Получение иммунной сыворотки

Принцип метода. Иммуноэлектрофорез представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белков с двойной диффузией и иммунопреципитацией в геле. Вслед за электрофоретическим разделением белков в агаровом геле навстречу полученным фракциям диффундирует специфическая иммунная сыворотка. Этот метод позволяет характеризовать белки не только по скорости миграции в электрическом поле, но и по антигенным свойствам. [c.137]

А. ПОЛУЧЕНИЕ ИММУННОЙ СЫВОРОТКИ [c.116]

Кролик чаще других лабораторных животных используется в роли донора иммунной сыворотки. Имея в виду круг проблем, рассматриваемых в этой книге, ограничимся случаем выработки антител против чисто белковых антигенов. Получение иммунной сыворотки против пептидов и низкомолекулярных химических соединений (гаптенов) требует предварительной конъюгации этих антигенов с белком, для чего обычно используют бычий сывороточный альбумин. Конъюгацию осуществляют с помощью глютарового альдегида, карбодиимидов, дифтординитробензола и других бифункциональных агентов. Для пептидов, например, подробное описание конъюгации и иммунизации можно найти в одной из недавних работ [Walter et al., 1980]. [c.105]

Антитела в большей части антигенов относятся к IgG-фракции иммунной сыворотки. С целью повышения чувствительности и специфичности анализа во многих случаях полезно использовать для сорбции на твердой фазе и для получения конъюгатов IgG-фракцию нативной сыворотки. Наиболее простой и доступный способ выделения IgG — метод ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе или ДЭАЭ-целлюлозе. [c.154]

Иммунизация кролика для получения иммунной сыворотки. Для получения иммунной сыворотки проводят цикл иммунизации кролика убитой вакциной — взвесью убитых бактерий, содержащей 1 млрд. микробных тел в 1 мл. Вакцину вводят в краевую вену уха кролика 3 раза с интервалами в 6 дней. Через 7 дней после последнего введения антигена у кролика берут кровь, из которой готовят сыворотку и титруют для выявления в ней антител. [c.102]

Учесть результаты идентификации энтеровирусов в реакции нейтрализации со специфическими иммунными сыворотками. Сделать заключение на основании полученных данных. [c.240]

В. Для получения кроличьей антисыворотки к белкам сыворотки человека рекомендуется описанный ниже метод иммунизации, позволяющий приготовить, по-видимому, наилучшую иммунную сыворотку для выявления многих белковых компонентов, в том числе иммуноглобулинов. В этом методе совмещены две схемы иммунизации по Мильгрому и по Проому. [c.117]

Принцип метода. После электрофоретического разделения исследуемого белка в агаровом геле компоненты специфической иммунной сыворотки диффундируют навстречу полученным фракциям через слой агарового геля, содержащий известные (контрольные) антигены, которые абсорбируют соответствующие антитела и. задерживают их дальнейшую миграцию к определяемым антигенам. В результате в образовании полос преципитации принимают участие только те антигены исследуемого образца, которые отличаются от контрольных. [c.150]

Приготовление геля агарозы, содержащего иммунную сыворотку, и вторая стадия анализа электрофорез фракций, полученных на первой стадии). Специфическую иммунную сыворотку в соответствующем разведении смешивают с 1%-ной агарозой и наслаивают на стеклянную пластинку размером 10 хЮ см слой толщинои 1,5 мм. [c.155]

Таким образом, и при окислении пирогаллола полученные путем иммунизации различными препаратами фенолазы иммунные сыворотки действуют специфическим образом. [c.568]

Подобного рода проблемы очень часто возникают, например, при разработке методов иммуноферментного анализа лекарственных препаратов, стероидных и белковых гормонов. В зависимости от способа получения антисыворотки антитела могут быть специфичны либо только к одному лекарственному препарату (гап-тену), либо к целой группе близких по структуре химических соединений. В этих случаях распространен способ оценки специфичности, основанный на сравнении связывания антител в данной концентрации (или в определенном разведении иммунной сыворотки) одного и того же количества гомологичного и гетерологичного гаптена. При этом концентрация образовавшегося иммунного комплекса для гомологичного гаптена принимается равной единице, а связывание всех гетерологичных гаптенов оценивается как доля от соответствующего связывания гомологичного гаптена. [c.37]

В серии пробирок увеличивающиеся количества антигена добавляют к одному и тому же количеству иммунной сыворотки. Пробы выравнивают по об1.ему добавлением буферного раствора. После инкубирования при температуре 4 °С, а затем выдерживания в течение. 30 мин при 37 С можно наблюлать обра кование преципитата. Растворы центрифугируют, осадки промывают и определяют их количество путем измерения содержания белка. Максимальное количество полученного преципитата соответствует зоне эквивалентности [27]. [c.100]

Другой пример практического использования лектинов продемонстрировали Левин и сотр. [22]. Используя анти-К-лектин Vi ia graminea, они показали, что лошадиные эритроциты содержат N-антиген — факт, который нельзя было выявить при помощи адсорбированной кроличьей сыворотки, так как в адсорбированной сыворотке остаются видоспецифические агглютинины. Доказательство наличия N-анти-гена в эритроцитах лошади побудило Левина и его сотрудников предпринять поиски истинного анти-М-агглютинина в сыворотке лошади. Обнаружение его означало бы, что лошадь может быть хорошим продуцентом иммунной сыворотки анти-М. Опыт подтвердил это предположение, и таким образом был открыт новый богатый источник получения иммунной сыворотки анти-М. [c.88]

Рис. 4.7. Результаты, полученные методом связывания комплемента, с одной стороны, и методом двойной диффузии, с другой стороны, для сравнения антиген ности р-амилаз, экстрагируемых из непроросшего и пророс него зерна ячменя. В двух упомянутых методах использована одна н та же моноспецифическая иммунная сыворотка р-амилазы ячменя. Оба экстракта подвергли диализу и разбавили >1.0 получения одинаковой их активности.

Получение иммунной сыворотки. Из уха или сердца кролика на 7-й день после окончания иммунизации берут кровь, помещают в термостат при 37°С на 10—15 мин. После свертывания крови сгусток отслаивают от стенок пробирки стеклянной палочкой и выдерживают при 4°С в течение часа для лучщей ретракции сгустка и более полного отделения сьшоротки. Затем сьшоротку осторожно отсасывают пипеткой. [c.109]

Реакция преципитации происходит вскоре после смешивания растворов антигена и иммунной сыворотки. Ее предварительный результат, как правило, можно учитывать через 30—60 мин инкубации полученной смеси при 37° С. Преципитация обычно завершается через 24 ч инкубации в холодильнике. При постановке реакции иммунодиффузии, когда соединение реагентов происходит лишь после их диффундирования в поддерживающей среде (например, в агаре), время образования преципитата, помимо прочих моментов, зависит от скорости диффузии. [c.17]

Хорошо известная трудность в получении иммунных сывороток состоит в изменчивости иммунного ответа не только у отдельно взятых особей одного и того же вида, но также у одной и той же особи в ходе иммунизации [89]. Так, пробы иммунных сывороток, взятые у нескольких животных или у одного и того же животного в процессе иммунизации, представляют собой гетерогенный набор молекул с разными антигенсвязывающими центрами и различной аффинностью к антигену. Это относится даже к антителам, специфическим к отдельному эпитопу. Практически, чтобы получить достаточный запас однородной иммунной сыворотки, приходится делать смеси сывороток, полученных разными отборами их у иммунизированных животных. [c.96]

Кроме каолина оказалось возможным адсорбировать антифермент на фосфорномолибденовокислом аммонии. В тех количествах, которые мы применяли (1 см 25%-нои суспензии), фосфорномолибденовокислый аммоний адсорбирует инвертазу в ничтожных количествах однако тот же адсорбент, обработанный иммунной сывороткой, энергично связывает фермент. В противоположность опытам с каслином, в опытах с фосфорномолибденовокислым аммонием производилась обработка адсорбента сывороткой, а затем адсорбата раствором инвертазы без прибавления буфера. Буферная смесь прибавлялась только перед тем, как ставить в термостат. Суспензия фосфорномолибденовокислого аммония должна быть свежеприготовленной. Результаты, полученные с фосфорномолибденовокислым аммонием, приведены в следующей таблице [c.574]

Независимо от схемы иммунизации одним и тем же антигеном следует одновременно иммунизировать группу животных, так как обычно наблюдаются весьма большие индивидуальные различия в иммунном ответе. Чем больше группа иммунизируемых животных, тем выше вероятность получения антисыворотки достаточно высокого титра в наиболее короткий срок. Это особенно важно при получении антисыворотки к смеси белков, например при иммунизации кроликов белками сыворотки крови для получения антисыворотки, используемой в] иммунселектрофорезе. Именно в этом случае можно ожидать образования антител к ряду компонентов смеси. Для получения антисыворотки к белковым антигенам вполне достаточно иммунизировать 1%-ными белковыми растворами. Белок обычно растворяют в 0,15 М растворе ЫаС1 этим же раствором разбавляют сыворотку крови для иммунизации. [c.116]

Линия гибридомных клеток не истинно нейрональная модельная система, однако она должна быть упомянута здесь, поскольку представляет собой полезный инструмент исследования в нейрохимии. Каждый В-лимфоцит обычно секретирует только один тип антител. Смесь большого числа моноспецифических антител образует нормальную гетерогенную антисыворотку. Для получения высокопродуктивных моноспецифических лимфоцитов, секретирующих антитела, Кёлер и Милштейн проводили слияние В-клеток иммунной мыши с опухолевыми клетками. В отличие от нормальных лимфоцитов, полученные гибридные клетки растут и размножаются практически бесконечно и продуцируют смесь антител против антигена, используемого для иммунизации. Даже если антиген является индивидуальным белком, продуцируемые антитела представляют собой смесь многих антител, каждое из которых направлено против одного специфичного антигенного участка исходной молекулы. Для получения моноспецифической сыворотки, т. е. раствора антител против одной антигенной области и происходящих из одного вида гибридомных клеток, эти клетки необходимо отобрать и клонировать . Теперь клон продуцирует моноклональные антитела , гомогенную популяцию антител против только одной детерминанты антигена. Эти моноклональные антитела можно пспользовать для разнообразных исследований, например для идентификации функциональных участков молекулы. Но что еще более важно, такой метод может использоваться для полу- [c.371]

После того как в ходе иммунизации активность сыворотки, которую измеряют, отбирая пробы, достигнет нужной величины, животным-продуцентам делают кровопускание для получения максимального количества сыворотки. Если иммунная сыворотка получена в нестерильных условиях, в нее рекомендуется добавить мертиолат в соотношении I 5000. При хранении в холодильнике (по возможности в замороженном состоянии) активность полученных антисывороток может сохраняться в течение нескольких лет. [c.119]

Приготовление иммунной сыворотки требуемого качества нередко встречает серьезные затруднения. Животные-продуценты существенно различаются по способности синтезировать антитела, причем наряду с межвидовыми имеются значительные индивидуальные различия в иммунореактивности животных-продуцентов в пределах одного вида. Поэтому рекомендуется одним антигеном одновременно иммунизировать несколько животных тем самым повышается вероятность получения антисыворотки хорошего качества, дающей необходимое число полос преципитации. [c.148]

Для успешного анализа белковых растворов неизвестного состава можно применять следующие методы 1) иммуноэлектрофорез в тех случаях, когда удается идентифицировать полосы преципитации, полученные с иммунной сывороткой (фиг., 31,у4) 2) метод Оссермана в тех случаях, когда исследователь располагает растворами референс-белка и соответствующей антисывороткой (фиг. 31, В) 3) метод так называемого истощения (фиг. 31, ), который вкратце заключается в следующем. [c.150]

Исследуемый белковый раствор неизвестного состава инкубируют со специфической иммунной сывороткой образовавшийся преципитат удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость в качестве истощенной иммунной сыворотки используют при иммуноэлектрофорезе известной смеси белков. В полученной иммуноэлектрофореграмме будут отсутствовать именно те компоненты, которые являются общими для исследуемого белкового раствора и для известной смеси белков, так как они удалили из иммунной сыворотки соответствующие антитела. [c.150]

В силу того что растворимость антигена ТТГ и антител к нему достаточно близки, для получения специфических антител из иммунной сыворотки был применен иммуносорбент — аминоцеллюлоза, и выделение антител к ТТГ проводили по. методу, разработанному Гурвичем в Институте микробиологии и эпидемиологии им. Н. Ф. Гамалея [107, 108]. Иммунизация проводилась стандартизованным импортным тиреотропным гормоном с биологической активностью 5 USP/ is . [c.517]

Если иммунная сыворотка или нормальный изоагглютинин агглютинируют не один тип эритроцитов, то адсорбция одним из типов эритроцитов удаляет реагирующие с данным типом антитела, оставляя в растворе антитела, реагирующие с остальными типами. Метод получения реагента для Ai-эритроци-тов, использовавщийся до введения в практику лектина из Doli hos (см. табл. I7, гл. V), демонстрирует поведение нормального изоагглютинина. Сыворотка группы В агглютинирует эритроциты как подгруппы А], так и подгруппы Аг. Адсорбция эритроцитами Аг удаляет, однако, антитела, реагирующие только с эритроцитами Аг, в результате чего в растворе остаются анти-А]-агглютинины. Адсорбция антител к альбумину куриного яйца альбумином утиного яйцар удаляет антитела, реагирующие с альбумином утиного яйца, а в растворе остаются антитела к альбумину куриного яйца (некоторые из них способны также реагировать с альбуминами яиц других видов птиц). [c.93]

Одновременную инкубацию обоих конкурентов (меченого и немеченного миозина) с первичными антителами использовали Кларк и соавторы для отбора моноклональных гибридбм — продуцентов антител против миозина. Роль иммунной сыворотки в этих опытах каждый раз играли среды культивирования различных гибридом, полученных в результате слияния клеток селезенки крыс и мышей, иммунизированных миозином, и клеток миеломной линии P3-X63-Ag8. Инкубацию проводили в боратном буфере (pH 8,4), содержащем 40 мМ пирофосфата натрия, по 1% Тритона Х-100 и дезоксихолата, а также 2% нормальной сыворотки крысы или мыши. Эту сыворотку вводили опять-таки ради создания эквивалентного соотношения концентраций при последующем добавлении вторичных антител в составе анти сыворотки козы против иммуноглобулинов крысы или мыши Использовав для конкуренции миозин гомологичного и гетеро логичного происхождения, авторы выясняли степень специфич ности антител, синтезируемых гибридомами [ lark et al., 1980] [c.282]

Для решения вопроса о том, являются ли антитела сывороточными глобулинами или же они только связаны с этой фракцией, можно использовать специфические методы очистки антител. Обычно эти методы включают два основных этапа 1) образование преципитата антиген—антитело и 2) диссоциацию преципитата и выделение чистого антитела. Первые успешные опыты этого рода были предприняты Фелтоном [42], который преципи-тировал антигенные полисахариды пневмококков соответствующей иммунной сывороткой, а затем разлагал преципитат, обрабатывая его гидроокисью бария. При такой обработке антитела переходят в раствор, нерастворимые же бариевые соли полисахаридов остаются в осадке. Гейдельбергер и его сотрудники успешно расщепляли подобные преципитаты, обрабатывая их концентрированными растворами хлористого натрия [43, 44]. В лаборатории автора для получения чистых антител преципитаты азобелков обрабатывались разведенными кислотами в присутствии нейтральных солей. При этом большая часть антител отщеплялась и переходила в раствор, а антиген и недиссоцииро-ванная часть антител оставались в осадке [45]. Растворы антител, полученные при помощи этих методов, содержат глобулины, не отличающиеся по свойствам от описанных выше нормальных глобулинов. Дальнейшие исследования показали, что больше 90% выделенных подобным образом глобулинов осаждается соответствующим антигеном. Это весьма убедительно подтверждает, что данные глобулины действительно идентичны с настоящими антителами. [c.336]

Реакция нейтрализации (PH). Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микроорганизмов или их токсинов на чувствительные клетки ткани. Это связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией. При постановке реакции смесь антиген — антитело, полученную in vitro, вводят животным или вносят в культуру клеток. При отсутствии повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов и токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, специфичности взаимодействия комплекса антиген — антитело. [c.179]

Недавно проведенные исследования Шмида и сотр. [44—48] показали, что препарат -кислого гликопротеина, гомогенный при свободном электрофорезе после очистки на ионообменной смоле, разделяется на семь компонентов при электрофорезе на крахмале по Смитису [49]. После удаления сиаловых кислот были получены три основные зоны. Эти опыты хорошо воспроизводимы, и их можно повторить на препаратах, полученных разными методами. До настоящего времени не удалось обнаружить каких-либо различий в соотношениях аминокислотных и углеводных компонентов во всех полученных фракциях (за исключением одного компонента, содержащего немного меньше тирозина и триптофана), и все фракции одинаково реагировали с иммунной сывороткой козы. [c.72]

Отбор крови и получение антисыворотки. Иммунизированное животное используется в качестве донора иммунной сыворотки в течение 5—7 мес, за это время удается провести 5—6 циклов иммунизации. Животных, прошедших несколько циклов иммунизации, называют гипериммуиными. Кровь у животных отбирают из вены уха (кролик) или непосредственно из сердца путем кардиальной пункции (кролик, морская свинка) в объеме 50—70 мл у кролика и 5—10 мл у морской свинки в стерильные пробирки, промытые стерильным буферным раствором. [c.153]

Электрофорез на тонких слоях геля крахмала применяли для разделения белков сыворотки [191—193]. Для обнаружения фракций белка слои геля крахмала окрашивали красителем амидным черным 10 В. Обнаружение и идентификацию зон, разделенных электрофоретически, осуществляют методом иммуно-электрофореза. Корнгольд [194] использовал метод, при котором зоны, полученные электрофорезом геля крахмала, диффундировали в слои агара, где они реагировали с нанесенной антисывороткой. Для этого после завершения электрофоретического разделения слой крахмала подрезали лезвием бритвы и осторожно переносили на слой агарового 1,2 %-ного студня. По- [c.516]

Еще до разработки технологии гибридом, позволившей получать гомогенные антитела, большое влияние на развитие клинической медицины оказали обычные антитела. Отметим, что наработка подходящих антител всегда осложнялась непредсказуемостью иммунного ответа, и их титр, как и перекрестные реакции, варьировали от животного к животному и от одной партии сыворотки к другой. Это определялось тем, что данный антиген вызывает образование целого набора антител. В основу метода получения практически неограниченного количества гомогенных антител, которые находят самое широкое применение, легла фундаментальная работа Кёлера и Мильштейна, выполненная в начале 70-х г. Рассмотрим несколько примеров. [c.329]

ЧТО найденные величины АЯ° в некоторых случаях больше, чем относительно малые величины, которые были вычислены другими авторами для иных систем антитело — антиген и антитело — гаптен. Однако наиболее любопытная особенность табл. 35 заключается в том, что она показывает заметную разницу в величинах анти-В-изоагглютининов, полученных из крови людей с различными группами крови или даже принадлежащих к различным генотипам. Эти данные были подтверждены исследованием сывороток 36 лиц с генотипом А1О, 6 — с генотипом АхА и 8 — с генотипом 00. Фракция анти-В-изоагглютининов в сыворотке любого данного индивидуума, по-видимому, всегда гомогенна. Эта гомогенность находится в заметном противоречии с установленньй фактом гетерогенности иммунных антител (см. стр. 23) и, если она подтвердится, будет служить сильной [c.180]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология