Среды для культуры клеток ФЭК

В настоящее время становится ясно, что растительные клетки образуют обычно целый ряд внеклеточных (внешних по отношению к цитоплазматической мембране) ферментов, которые либо локализуются в клеточной стенке, либо выделяются в среду, окружающую клетки. Страус и Кемпбелл [15] исследовали секрецию ферментов в культуре ткани у шести различных видов высших растений. Ткани всех изученных видов выделяли в среду амилазу, пероксидазу, кислую фосфатазу и оксидазу индолилуксусной кислоты. У И различных видов растений было [c.18]

Указанные недостатки устраняются при непрерывном культивировании, методы которого разработали С. В. Лебедев, А. А. Андреев, Н. Д. Иерусалимский и другие ученые. Из непрерывных процессов лучше всего разработан метод глубинной ферментации. В этом случае в ферментатор с культурой продуцента непрерывным потоком подается стерильная среда, а из него непрерывно вытекает готовая культуральная жидкость. Процесс может быть гомо- и гетерогенно непрерывным. При гомогенно непрерывном процессе в аппарате, где идет интенсивное перемешивание, все параметры (концентрация питательных веществ, клеточный титр и др.) постоянны во времени. При гетерогенно непрерывном процессе несколько ферментаторов соединены вместе и образуют каскад. Питательная среда поступает в первый ферментатор и готовая культуральная жидкость вытекает из последнего ферментатора. Культивирование микроорганизмов в протоке через систему трубок также идет по принципу гетерогенно непрерывного процесса ферментации. В этом случае имеет место непрерывный поток питательной среды, но клетки не обеспечены постоянными условиями роста (сколько аппаратов, столько и условий культивирования). [c.69]

Перемешивание культуральной среды влияет и на другие параметры скорость переноса кислорода из пузырьков газа в жидк> ю среду, а затем из среды в клетки эффективность теплопередачи точность измерения концентрации метаболитов в культуральной жидкости эффективность диспергирования добавляемых реагентов (кислот, оснований, питательных веществ и т. д.). Исходя из всего этого, можно было бы предположить, что чем интенсивнее культура перемешивается, тем лучше она растет. Однако при чрезмерном перемешивании среды в ней могут возникнуть гидромеханические эффекты, губительные для бактериальных клеток и клеток [c.355]

Так, применительно к дрожжам, инокулюм получают на средах, обеспечивающих полноценное развитие клеток, после чего основную среду с ацетатом (активатором биосинтеза стеринов), обогащенную источником углерода и содержащую пониженное количество азота (высокое значение /N), засевают сравнительно большим объемом инокулята. Культивирование дрожжей (ферментацию) проводят при температуре, близкой к максимальной для конкретного штамма, и выраженной аэрации (2% О2 в газовой фазе). Спустя 3—4 суток, в зависимости от ростовых характеристик и биосинтетической активности культуры, клетки сепарируют и подвергают вакуум-высушиванию. Затем сухие дрожжи облучают ультрафиолетовыми лучами — УФЛ (длина волны 280—300 нм) в течение оптимального по продолжительности времени, при требуемой температуре и с учетом примесных веществ. Эти контролируемые показатели, установленные опытным путем, указываются в регламентной документации. Облучение дрожжей можно проводить до сепарирования клеток в тонком слое 3% суспензии, учитывая малую проникающую способность УФА [c.451]

В случае культур, выращенных на твердой среде, нет необходимости использовать центрифугу или другие средства для сбора клеток, поскольку в этих культурах клетки находятся уже в сконцентрированном состоянии. Вместо этого на поверхность агара пипеткой наливают небольшое количество стерильного солевого раствора или буфера и суспендируют в нем выросшие колонии с помощью стерильного стеклянного шпателя. Таким способом можно получить большое количество клеток с поверхности агаровых сред в чашках Петри, в больших плоских культуральных матрасах (бутылях типа РУ) и в больших плоских чашках (покрытых крышками из пирекса). Особенно следует избегать центрифугирования при получении большого количества патогенных или [c.362]

Культура-нянька — рост клетки или клеток на подлежащей культуре различного происхождения, которая в свою очередь находится в контакте с культуральной средой. Культивируемая клетка или ткань может быть отделена от питательного слоя пористым материалом — фильтрованной бумагой или мембранными фильтрами. [c.495]

Это представление подтверждается существованием стволовых клеток, сохраняющих некоторые черты эмбриональных клеток при каждом делении стволовой клетки образуется новая стволовая клетка плюс дифференцированная клетка. Последнее явление трудно объяснить только как реакцию на химические сигналы из окружающей среды. Согласно некоторым наблюдениям, клетки животных обладают ограниченным потенциалом деления [176, 177]. Например, нормальные диплоидные фибробласты человеческого эмбриона при выращивании в культуре делятся примерно 50 10 раз, после чего погибают независимо от условий культивирования. Фибробласты, полученные от людей старшего возраста, погибают после меньшего числа клеточных деле яйй. АнаЛОгнтаым йбразом быс трее norti6atdlf в культуре клетки жи- [c.360]

Однако поведение клеток в какой-то мере зависит и от окружающих условий. Поэтому исследователям приходится тщательно подбирать состав культуральной среды, в которой пигментные клетки могут выживать. В некоторых средах или при слишком высокой плотности культуры клетки выживают, но не синтезируют или почти не синтезируют пигмента. Но да лишенные возможности проявить свою специализацию, эти клетки остаются детерминированными как пигментные оказавшись снова в более подходящи условиях, они вновь начинают вырабатывать пигмент. Никакие изменения [c.132]

Пристеночную культуру клеток выращивали на питательной среде типа ПС (144) в матрасах емкостью 1,2 л. В среду вносили клетки из расчета 5-10 кл/л и разливали полученную суспензию в матрасы по 100 мл. Культуру выращивали при температуре 36—37°С в течение 5—7 суток без смены питательной среды. [c.144]

Желатиновые культуры готовят следующим образом. Культуры выращивают в соответствующих средах и клетки получают центрифугированием в стерильных условиях. Осадок клеток ресуспендируют в малом количестве жидкой среды, переносят в пробирку с 2—5 мл расплавленной пищевой желатины и инкубируют при 30 °С до достижения плотности 10 —10 клеток/мл. Затем с помощью стерильной пастеровской пипетки или шприца вводят каплю бактериальной суспензии на дно стерильной пластмассовой чашки Петри. Чашку Петри помещают в эксикатор, содержащий пятиокись фосфора, и откачивают из него воздух вакуумным насосом. После того как капли желатины высохнут, их переносят с соблюдением правил асептики в стерильные пробирки с завинчивающимися крышками и хранят в холодильнике. Культуру бактерий получают после переноса желатиновой капли в стерильных условиях в пробирки, содержащие соответствующие среды. [c.517]

Клетки выращивают при 37 °С либо в богатой питательной среде (например, в сердечно-мозговом бульоне), либо в подходящей минимальной среде в условиях слабой аэрации, достигаемой покачиванием колбы на скорости, которой едва хватает, чтобы привести в движение поверхность среды. Культуру объемом 100 мл помещают в 250-мл колбу Эрленмейера эти величины могут быть пропорционально уменьшены или увеличены. Для получения оптимального лизиса клетки следует собирать в середине логарифмической фазы роста. [c.130]

Если в культуре концентрация клеток недостаточна или если в среде присутствуют вещества, мешающие определению, то клетки собирают центрифугированием. Комплексные среды содержат компоненты нуклеиновых кислот и сахара, которые удаляются при сборе и отмывании клеток центрифугированием. Для большинства бактерий клетки собирают центрифугированием при 5000 g в течение 15 мин при 4—5°С. Осажденные клетки суспендируют в ЦСР в объеме, составляющем Vio объема культуры. Клетки центрифугируют 15 мин при 5000 g и температуре 5°С и ресуспендируют в холодном ЦСР. Если клетки растут в солевой среде и концентрация их достаточна, культуру можно использовать для выделения ДНК непосредственно. [c.336]

Идея о возможности культивирования клеток вне организма была высказана еще в конце прошлого века в отношении клеток растений. Однако впервые удалось ввести в культуры клетки животных, что было осуществлено в начале нашего века. Культивировать растительные клетки на искусственных питательных средах исследователям долго не удавалось. Первые успехи в этой области относятся к 30-м годам, и бурное развитие нового направления работ с клетками растений и животных происходит в 60—70-е годы. [c.7]

Рис. 6-78. Электронная микрофотография (А) и схематическое изображение (Б) перинуклеарных эндосом из молодых клеток почек хомячка, растущих в культуре. Клетки инкубировали в среде, содержащей пероксидазу, 15 мин при 37°С, что вполне достаточно для поглощения пероксидазы путем жидкофазного эндоцитоза и переноса в эндосомы (и эидолизосомы, см. текст), но недостаточно для поступления в лизосомы После фиксации клеток и выдерживания их с субстратом пероксидазы (диаминобензидином) продукты ферментативной реакции фиксировали тетроксидом осмия для увеличения электроноплотности На (Б) изображена усредненная картина, полученная из 18 тонких срезов Ядро клетки

Миеломные культуры. Клетки выращивают в среде Игла в модификации Дульбекко (СИМД) с добавлением 10% плодной сыворотки коровы, 10% донорской лошадиной сыворотки, 5% бикарбоната Na, 2% i -глутамина, 0,1% гентамицина и 1% пирувата Na. Доводят pH среды до 7,2—7,4 (по индикатору феноловому красному) 5н. раствором NaOH. [c.311]

Синтез рибосомных РНК строго скоординирован с синтезом рибосомных белков так, что в клетках в заметных количествах не обнаруживается ни свободных рибосомных РНК, ни свободных рибосомных белков. Скорость образования рибосом регулируется в быстро растущих на богатых питательных средах культурах эта скорость высокая, в медленно растущих на бедных средах — низкая. Механизмы координированной регуляции синтеза компонентов, рибосом отличаются большой сложностью и изучены еще недостаточно. Здесь будет рассмотрен только один элемент этой регуляции, основанной на взаимодействии с РНК-полимеразой низкомолекулярного эффектора гуанозинтетрафосфата. Этот нуклеотид синтезируется на рибосомах в условиях аминокислотного голодания клеток. Накопление гуанозинтетрафосфата в голодающих по аминокислотам клеткам приводит к значительному замедлению синтеза рибосомных РНК и мРНК рибосомных белков и может стимулировать транскрипцию оперонов биосинтеза аминокислот. [c.154]

Для изолирования культур используют также метод Линдне-ра. Согласно этому методу на покровное стекло кончиком пера наносят ряды капель культуры различного разведения и рассматривают в микроскоп каждую каплю. Каплю, где находится только одна клетка, с помощью кусочка стерильной фильтровальной бумаги переносят в стерильную среду. Отдельную клетку из препарата под микроскопом можно изолировать манипулятором. [c.67]

Антитела составляют фракцию гамма-глобулинов сыворотки крови, называемую еще иммуноглобулинами. Известно 5 типов иммуноглобулинов. Получение чистых антител из иммуноглобулиновой фракции до недавнего времени было труднодоступно. Однако в 1975 г. Мнльштейн и Коллер сделали важное открытие, установив, что В-клетки, продуцирующие только один вид антител, могут сливаться с клетками миеломы. В то время как В-клетки не могут быть выращены в виде культуры, клетки миеломы в культуре растут и размножаются. Среди образующихся в результате слияния гибридных клеток, называемых гибридомами, обнаруживаются клетки, сохранившие способность образовывать те же самые антитела, что и В-клетки, использовавшиеся для получения гибридом. В то же время эти гибрид омы сохраняют бессмертный характер миеломных клеток. Таким образом, было осуществлено клонирование гибридомных клеток, полученных на основе В-клеток, способных синтезировать определенный вид антител, что дало возможность получать неограниченное количество таких антител. [c.315]

На питательных средах молодые клетки ризобий представляют собой подвижные неспороносные грамотрицательные палочки. Среди них встречаются и мелкие угловатые и кокковидные клетки. В старых культурах клетки более крупные, палочковидные, неподвижные, изредка встречаются Т-образные бактероидные формы. [c.124]

Культуральное исследование. При размножении лейшмании на среде NNNu л 22 °С обильный рост наблюдается на 8 — 10-й день. Культуры хранят при комнатной температуре. Посевы микроскопируют ежедневно (с объективом 40х). Для обнаружения возбудителя готовят нативные препараты по методу раздавленной капли. В культуре клетки лейшманий приобретают удлиненную (10 — 12 мкм) конфигурацию со жгутом (промастиготы). Если в течение 40 дней возбудитель не обнаружен, результаты посева считают отрицательными, но это не позволяет полностью исключить лейшманиоз. [c.362]

Вирусы могут размножаться только в живых клетках. Для их культивирования в лаборатории используются куриные эмбрионы, культура ткани и т. д. Первичная культура ткани обычно готовится по методу Эндерса и др. [10]. Метод основан на том, что 0,25% трипспн действует на небольшие кусочки ткани (обычно почечной), отделяя клетки одну от другой. Будучи помещенными в стеклянный или пластиковый флакон, пробирку или чашку вместе с питательной средой, эти клетки прикрепляются к стенке сосуда и размножаются. В результате на стенке образуются монослойные клетки перевиваемой тканевой культуры. [c.278]

Морфологические тесты [11]. Наиболее представительны изменения, возникаюш,ие у нитчатых водорослей (кладофора, ризоклониум, спирогира, осциллятория). Эти водоросли отличаются длинным ветвящимся талломом и крупными клетками, поэтому нарушения, возникающие у них под влиянием токсичных агентов, хорошо заметны даже визуально. Наиболее доступным объектом является культура кладофоры, которая легко сохраняется в лабораторных условиях. Культуры часто засоряются другими водорослями и водными животными. Однако поддержание культур в относительно чистом виде не вызывает больших трудностей и сводится к регулярному пересеву отдельных клеток или нитей в чистую среду. Культуру кладофоры можно вывести также из зооспор, образующихся в процессе размножения водоросли. [c.31]

Одиако поведение клеток в какой-то мере зависит и от окружающих условий. В некоторых средах или при чрезмерной плотности культур клетки выживают, но не синтезируют или почти не синтезируют пигмента. Но даже лишенные возможности проявить свою специализацию, эти клетки остаются детерминированными как пигментные оказавшись снова в более подходящих условиях, они вновь начинают вырабатывать пигмент. Есть одно известное исключение из этого правила при определенных условиях эти клетки будут иередифференцироваться в клетки хрусталика однако никакими изменениями культуральной среды и условий роста не удается превратить их, например, в клетки крови, печени или сердца. [c.152]

Для исследования живых бактериальных клеток разработан ряд методов. При микроскопировании можно использовать культуры, выраш,енные в жидких средах, однако для получения нужного числа бактерий они нуждаются, как правило, в разведении стерильной средой. Культуры, выраш енные на твердых средах, можно суспендировать с помощью стерильной петли или иглы в капле стерильной жидкой среды или какого-нибудь раствора, но не водопроводной воды, до слабого помутнения (разд. 2.5.1). Следует помнить, что возраст культуры и физико-химические параметры среды могут быть причиной ненаследуемых (фенотипических) модификаций как внепротоплазматических компонентов (жгутики и капсулы), так и компонентов, находящихся внутри собственно клетки (различные включения) все эти компоненты являются важными признаками, по которым ведется идентификация. Вместе с тем специальные операции или пересевы, производимые в лаборатории, могут благоприятствовать развитию мутантов, имеющих наследственно измененные по сравнению с диким типом черты строения. Изменения могут быть стабильными и нестабильными, но очевидно, что при описании формы и структуры бактерий условия содержания культуры должны быть строго определенными, так как старение культуры и изменения состава среды могут быть причиной ряда морфологических изменений. [c.56]

Этот метод применяют в том случае, если выделяемый микроорганизм не растет на твердой среде. При этом данный микроорганизм должен количественно преобладать в смешанной популяции. Готовят раствор смешанной культуры таким образом, чтобы при добавлении аликвот в большое число пробирок с питательной средой среднее число инокулированных бактерий было бы менее 0,05 на пробирку. Это достигается, например, при инокуляции 1-миллилитровых аликвот в 100 пробирок из 100 мл раствора, содержащего всего 5 бактерий. При инкубации в большинстве пробирок роста бактерий не происходит, но в те несколько пробирок, где наблюдается рост, вероятно, попала лишь одна бактерия (Р = 0,975). Чем меньше среднее число бактерий, инокулированных в пробирку, тем больше вероятность того, что культура выросла из единственной бактериальной клетки. Следовательно, в большинстве инокулированных пробирок роста быть не должно, тогда в тех нескольких пробирках, где рост наблюдается, вероятность инокулирования среды единственной клеткой очень высока. Обсуждение теоретических аспектов этого метода приводится в работе [51]. [c.323]

В комплексной среде бактериальные клетки часто используют имеющиеся субстраты последовательно. Присутствие определенных субстратов может привести к подавлению синтеза ферментов, участвующ%их в метаболизме других питательных веществ. В этом случае ферменты, катализирующие метаболизм некоторых веществ, начинают действовать лишь после того, как концентрация субстратов, репрессирующих их синтез, уменьшится в результате использования клетками. Регуляция физиологии бактерий приводит к изменениям кривой роста и появлению одной или нескольких переходных (т. е. временных) стационарных фаз. Такой ответ культуры на изменение состава среды называют диауксией. Классическим примером диауксии может служить рост Es heri hia oli в присутствии глюкозы и лактозы (рис. 10.2). Сначала происходит рост культуры за счет использова- [c.381]

Несколько подходов к определению роста совпадают лишь в одном случае — при сбалансированном росте [13]. Асинхронная культура достигает сбалансированного роста лишь тогда, когда каждое экстенсивное свойство культуры экспоненциально растет во времени. Понятие экстенсивное свойство происходит из физической химии и относится к таким свойствам системы, которые увеличиваются тем значительнее, чем их больше в системе. Например, масса и количество клеток в определенном объеме культуры являются ее экстенсивными свойствами, а температура или количество ДНК на клетку таковыми не являются. Приложимость этого физикохимического принципа к бактериологии связана с идеей о том, что е сли культура растет достаточно долго и при этом незначительно изменяет окружаюгцую среду, то рано или поздно бактерии достигают одинакового сбалансированного со средой состояния независимо от начальных условий их роста. При достижении сбалансированного роста и при условии постоянства среды культура будет оставаться в этом состоянии бесконечно долго (если не изменится в результате мутаций или селекции). Однако это только теория. Практически невозможно измерить все параметры культуры, даже если она поддерживается в состоянии непрерывного разведения. Однако если использовать менее жесткие критерии, то культуры, находягциеся в состоянии сбалансированного роста, изучать довольно просто. [c.443]

Клетки выращивают в соответствующей среде. В случае жидких культур клетки отделяют в стерильных условиях центрифугированием и ресуспендируют осадок в стерильной свежей среде, содержащей или 10% (объем/ объем) глицерина (готовят добавлением 20%-ного глицерина к равному объему стерильной среды), или 5% (объем/объем) ДМС (приготовленного добавлением соответствующего количества 1007о-ного ДМС к стерильной среде). В случае роста культур на агаре клетки смывают с его поверхности стерильной жидкой средой, содержащей подходящий криопротектор, и разливают в стерильные маркированные ампулы по 0,4 мл суспензии, содержащей не менее 10 клеток/мл. [c.528]

Чтобы отделить клетки от культуральной среды, культуру центрифугируют или фильтруют. Если исследуют небольшие образцы, достаточно двухминутного кручения на микроцентрифуге более крупные образцы (>100 мл) центрифугируют при 8000 об/мин в течение 5 мин (например, в роторе Sorvall НВ4). С равным успехом можно использовать и другой метод — фильтрацию через мембраны типа Millipore (диаметр пор [c.234]

Рис. 12-30. Схематизированное изображение радиоавтографа, демонстрирующего метаболическое сопряжение клеток, связанных щелевыми контактами, в культуре in vitro. Мутантные клетки лишены фермента тимидинкиназы и поэтому не могут включать в ДНК радиоактивный тимидин, добавленный в среду. Нормальные клетки способны включать тимидин в ДНК, и их ядра на радиоавтографе усеяны черными точками (зернами серебра). В смешанной культуре нормальных и мутантных клеток метку включают также ядра тех мутантных клеток, которые соприкасаются с нормальными клетками и образуют с ними щелевые контакты. Это обусловлено тем, что в нормальных клетках радиоактивный тимидин включается в низкомолекулярный предшественник ДНК (дезоксинуклеозидтрифосфат), который затем через щелевой контакт переходит в мутантную клетку и включается в ДНК.

Низин. При засеве свежей питательной среды культурой La to o us la tis вместе с посевным материалом вносят и низин. Отмечено, что общее количество низина (внутриклеточного и содержащегося в культуральной жидкости) в процессе развития бактерий снижается и к концу периода лаг-фазы клетки стрептококка практически не содержат его. Синтез низина происходит после экспоненциального роста бактерий в период ранней стационарной фазы. [c.112]

Одним из факторов, лимитирующих рост фибробластов, является недостаточное содержание в среде необходимых компонентов (Dulbe o, Elkington, 1973). Следовательно, для получения высокой плотности клеток необходима периодическая замена питательных веществ. А это приводит к постоянному изменению состава среды, омывающей клетки, что весьма нежелательно. Культуры клеток на искусственных капиллярных подложках лишены этого недостатка, но до сих пор не получили достаточного распространения частично из-за трудностей в эксплуатации и частично в связи с проблемами, возникающими при сборе клеток. [c.38]

При пересеве клеток в новые сосуды рост клеток с максимальной скоростью возобновляется не сразу, особенно при низкой плотности посева клеток. В течение 1—2 дней после посева клетки находятся в лаг-фазе, в течение которой они адаптируются к новым окружающим условиям и кондиционируют новую среду. Как было показано (Риск, 1972), это не является обязательным свойством растущих клеток. Лаг-фаза может быть практически элиминирована, если избегать избыточной трипсинизации клеток и поддерживать клетки при пересеве при 37 С. Большинство мышиных клеток L929 начинают делиться в течение суток после пересева более концентрированного инокулята. Тем не менее в течение первых суток после посева часто наблюдается слабое увеличение количества клеток только через двое суток количество клеток удваивается. После этого экспоненциальный рост может поддерживаться в течение последующих 2—10 суток, если ростовая поверхность сосуда достаточно велика и регулярно производится смена среды. В дальнейшем, однако, скорость роста падает и количество клеток достигает насыщения (рис. 5.2). Некоторые клетки на этой стадии могут сохранять жизнеспособность в течение нескольких недель, особенно при смене среды каждые 5 дней. В других линиях клеток, растущих в так наз ываемой монослойной культуре, клетки начинают наползать друг на друга, нижележащие клетки оказываются в условиях недостатка питания и вскоре [c.57]

Среди современных приемов исследования особое место занимают методы культуры клеток и тканей. Разработан комплекс экспериментальных методов, позволяющих поддерживать рост и размножение растительных клеток, изолированных из растений и помещенных для выращивания на специальные стерильные питательные среды. В этих условиях клетки утрачивают признаки, характерные для той ткани, из которой они были взяты, и в дальнейшем ведут себя как независимые одно-клеточные организмы. При выращивании на твердой питательной среде размножающиеся клетки формируют видимые простым глазом колонии (культура ткани, или каллюс), а при выращивании в жидкой пиtaтeльнoй среде возникает суспензия, состоящая из одиночных клеток и различных по числу клеток агрегатов (культура клеток). Это состояние неорганизованного роста и размножения клеток можно поддерживать в течение [c.9]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология