НАД НАДН-связывание

Значительные трудности встретились при определении соотношения металл — белок в алкогольдегидрогеназе из печени. Имеются сообщения, что этот фермент содержит либо 2 г-атома [97], либо 4 г-атома [107, 108] цинка на 1 моль фермента. Алкогольдегидрогеназа из печени содержит два центра связывания НАДН [109, 110], в то время как фермент из дрожжей содержит четыре центра связывания этого кофермента [Ш]. Недавно обширные исследования [91] пролили свет на эту путаницу в отношении стехиометрии соотношения цинк — белок и было однозначно показано, что содержание цинка в алкогольдегидрогеназе из дрожжей составляет 4 г-атома/моль фермента, однако два из этих атомов цинка играют в большей степени структурную, чем каталитическую роль [91, 107]. Однако при проверке этого вывода изучением связи между содержанием цинка и каталитической активностью были получены противоречивые данные [91, 108]. Эти разногласия не могут быть связаны с разными образцами ферментов, так как изоферменты алкогольдегидрогеназы дрожжей содержат одинаковое количество цинка [ИЗ]. [c.458]

Определение НАД" " основано на специфической реакции восстановления кофермента алкогольдегидрогеназой в присутствии субстрата — этанола. Реакцию смещают в сторону образования ацеталь-дегида связыванием последнего семикарбазидом. О количестве образованного в реакции НАДН судят по нарастанию поглощения при 340 нм. В кювету спектрофотометра помещают 1,0 мл нейтрализованного центрифугата, 1,0 мл 0,05 М фосфатного буфера, 0,3 мл 0,1 М раствора семикарбазида, 0,1 мл этанола и до 2,95 мл воды. Снимают исходные показатели оптической плотности опытной пробы против [c.122]

НАД-зависимые дегидрогеназы представляют собой довольно обширный класс ферментов, важной особенностью строения которых является наличие четвертичной структуры. Нативная молекула НАД-зависимых дегидрогеназ состоит из нескольких (от двух до восьми) идентичных субъединиц, причем каждая из них формирует свой собственный активный центр. При исследовании таких ферментов.возникает естественный вопрос — зачем же нужна олигомерная структура, если активный центр образуется без ее участия Одна из функций четвертичной структуры — стабилизация белковой глобулы за счет образования общего гидрофобного яд ра — была известна достаточно давно и не вызывала сомнений (например [1]). В отношении же роли ассоциации субъединиц в катализе и регуляции ферментативной активности долгое время сохранялись весьма неопределенные представления. С одной стороны, в каждой субъединице олигомера дегидрогеназ были все предпосылки для осуществления каталитического акта, а с другой — при проведении опытов в растворе накапливалось все большее количество данных об отсутствии активности у мономерных форм и о необходимости их ассоциации для появления активной молекулы фермента [2, 3]. Эти данные, а также факт существования кооперативных взаимодействий между субъединицами (что характерно для большинства дегидрогеназ) позволили ряду исследователей предложить следующую концепцию катализ возможен только при объединении нескольких субъединиц, поскольку для полного протекания реакции в активном центре одной субъединицы необходимы определенные изменения в сопряженном с ним активном центре другой субъединицы. Например, в случае глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.12) фосфоролиз ацилфермента с образованием продукта реакции (а возможно, и отщепление НАДН) в активном центре одной субъединицы происходит только при связывании субстрата в соседней субъединице [c.80]

АМФ, АДФ-рибоза и НАДН в сочетании с субстратами сильно тормозят обмен цинка в алкогольдегидрогеназе печени лошади, в то время как N-метилникотинамид, один или в присутствии субстрата, был совершенно неактивен [101]. Никотинамидная группа имеет важное значение для связывания алкогольдегидрогеназой АДФ-рибоза связывается примерно в 50 раз слабее, чем НАДН [140]. [c.57]

Для объяснения связывания было высказано предположение о том, что в случае как НАД, так и НАДН аденозин дифосфатный фрагмент молекулы динуклеотида зани- [c.58]

Определение величины Км в реакциях, катализируемых алкогольдегидрогеназой дрожжей, показало, что сродство фермента к НАДН больше, чем к НАД. Наличие конкуренции между НАД и НАДН свидетельствует о том, что участок связывания этих форм один и тот же [155, 156]. [c.60]

В настоящей работе предлагается изучить кинетику торможения НАДН-оксидоредуктазной активности препарата Кейлина—Хартри ро-теноном и определить кинетические и термодинамические параметры связывания ингибитора с ферментом. Реакция окисления НАДН кис--лородом сопровождается поглощением стехиометрического протона и может быть измерена с помощью регистрирующего рН-метра. [c.441]

Еще одним механизмом связывания аммиака является восстановительное аминирование а-кетоглутарата, т. е. в реакции, обратной окислительному дезаминированию глутамата, которая катализируется глутаматдегидрогеназой донором восстановительных эквивалентов в этой реакции является восстановленная форма кофермента НАДН или НАДФН. [c.390]

Лактат-дегидрогеназа катализирует превращение пи-рувата в лактат в присутствии кофермента никотинами-дадениндинуклеотида (НАДН). Скорость реакции определяют по исчезновению НАДН. Ингибирующее действие металлов на эту реакцию, обусловленное связыванием 5Н-групп фермента, уменьшается в ряду Hg> u>Zn> l. Логарифмы условных констант ингибирования равны соответственно 6,70 4,04 2,58 2,34. [c.135]

В соответствии с последовательным механизмом (9) любой ингибитор, реагирующий со свободным ферментом (Е), должен проявлять себя как конкурентный по отнощению к НАД+(НАДН) и не являться конкурентным по отношению к субстратам [60]. Конкурирующее поведение по отношению к НАД+ или НАДН подразу мевает конкуренцию на тех же участках фермента, но не обяза тельно на тех же активных центрах. Во-вторых, аналоги 1,10-фе нантролина, например 1,5-фенантролин, 5,6-(или 7,8)-бензохино ЛИН, не являющиеся хелатирующими агентами, тем не менее кон курентно ингибируют НАД+ и столь же или даже более активны чем 1,10-фенантролин [136]. Как 1,5-, так и 1,10-фенантролин да ют при взаимодействии с алкогольдегидрогеназой из дрожжей одинаковые дифференциальные спектры, однако только 1,10-фенантролин показывает такой же спектр при взаимодействии с [2п(Н20)4]2+ [136]. Центр связывания 1,10-фенантролина на алкогольдегидрогеназе определяют как место взаимодействия фермента с никотинамидным кольцом НАД+. Это устанавливается изучением взаимодействия между этим ингибитором и аналогами [c.461]

Хотя эти данные, по-видимому, свидетельствуют против широко признанной роли цинка в этой металлдегидрогеназе, т. е. против образования комплекса фермент — Zn + — НАД (НАДН) [121], они недостаточны для определения истинной каталитической роли этого металла. Результаты, полученные Милдваном и Винером [122, 141], могут быть интерпретированы в пользу образования комплексов фермент — Zn + — субстрат [8], хотя, учитывая имеющиеся данные, такая интерпретация является довольно рискованной. В этих исследованиях при использовании спин-меченого аналога АДФ-рибозы было определено расстояние между неспаренньш электроном спиновой метки и протонами субстрата [121]. Если бы Zn + в центре связывания металла можно было заменить на парамагнитный ион металла, то можно было бы методом ЭПР измерить степень спин-спинового взаимодействия и, таким образом, определить расстояние между спиновой меткой и связанным металлом [72, 74а] (разд. 2.2). Опубликовано сообщение о замене Zп + на Со + в алкогольдегидрогеназе из печени, и при этом Со +-фермент проявлял каталитическую активность [90]. Аналогичная замена Zn2+ на Мп + может непосредственно продемонстрировать наличие мостикового комплекса Е — М + — субстрат изучением скоростей ядерной магнитной релаксации протонов субстрата (разд. 2.3). Возможно использование ЯМР С1 для изучения влияния субстратов и коферментов на свойства связанного цинка в нативном ферменте [143]. Этот метод был использован для изучения связанного Zn2+ в нируваткиназе [144], и он является одним нз немногих методов изучения окружения диамагнитного атома цинка. [c.462]

В печени содержатся ферменты, при участии которых происходит фосфоролиз гликогена и дальнейшее превращение его по гли-колитическому пути. Этот процесс может протекать в гомогенате печени. При добавлении в инкубационную среду фтористого натрия из-за связывания ионов магния гликолиз останавливается на стадии образования 3-фосфоглицериновой кислоты, а в среде накапливается НАДН+Н" . Если гликолитические превращения происходят в атмосфере кислорода, образующийся НАДН+Н посредством челночного механизма передает электроны в митохондриальную цепь биологического окисления, где в результате окислительного фосфорилирования образуется АТФ из АДФ и Рн. Течение окислительного фосфорилирования обнаруживают по убыли Рн в инкубационной Среде. [c.135]

Известно, что изучение влияние ингибиторов на каталитическую активность ферментов является одним из методов, позволяющих исследовать их механизм действия. Ингибиторный метод был использован и ранее для исследования механизма пероксидазного окисления неорганических и органических соединений, катализируемого пероксидазой [Pettigrew et all., 1976]. Ингибиторы пероксидазы могут различными путями влиять на катализируемый ферментом окислительный процесс. Ионы цианида, фторида и азида подавляют каталитическую активность пероксидазы за счет образования прочных комплексов по шестому координационному положению железа гема, предотвращая реакцию с перекисью водорода. Ряд органических соединений ингибируют пероксидазу, реагируя с ее промежуточными Е, и Е соединениями. Некоторые из них, такие как аскорбиновая кислота, НАДН [Лебедева, Угарова, 1997], сахара [Saunders et. al., 1964], тиомочевина [Pettigrew et al., 1976], относятся к медленно окисляемым субстратам пероксидазы, ингибирующий эффект которых в реакции окисления о-дианизидина достигается за счет их прочного связывания в активном центре фермента. Некоторые вещества, реагируя с пероксидазой, инактивируют фермент. Так, необратимое инактивирующее действие фенилгидразина связано с модификацией функциональных групп пероксидазы (предположительно остатка триптофана) свободнорадикальными продуктами его некаталитического и каталитического окис- [c.125]

TOB приобретает сродство к индивидуальному участку связывания в активном центре фермента, которое условно можно обозначить согласно природе связывающихся субстратов. Один участок связывания о-дианизидина, а другой — гидрохинона (рис. 59). В о-ди-анизидиновом участке кроме о-дианизидина среди исследуемых нами субстратов могут связываться хлорпромазин, ИУК, триптофан, строфантин G, аскорбиновая кислота, НАДН, амид III, салицилат натрия, а в гидрохиноновом участке — ферроцианид калия, трифтазин, тиопроперазин, дигоксин. Причем субстраты, связывающиеся в одном участке, могут конкурировать межцу собой за участок связывания, что проявляется в дифференцированном их окислении. При этом избирательность обусловливается природой субстрата и его сродством к участку связывания, доступностью электроннотранспортных путей к гемину. [c.140]

В вопросе о конформации НАД и НАДН следует выделить две стороны (в порядке важности и сложности) 1) конформация НАД в растворе и 2) конформация НАД jp фермент-коферментном комплексе. Строгая ориентация в пространстве отдельных частей молекулы динуклеотида необходима для вполне определенного расположения нико- инамидного кольца относительно функциональных групп фермента, а также молекулы субстрата. Малейшее изменение углов валентных связей или межатомных расстояний в молекуле кофермента должно приводить к нарушению уникальной согласованности и эффективности каталитического процесса. Вследствие комплементарности молекулы кофермента участку связывания поверхности фермента (кофермент является слепком с участка связывания) изучение структуры НАД в фермент-коферментном комплексе дает непосредственную информацию о пространственном расположении функциональных групп активного центра фермента, взаимодействующих с коферментом. [c.21]

Алкилирование SH-групл лактатдегидрогеназы сердца свиньи с помощью малеимида сопровождалось падением ферментативной активности, причем вплоть до 97% инактивации полученное призводное фермента имело величину Км, практически не отличавшуюся от величины Км нативного фермента [75]. Полностью инактивированный фермент связывал НАДН и комплекс НАД-сульфит с такой же легкостью, как и нативный фермент. Все это позволяет говорить о том, что существенные SH-группы лактатдегидрогеназы не принимают участия в связывании кофермента. Защитный эффект НАДН в реакции алкилирования свидетельствует о нахождении SH-rpynn в непосредственной близости к коферментсвязывающему участку. [c.34]

Участие е-аминогруппы лизина фермента было предположено Kosower для объяснения эффекта Бойера — Теорел-ла — коротковолнового сдвига максимума в спектре поглощения НАДН при связывании алкогольдегидрогеназой печени Лошади [103, 104]. Д я этого фермента предполагается, что такой эффект может вызывать Е-аминогруппа лизина активного центра (рис. 6). Она образует водородные [c.40]

При исследовании производных пиридина, отличающихся природой заместителя в положении 3 оказалось, что с уменьшением электроотрицательности замещающей группы и, следовательно, с возрастанием легкости протонизации атома азота пиридинового кольца степень ингибирования увеличивалась. Kaplan наблюдал линейную зависимость величины Ki реакции ингибирования от рК ионизации атома азота [125]. N-Метилпроизводные пиридиновых оснований ингибировали алькогольдегидрогеназу дрожжей конкурентно по отношению к НАД. Это позволило сделать вывод о том, что в области связывания имеется анионный участок, взаимодействующий с положительно заряженным атомом азота никотинамидной компоненты НАД. Отсутствовала конкуренция N-метилникотинамида к НАДН. N-Me-тилдигидроникотинамид не ингибировал образование комплекса лактатдегидрогеназа-НАДН не менялась флюоресценция при 470 нм, характеризующая комплекс [52]. [c.54]

Идея о неполярной природе участка связывания кофермента, высказанная как на основании данных о сдвиге максимума в спектре поглощения НАДН в область более коротких длин волн при взаимодействии с дегидрогеназами, так и результатов, полученных при изучении аналогов НАД, нашла подтверждение в основном в работах [133—137]. Было показано, что К-алкилпроизводные никотинамида ингибируют алкогольдегидрогеназу дрожжей и глицерофос-фатдегидрогеназу конкурентно >по отношению к НАД и что степень ингибирования возрастает с увеличением длины углеводородной цепи алкильного заместителя [135]. Наблюдалась линейная зависимость величины 1/К) от числа [c.55]

Известно, что существует конкурентная взаимосвязь между НАД и НАДН. Это соответствует известному различию молекул окисленной и восстановленной форм НАД. Ответ на вопрос о том, какие области связывания являются общими и какие различными для НАД и НАДН в реакции окисления этанола, катализируемой алкогольдегидрогеназой дрожжей, был получен при исследовании взаимодействия НАДН-АМФ и НАДН-Ы-пентилникотинамид (табл. 3). [c.58]

Для первой пары величина а стремится к оо, что свидетельствует в пользу исключения НАДН при связывании АМФ. В то же время Ы-алкилникотинамид и НАДН связываются одновременно. По-видимому, пиридиниевый участок НАД-связывающей области не принимает участия в связывании НАДН, общим является адениновый участок. [c.58]

Оказалось, что при связывании аналога ЭПР-сигнал заметно уширяется, а скорость продольной релаксации воды возрастает. В алкогольдегидрогеназе печени лошади титровались с помощью аналога 2-го участка на поверхности фермента с константной диссоциации комплекса Кд= 17+8 мкМ и 5—6 участков с Кд = 9 мкМ. Константа диссоциации НАДН из комплекса с ферментом, определенная при титровании, составила 5-10 М, что значительно превышает величину, найденную ранее методом флюориметрического Титрования—-2,0 10 М [165]. [c.61]

Дополнительные подтверждения упорядоченного присоединения кофермента и субстрата для НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ могут быть получены на основе измерения скоростей взаимного превращения восстановленных и окисленных форм субстрата и кофермента для системы, находящейся в равновесии, с помощью введения меченых реагентов [15—19]. В работе [20] изучили таким путем скорости взаимопревращений НАД НАДН и окса-лоацетат малат для находящейся в равновесии реакции, катализируемой малатдегидрогеназой из митохондрий сердца свиньи. С одновременным увеличением концентраций малата и оксалоацетата при сохранении постоянства отношения концентраций этих реагентов скорость их взаимного превращения при pH 8,0 (рис. 16) непрерывно растет, в то время как скорость взаимного превращения НАД и НАДН проходит через максимум и уменьшается практически до нуля. С увеличением концентраций субстратов растет доля тройных комплексов, и падение скорости обмена НАД НАДН означает, что выход НАД или НАДН из тройного комплтекса невозможен. Эти данные указывают на упорядоченное связывание кофермента и субстрата. Однако при pH 9,0 (рис. 17) скорость обмена НАДч НАДН при больших концентрациях малата приближается к предельной величине, заметно отличающейся от нуля, что свидетельствует в пользу частично упорядоченного механизма. Таким образом, несмотря на большую распространенность, [c.89]

Из новых методов, позволяющих получить дополнительную ценную информацию, следует прежде всего отметить методы изучения быстрых химических процессов, например метод остановленной струи [21, 22]. Хорошей иллюстрацией возможностей этого метода могут служить данные, полученные для ЛДГ из сердца свиньи [23—26]. При связывании НАДН с ЛДГ происходит смещение максимума НАДН в коротковолновую область, что приводит к снижению экстинкции при 365 нм [24]. Это позволяет проследить за образованием и распадом комплекса ЛДГ-НАДН спектрофотометрическим методом. Ои11геип(1 изучал с помощью метода остановленной струи кинетику вытеснения НАДН из комплекса с ЛДГ окисленной формой никотинамидаденин-динуклеотида. Одна из типичных кинетических кривых представлена на рис. 18 [25]. Изменение оптического поглощения при 365 нм соответствует распаду комплекса ЛДГ-НАДН. С увеличением концентрации НАД скорость распада комплекса ЛДГ-НАДН приближается к предельной величине, соответствующей константе " скорости распада этого комплекса. При pH 8,5 она равна 100 сек. и точно соответствует максимальной скорости ферментативного превращения лактата в пируват, деленной на общую концентрацию фермента [24]. Следовательно, при этом значении pH лимитирующей стадией ферментативного процесса является диссоциация комплекса ЛДГ-НАДН. При меньших значениях pH максимальная скорость становится меньше константы скорости распада этого бинарного комплекса и, следовательно, лимитирующей становится какая-то другая стадия. [c.91]

Изменения размеров молекулы цитрат-синтазы из A i-netoba ter iwoffi при связывании аллостерического ингибитора— НАДН были обнаружены с помощью электронной микроскопии [82]. [c.106]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология