Лоури-Фолина метод

Метод Лоури и сотр. [120], в котором используется фенольный реактив Фолина с предварительной обработкой белка щелочным раствором медных солей, очень широко применялся для определения белков вообще, а также и для гликонротеинов [121, 122]. Методика проста, в гидролизе нет необходимости, чувствительность реакции высока. Однако серьезный недоста- [c.150]

Наиболее распространенным колориметрическим способом определения белков является метод Лоури и др. [90] с использованием реактива Фолина. В реакции с этим реактивом получают синее окрашивание в результате взаимодействия белка с ионом меди в щелочном растворе (биуретовая реакция) и восстановления фос- [c.356]

Е. Метод Фолина—Лоури [c.395]

Определение пептидов по методу Фолина — Лоури [58] [c.131]

Колориметрия растворимых белков по методу Лоури проводится следующим образом. 1 мл раствора белка смешивают с 5 мл реактива В и оставляют стоять при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем быстро прибавляют 0,5 мл раствора Г и интенсивно перемешивают (в течение 1—2 с). Спустя 30 мин измеряют величину экстинкции при 500 нм (если концентрация белка достаточно высока) или при 750 нм (в случае низкой концентрации белка). В качестве стандарта используют растворы сывороточного альбумина быка или человека в концентрации 0,02—0,5 мг/мл. Реактив В готовят, смешивая 50 мл раствора А (2%-ный раствор углекислого натрия в 0,1 н. гидроокиси натрия) и 1 мл раствора Б (0,5%-ный раствор Си504Х Х5НгО в 1%-ном цитрате натрия или 1%-ном тартрате калия). Реактив Г представляет собой разведенный до конечной концентрации кислоты реактив Фолина—Чокальто. [c.455]

Концентрацию белка определяют по градуировочному графику (обычно с небольшими отклонениями от линейной зависимости), построенному с помощью подходящего стандартного белка. Разные белки дают заметно различающиеся величины поглощения в методе Лоури - Фолина, отчасти это зависит от содержания тирозина и триптофана. [c.466]

Определение содержания белков по методу Лоури проводят так. Из каждой фракции, получаемой после вытекания раствора из колонки, отбирают градуированной пипеткой по 2 мл жидкости. Жидкость переносят в пробирку и туда же добавляют I мл реактива В. Содержимое пробирки перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 минут. Затем в пробирку добавляют 0,1 мл реактива Фолина. Через 30 минут желтая окраска жидкости переходит в синюю и интенсивность окраски определяют на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре. [c.62]

С полученным осадком белка проводят колориметрическую реакцию по модифицированному методу Лоури [164]. Для этого к осадку добавляют 1 мл воды и 1 мл раствора А . Реакционную смесь тщательно перемешивают и вьщерживают 10 минут при комнатной температуре. После этого к ней добавляют 0,5 мл раствора Фолина " , разведенного в 10 раз, перемешивают, вьщерживают 30 минут при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность при длине волны 750 нм. Установка прибора на нулевое положение осуществляется по контрольному раствору, состоящему из 1 мл щелочного гидролизата, полученного из исходного концентрата с добавлением всех компонентов реакции. [c.78]

В основу метода определения белка по Лоури положена реакция Фолина, открывающая в белке тирозин и триптофан. Окрашенный белковый комплекс получают в два этапа 1) реакция меди с белком в щелочной среде 2) восстановление фос-фомолибденово-фосфовольфрамового реагента белком, обработанным медью. [c.71]

Анализ элюируемых фракций. Содержание пептидов в элюатах можно определять количественно посредством реакции с нингидрином или по Фолину — Лоури, а также одним из реактивов на специфические аминокислотные остатки (см. стр. 129—131). Метод Фолина — Лоури является более чувствительным, особенно в случае длинноцепочечных пептидов. Чувствительность нингидринной реакции на пептиды может быть значительно увеличена путем предварительного проведения быстрого щелочного гидролиза [35]. Если нингидринную реакцию предполагается использовать при анализе фракций с колонок, для элюирования которых будут применяться пиридиновые или коллиди-новые буферы, то соответствующие растворители необходимо предварительно перегнать над нингидрином для удаления взаимодействующих с ним примесей. Если же при анализе фракций, содержащих пиридиновые или коллидиновые буферы, необходимо использовать реакцию Фолина — Лоури, то пробы упомянутых фракций следует предварительно упарить досуха для удаления из них пиридина и коллидина, которые мешают этому определению. Это упаривание удобно проводить путем отбора аликвотных проб соответствующих фракций в аналитические пробирки [c.119]

Концентрацию пептидов можно определять методом Фолина—Лоури, в основе которого лежит реакция пептида с тарт-ратом меди в щелочной среде. Образующийся комплекс восстанавливает фосфовольфрамат с образованием синего соединения с Атах при 750 нм (гл. 35). Метод в основном применяют для определения белков в растворе. [c.395]

Замечание. Добавление 10%-ного ДСН обязательно, поскольку ДСН предотвращает образование осадка при приливании реагента Фолина к образцам, содержащим тритон Х-100. В диапазоне 40—120 мкг зависимость поглощения от количества белка линейна. Допустимое содержание тритона Х-100 в образце составляет <1%, при большей концентрации детергента необходимо добавить соответствующее количество белка-стандарта, чтобы компенсировать образование окраски. Предложено перед определением по методу Лоури удалять тритон Х-100 путем однократной экстракции изоамило-вым спиртом [245]. [c.295]

Жидкая фаза пульпы. Для определения белка биомассы в жидкой фазе пульпы твердую часть отделяют центрифугированием при 1000 об/мин в течение 1 мин, а клетки концентрируют при 6000 об/мин в течение 20 мин. Осадок подсушивают опрокидыванием центрифужных стаканчиков на фильтровальную бумагу. Благодаря этой процедуре исключается влияние ионов тяжелых металлов из выщелачивающих растворов на количественное определение белка. Следовые количества их, сорбирование клетками, не вносят искажений в результаты анализов. Гидролизуют клетки в том же режиме, как и при определении белка биомассы в пульпе. Выпавший осадок окисного железа отделяют центрифугированием при 6000 об/мин. Белок в супернатанте определяют по методу Лоури. Для этого к 1 мл гидролизата добавляют 5 мл раствора С , вьщерживают 10 минут при комнатной температуре, после чего добавляют 0,5 мл раствора Фолина, разбавленного в 2 раза. Оптическую плотность измеряют через 30 мин при длине волны 750 нм. [c.79]

Для определения содержания белка в растворах широко используются фотометрические методы анализа [1, 2]. В ряде случаев возможно определение белка по собственному поглощению при длинах волн 220 и 280 нм [1]. Более селективным является фотометриро вание окрашенных комплексов белка, полученных по различным реакциям ксантопротеиновой, биуретовой и реакции Лоури [2, 3]. Среди них наиболее специфичной и чувствительной является реакция Лоури, в которой белок вступает во взаимодействие с реактивом Фолина [4] в сочетании с биуретовой реакцией. Именно сочетание этих двух фотометрических реа1кций (реакция на пептидные связи и на обязательные ароматические аминокислоты белка) делает метод высокочувствительным и избирательным, т. е. позволяет его использовать для определения белка в сложных смесях. По данным [5], метод Лоури чувствительнее метода, основанного на биуретовой реакции, в 100 раз, а в сравнении с методом определения по собственному поглощению — в 10—20 раз. [c.37]

С ошибками, которые по опубликованным данным присущи трем обычно используемым методам определения белка биуре-товому методу, методу Лоури и методу Бредфорда. Для этих трех методов ошибки определений устанавливали, сравнивая опубликованные данные (Инструкция по определению белка фирмы Bio-Rad, с. 3—4) с количествами белков, определяемыми гравиметрически. В качестве стандартов для определения по Лоури и Бредфорду использовали бычий -у-глобулин, а для определения биуретовым методом — БСА. Несмотря на некоторые различия в определениях при двух длинах волн, диапазон ошибок (средний уровень отклонений) для определений по площади пиков при 205 нм укладывается в диапазон ошибок для трех стандартных колориметрических определений. Петерсон (Peterson, 1983) в своем обзоре указывает, что измерение по поглощению при 205 нм в два раза чувствительнее, чем модифицированный фенольный метод Фолина при определении белка по Лоури. [c.127]

Чувствитаяьный метод, в основе которого лежит колориметрическая реакция с фенольным реактивом Фолина — Чокальтеу [1 ], очень широко используется для определения отдельных белков, а также для контрольного анализа вытекающих из колонок элюатов, которые содержат много различных белков. Детали, приведенные ниже, взяты в основном из метода Лоури и др. [2], однако для получения более стабильного реактива Б вместо виннокислого натрия используется лимоннокислый натрий [3]. [c.265]

Теперь мы опишем несколько доступных методов определения белка. Некоторые из них, требующие специальной аппаратуры (определение азота по Кьельдалю, рефрактометрия), исключены из рассмотрения. К наиболее широко применяемым методам относятся 1) биуретовая реакция с использованием щелочного pj TBopa соли меди 2) метод Лоури с применением реактива Лоури—Фолина—Чиокалто 3) измерение оптической плотности в УФ-области спектра при 280 нм (полоса поглощения ароматических групп) или при 205—220 нм (полоса поглощения пептидных групп) 4) связывание красителей. [c.310]

В основе чувствительного колориметрического метода определения белков в элюатах лежит биуретовая реакция, а также реакция с фенольным реактивом Фолина—Чокальто [77] в модификации Лоури [78]. Таким путем определяют белок в кон- [c.454]

Сошедший с колонки элюат можно анализировать любым подходящим методом. Вещества, содержащие ароматические кольца (полистиролы, белки, нуклеиновые кислоты), можно оценить количественно не только с помощью уже описанных автоматических регистрирующих устройств, но также и путем прямого измерения отдельных фракций на спектрофотометре. Для всех твердых веществ вполне приемлем разработанный Крэйгом [63] метод анализа по сухому остатку, который заключается в том, что аликвотную часть элюата упаривают в полусферических чашечках и затем взвешивают остаток. Многие соединения удается анализировать с помощью специфических цветных реакций. Для белков, например, цветная реакция Фолина — Лоури оказывается более чувствительной, чем прямое измерение поглощения в ультрафиолете. Эту реакцию можно проводить непрерывно на автоматическом анализаторе [45]. Еще более чувствительный метод основан на образовании биурето-вого комплекса с избытком радиоактивной меди. (Этот метод позволяет обнаружить белок [c.79]

Прямые методы. 1. Сырую биомассу определяют после осаждения клеток центрифугированием. После центрифугирования отмытых клеток можно определить сухую массу. Оба метода не свободны от довольно больших систематических ошибок. 2. Гораздо большую точность обеспечивает определение общего азота (метод микро-Кьельдаля и микродиффузионный метод определения аммиака), а также определение общего содержания углерода (по ван Слай-ку-Фолчу). 3. В повседневной практике часто определяют содержание бактериального белка. Хорошие результаты дают модификации биуретового метода и другж колориметрические методы. Микрометоды основаны на измерении количества характерных компонентов белка тирозина, триптофана (по Лоури или Фолину). [c.192]

Метод Кьельдаля относительно сложен, требует предварительного выделения белка из смеси, медленен, но при соблюдении всех предосторожностей — точен. Биуретовый метод — средней точности, быстр, может быть весьма полезным для сравнительных анализов. Безусловно, лучшим является широко используемый сейчас фотометрический метод Лоури. Интенсивность окраски, возникающей при одновременном протекании в нем биуретовой реакции и реакции Фолина, значительно большая, чем при применении одного лишь биуретового реактива. Установлено, что метод Лоури в 100 раз чувствительнее биуретовой реакции и в 10—20 раз — чем метод, основанный на измерении поглощения света при 280 ммк. [c.139]

Широкое распространение получил также метод Лоури, в котором сочетаются две реакции — на ароматические аминокислоты (с реагентом Фолина) и биуретовая. Его чувствительность значительно выше — до 0,01—0,05 мг1мл. Однако его эффективность для белков, существенно различающихся по содержанию ароматических аминокислот, неодинакова. Кроме того, на правильность результатов определения по Лоури оказывают заметное влияние многие примеси, например, нуклеиновые кислоты. [c.34]

Наиболее широкое применение нашел метод Лоури [225]. Возникающая окраска в основном определяется реакцией фенольного реагента (Фолина — Чикольте) с остатками Туг, но определенный вклад дают некоторые другие аминокислоты — Тгр, His и ys, а также пептидные связи. Зависимость интенсивности окраски от количества белка-стандарта не линейна. Определению мешают детергенты, используемые для солюбилизации белков. Предлолсепо много различных модификаций метода. [c.291]

Определение количества белка является относительно простым методом оценки числа клеток. Этот метод особенно удобен в монослойной культуре, и важное его преимущество заключается в том, что промытые препараты могут храниться долгое время в замороженном виде это не искажает конечный результат и облегчает скрининг. Завышенная оценка числа клеток может иметь место при изучении действия некоторых препаратов, подавляющих репликацию, но не влияющих на синтез белка (например, 5-бромдезоксиуридин и метотрексат). Для монослойной культуры была разработана специальная модификация метода Лоури, использующая феноловый реагент фолина [30]. Рекомендуется также метод с амидо-черным, при котором линейность стандартной кривой сохраняется в более широком диапазоне концентраций [3]. Вывод о цитотоксичности при использовании этого метода можно делать, если изменение накопления белка в культуре в течение времени показано в нескольких точках если же точка одна, то воздействие лекарственного препарата должно быть длительным и должен существовать период восстановления. [c.276]

Концентрация кислоты в реактиве Фолина должна быть 1 мл-экв. Для определения концентрации кислоты берут 2 см реактива, разводят в 10 раз дистиллированной водой и титруют 0,1 н. раствором щелочи по фенелфталеину. При концентрации кислоты выше указанной в раствор Фолина добавляют воду. Примечание. Интенсивность окраски белка по Лоури устойчиво сохраняется при наличии в растворе ряда веществ в концентрации не превышающей указанную этиловый спирт, эфир - 5%-й, ацетон - 0,5%-й, вольфрамат, сульфат, нитрит натрия - 1%-ые, сульфат цинка, сульфат аммония - 0,1%-ые, мочевина и нейтрализованная трихлоруксусная кислота - 0,5%-ые. Фосфатные буферы в концентрации выше 0,1 М вызывают появление осадка. Не рекомендуется определение данным методом растительных объектов с высоким содержанием фенолов и флавоноидов, т.к. они образуют аналогичную окраску с реактивом. Для удаления фенольных соединений необходима обработка материала охлажденным ацетоном. [c.370]

Наиболее часто цитируемая работа в биохимической литературе —это работа Лоури, Розеброу, Фарра и Рэндалла [171], в которой был описан новый метод определения белков. Было обнаружено, что при сочетании биуретовой реакции и реакции с применением реактива Фолина—Чиокалто [172] белки, содержащие тирозин, дают интенсивную темио-синюю окраску. В оригинальной работе приведены концентрации реактивов для получения идеальных результатов. С тех пор появилось множество модификаций этого метода, в которых в основном сделаны попытки устранить влияние некоторых специфических веществ. [c.311]