этого вначале снимают спектр флуоресценции раствора, содержащего 0,04 мМ апо-ЛДГ и 0,15 мМ аурамина О в 0,1 М К-фосфатном буфере (pH 7,0), содержащем 5 мМ ЭДТА, а затем добавляют к пробе лиганды в следующих конечных концентрациях 6 мМ НАД, 6 мМ пируват, 9 мМ АДФ. Регистрируют увеличение флуоресценции комплекса аурамина О с ЛДГ под действием использованных соединений. Ставят контроль, в котором учитывают влияние добавок на флуоресценцию зонда в отсутствие белка. Рост интенсивности эмиссии связанного с белком аурамина О может быть обусловлен либо увеличением его количества, либо изменением флуоресцентных характеристик зонда. В любом случае увеличение флуоресценции зонда при связывании лигандов в активном центре свидетельствует о конформационной перестройке участков моле- [c.343]

И. X. применяется для разделения катионов металлов, напр, смесей лантаноидов и актиноидов, 2г и НГ, Мо и W, КЬ и Та последние разделяют на анионитах в виде анионных хлоридных комплексов в р-рах соляной и плавиковой к-т. Щелочные металлы разделяют на катионитах в водных и водно-орг. средах, щел.-зем. и редкоземельные металлы-на катионитах в присут. комплексонов. Большое значение имеет автоматич. анализ смесей прир. аминокислот на тонкодисперсном сульфокатионите.в цитратном буфере при повыш. т-ре. Аминокислоты детектируют фотометрически после их р-ции с нингидрином или флюориметрически после дериватизации фталевым альдегидом. Высокоэффективная И. X. (колонки, упакованные сорбентом с размером зерен 5-10 мкм, давление для прокачивания элюента до 10 Па) смесей нуклеотидов, нуклеозидов, пуриновых и пиримидиновых оснований и их метаболитов в биол. жидкостях (плазма крови, моча, лимфа и др.) используется для диагностики заболеваний. Белки и нуклеиновые к-ты разделяют с помощью И. X. на гидрофильных высокопроницаемых ионитах на основе целлюлозы, декстранов, синтетич. полимеров, широкопористых силикагелей гидрофильность матрицы ионита уменьшает неспецифич. взаимод. биополимера с сорбентом. В препаративных масштабах И. х. используют для вьщеления индивидуальных РЗЭ, алкалоидов, антибиотиков, ферментов, для переработки продуктов ядерных превращений. [c.264]

Условиями для самосборки служат умеренная ионная сила (ниже 0,5), достаточная концентрация Mg2+ (от 10 до 30 мМ) и повышенная температура. М. Номура с сотр., осуществившие полную реконструкцию биологически активных 30S субчастиц Е. соН из индивидуальных РНК и белка, использовали 0,3—0,3 J М КС1 с 20 мМ Mg b, инкубируя смесь при 40°С в течение 20 мин. Они нашли, что оптимальной является ионная сила около 0,4. Очевидно, более высокие ионные силы подавляют взаимодействия белков с РНК, а при более низких ионныу силах возрастает вклад конкурирующих неспецифических взаимодействий основных белков с отрицательно заряженным полинуклеотидом. Относительно высокая концентрация Mg2+ необходима, по-видимому, прежде всего для поддержания третичной и вторичной структуры РНК, служащей каркасом для размещения белков. Вообще, следует отметить, что так называемый буфер для реконструкции Номура служит в то же время средой, в которой рибосомная РНК достаточно компактна в изолированном состоянии и поддерживает свою специфическую форму. Повышенная температура оказывается также очень важной для реконструкции и требуется, как считают, для облегчения структурной перестройки промежуточного рибонуклеопротеидного комплекса от менее компактной к более компактной конформации. [c.130]

Рис. 3.9. Адсорбция ферментов препарата целлюлазного комплекса Т.кочтди (концентрация по белку 1 г/л) на порошковой целлюлозе Solka Floe (4 г целлюлозы в рабочей камере экспериментальной установки) при 25° С, pH 4,5, в 0,1 мМ ацетатном буфере и скорости потока 0,7 мл/мин. Сплошная кривая отражает уровень белка на выходе из рабочей зоны, пунктирная кривая — концентрацию ВС — концентрация белка на входе в рабочую камеру установки в начале эксперимента, о — концентрация ВС. Напряженность поля составляла

Методы модификации остатков аргинина в белках основаны на конденсации гуанидиновой группы с различными дикетонамн и диальдегидами. Наибольшее применение среди них находит реакция с 1,2-циклогександиоиом, предложенная в 1975 г. Л. Патти и Э. Смитом. Модификация протекает в мягких условиях (pH 8,0 — 9,0 25 — 40 ""С) в натрий-боратном буфере с образованием стабильного комплекса производного аргинина с боратом. [c.44]

Низкие концентрации ПАВ увеличивали степень спиральности топо- и парамионизина, повышали температуру тепловой денатурации на 10—15°, способствовали повышению устойчивости белков к перевариванию трипсином [152]. Подобные результаты получены в работе Витвицкого [153]. Повышение термостабиль-ности комплексов миоглобина с ПАВ обнаружено в работе [154], причем эффект сильнее выражен для ja, С14 и С , чем для g и g. Увеличение конформационной стабильности трипсина при взаимодействии с фосфолипидами показано в работе [155]. Мосолов и Афанасьев [156], инкубируя трипсин при 37 С в фосфатном буфере (pH 7,8), содержащем жирную кислоту, наблюдали при одних значениях концентрации денатурирующее действие жирных кислот, а при других — защитное действие. [c.28]

Ряд алкилагароз со структурой СНз(СН2)пМН—сефароза (где п принимает значения от О до 7), и-аминоалкилагароз со структурой ЫН2(СН2)п ЫН—сефароза (где п — от 2 до 8) характеризуется близким содержанием алкильных боковых цепей на гранулу геля [15, 49]. В одинаковых условиях (pH, ионная сила, состав буферного раствора и температура) способность СНз(СН2)пЫН—сефарозы удерживать фосфорилазу Ь зависит от длины углеводородных цепей. При хроматографии на производных сефарозы (я = 0 или 1) фосфорилаза Ь выходила из колонки с фронтом растворителя при п = 2 происходила задержка фермента, а при п = 3 фермент адсорбировался. Элюирование фосфорилазы Ь с модифицированной сефарозы (п = 3) возможно с помощью деформирующих буферных растворов, которые, как было показано, приводят к обратимым структурным изменениям фермента. На производном сефарозы с л = 5 связывание фосфорилазы было настолько сильным, что фермент не элюировался с колонки, даже когда pH деформирующего буферного раствора понижался до 5,8, хотя деформирующая способность такого буфера намного выше. Освободить фосфорилазу Ь из комплекса с этим производным можно только в неактивной форме после промывки колонки 0,2 М уксусной кислотой. Сама агароза содержит отрицательные заряды, а связывание алкил- или ариламинов на активированной бромцианом агарозе вводит в гель положительные заряды (разд. 8.2.4). В связи с этим йост и др. [28] обращали внимание на то, что на сефарозе с алкиламинами, прикрепленными после предварительной активации носителя бромцианом, связывание белков происходит большей частью при pH выше изоэлектрической точки выделяемых белков. Поэтому допускалось, что в этих случаях электростатические взаимодействия с положительно заряженной Ы-замещенной изомочевиной более существенны для связывания, чем гидрофобные взаимодействия с гидрофобной боковой цепью. Тем не менее гранулы агарозы не связывают фосфорилазу Ь, пока к ним не будут прикреплены алкильные боковые цепи некоторой минимальной длины. Кроме того, отмеченные выше заряды в равной мере присутствуют во всех членах гомологического ряда, и, следовательно, они не могут быть причиной различий в степени [c.152]

Для иммобилизации ферментов применяют растворы полиэлектролитов, способные к фазовому разделению при определенных условиях. Запатентован способ иммобилизации большой группы ферментов (более 10) путем смешения растворов хитозана и фермента с последующим осаждением комплекса щелочью либо ионами SOl с полным сохранением ферментативной активности белка (пат. 4167447 США). Аналогичным способом с использованием хитозана была иммобилизована уреаза (пат. 80—74794, 1980 Япония). Из кислого раствора фермента и хитозана отливали пластинки, которые после высушивания выдерживали в боратном буфере. Полученная пластинка имела удельную активность 0,08 ед/см . С помощью водорастворимого карбоди-имида на хитозане иммобилизовали глюкозоизомеразу [102]. Таким образом, процесс иммобилизации не вызывает инактивации фермента, более того, такая обработка снижала степень инактивации фермента ионами металлов. [c.127]

Сыворотка крови при pH 8,6 в веронал-мединаловом буфере, при электрофорезе делилась на альбумины, а-глобулины, р-глобулины и у-глобулины. В этих условиях белки заряжены отрицательно и перемещаются к аноду. В тех же условиях электрофореза антибиотики-основания перемещаются к катоду, их положительный заряд обусловлен аминными или гуанидогруппами. При движении к катоду они пересекают все белковые фракции и вызывают деформацию только тех белков, с которыми образуют комплексы. [c.402]

Адсорбция на колонке со смесью фосфата кальция и целита и градиентное элюирование фосфатным буфером с pH 6,5 и концентрацией до 0,2 молъ1л позволяет отделить хондроитинсульфат от гиалуроновой кислоты или разделить образцы гиалуроновой кислоты на фракции с различным молекулярным весом [1]. Этот метод mohiho использовать также для выделения растворимого комплекса хоидроитинсульфата с белком из экстрактов хрящевых тканей [2] (см. стр. 343). [c.271]

Смотреть страницы где упоминается термин Комплексы буферов с белками: [c.314] [c.79] [c.79] [c.166] [c.235] [c.246] [c.375] [c.415] [c.419] [c.446] [c.75] [c.75] [c.149] [c.552] [c.453] [c.262] [c.63] [c.869] [c.47] [c.96] [c.132] [c.195] [c.47] [c.30] [c.32] [c.408]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология