РНК расщепление секвенирование

Наряду с химическим расщеплением секвенирование РНК можно проводить путем гидролиза ее цепи специфическими РНК-азами. [c.20]

Рис. 75. Схема твердофазного секвенирования полипептида на примере фрагмента, полученного расщеплением бромцианом. Зачерненный, ква.драт - полимерный носитель ,

Участки ДНК, по которым происходит расщепление той или иной рестрикта-зой, называют сайтами рестрикции. Поскольку эндонуклеазы рестрикции используются не только для подготовки ДНК к секвенированию, но и для других целей, в частности для генной инженерии (см. 7.11), распределение сайтов рестрикции вдоль молекулы ДНК является важной характеристикой ДНК. Установление взаимного расположения этих сайтов называют физическим картированием ДНК, а саму схему такого распределения — физической картой ДНК. [c.276]

Чтобы расшифровать нуклеотидную последовательность целой молекулы ДНК, сначала ее фрагментируют с помощью рестриктирующей эндонуклеазы. Затем каждый из образовавшихся фрагментов секвенируют по отдельности по схеме, приведенной на рис. 1. Во второй аликвоте исходную ДНК расщепляют в других местах, используя другую рестриктирующую эндонуклеазу, и получают второй набор фрагментов. После того как секвенирование всех фрагментов второго набора завершено, сравнение двух наборов дает возможность найти участки перекрывания, необходимые для сборки фрагментов первого набора в правильном порядке. В результате может быть установлена нуклеотидная последовательность интересующей нас природной ДНК. Иногда, для того чтобы устранить неясности в некоторых участках последовательности, оставшиеся после первых двух расщеплений, приходится анализировать третий или четвертый наборы фрагментов. [c.889]

Последние данные изучения структуры генов и генных продуктов вирусов гриппа, а также информация, полученная при использовании моноклональных антител, позволили получить несколько важных сведений о поведении этого вируса. Например, ясно, что антигенный шифт не происходит вследствие прямой мутации одного подтипа в другой, в то время как антигенный дрейф осуществляется в результате точечных мутаций в генах. Однако частота мутаций поверхностных белков не превышает существенно соответствующую величину для внутренних белков. НА имеет по крайней мере четыре различающихся антигенных сайта, которые могут варьировать независимо, с патогенностью, зависящей частично от последовательности в НА, где происходит расщепление. Некоторые сегменты РНК имеют перекрывающиеся гены, использующие две рамки считывания. Результаты секвенирования подтверждают антигенную классификацию подтипов НА и NA. [c.155]

Остатки цистина могут образовывать как внутри-, так и межцепочечные связи. Поэтому при секвенировании обязательным этапом является расщепление дисульфидных связей в первую очередь с целью разделения полипептидных цепей. В то же время дисульфидные связи имеют высокую реакционную способность, и это обстоятельство может вызвать осложнение при структурном анализе. Поэтому при расщеплении 5—5-групп остатки цистеина необходимо перевести в стабильные производные. Наконец, после восстановления остатков цистеина белки становятся более доступными действию протеолитических ферментов. Способы расщепления дисульфидных связей рассматриваются в гл. 4. По этому вопросу имеется также ряд обзоров [26, 59, 98, 116]. В настоящую главу включены только те методики, которые нашли практическое применение. [c.83]

Метод селективного расщепления пептидных связей остатка триптофана основан на высокой реакционной способности ин-дольного ядра. При этом благодаря низкому содержанию в белках триптофана должны образоваться несколько крупных фрагментов, удобных для секвенирования. Однако, несмотря на то что за годы поисков были найдены подходящие реагенты и методики, лишь немногие из них нашли практическое применение [47, 181]. Далее подробно рассматриваются наиболее полезные и часто применяемые на практике методики. Относительно остальных методов расщепления по триптофану будут сделаны лишь короткие комментарии. [c.101]

Расщепление полипептида на фрагменты, пригодные для автоматического секвенирования [c.38]

Секвенирование Р-концевых меченых РНК частичным расщеплением нуклеазой. ........105 [c.6]

Существует два принципиально различных подхода к определению нуклеотидной последовательности ДНК. Первый из них предложен А. Максамом и У. Гилбертом и основан на специфическом химическом расщеплении полинуклеотидной цепи. Последовательность операций при секвенировании ДНК методом Максама — [c.15]

Рис. 5. Расщепление рестриктазами крупного сегмента гена Р-цепи глобина кролика с образованием перекрывающихся фрагментов Секвенированне фрагмента 4, получаемого совместным действием рестриктаз Нае III К Нра 1. позволяет однозначно расположить друг относктельно Друга фрагменты I Н 2

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

Среди структурных белков особое место занимают кератины, поскольку они были первыми белками, изученными Астбюри метолом диффракции рентгеновских лучей. Их нерастворимость и биохимическая инертность не способствовали, однако, достаточному уровню активности исследований. Кератины образуют защищающие от внешней среды барьеры типа рогов, копыт, когтей, волос, шерсти и перьев. В перьях содержатся р-структуры, в то время как для волос и шерсти характерны а-спиральные структуры. Последние состоят из белков с низким содержанием серы эти микрофибриллы окружены матрицей двух других типов, одной с высоким содержанием глицина и тирозина, а другой—с высоким йроцентом серы. Во время синтеза прокератина в эпителиальных клетках в богатых серой белках имеются большие количества тиольных групп, образующих впоследствии дисульфидные связи, делающие кератин более жестким. Потерю волосами механической прочности при их обработке отбеливающими или восстанавливающими агентами (завивка-перманент) можно частично объяснить за счет расщепления дисульфидных связей. Восстановление и карбо-ксиметилирование дисульфидных связей (см. разд. 23.3.3) сделали возможным солюбилизацию и фракционирование некоторых компонентов кератина для последующего секвенирования [29]. В одном [c.572]

Фрагмент Кленова (Klenov fragment) Более крупный из двух фрагментов ДНК-полимеразы I Е.соИ, образующийся при ее протеолитическом расщеплении. Сохраняет полимеразную активность в направлении 5 —>3 и экзонуклеазную — в направлении 3 ->5. Используется, в частности, при секвенировании ДНК, [c.563]

Если провести серию гидролитических расщеплений исследуемого пептида или белка с применением различных ферментов, получается несколько наборов коротких пептидов (так называемых триптических пептидов), последовательность каждого из которых легко устанавливается секвенированием по Эдману. Далее сопоставление последовательностей триптиче-СК11Х пептидов и выявление перекрывающихся фрагментов позволяют реконструировать первичную структуру пептида или белка. [c.59]

Метод расщепления, используемый при секвенировании по Максаму — Гилберту, основан на реакции расщепления полидезоксирибонуклеотидной цепи по остаткам, лишенным гетероцикла, т.е. по апуриновым или апиримидивовым фрагментам. Это расщепление проходит в присутствии оснований по схеме [c.279]

Модификация метода секвенирования ДНК, представленная на рис. 4-66 и 4-67, может быть использована для выявления в ДНК последовательностей, опознаваемых ДНК-связывающими белками. Связывание этих белков с регуляторными участками ДНК (которые обычно локализованы вне кодирующих участков генов), по-видимому, играет важную роль в определении того - какие именно гены активны в данном типе клеток. Понимание функции этих белков чрезвычайно важно для идентификации специфических последовательностей, с которыми они связываются. Для выявления таких последовательностей обычно используют метод, именуемый ДНК-футпринтинг. Сперва очищенный фрагмент ДНК метят по одному концу Р и затем расщепляют с помощью нуклеазы или химического соединения, делающего случайные разрезы в двойной спирали ДНК. Фрагменты, которые образуются из меченой цепи, разделяют на геле и выявляют на радиоавтографе после этого сравнивают расположение полос ДНК. образуемых в присутствии и в отсутствие ДНК-связываюших белков. Если связывание произошло, нуклеотиды в сайте расщепления оказываются защищен- [c.235]

МО иметь большое количество идентичных молекул ДНК. Наработку интересующей последовательности можно осушествить клонированием соответствующего фрагмента. Проиллюстрированный на рис. 36.6 метод секвенирования по Максаму-Гилберту основан на химическом расщеплении ДНК по определенному основанию. Другой ферментативный метод—метод Сэнгера—базируется на применении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез комплементарной цепи ДНК по одноцепочечной матрице в месте встраивания в цепь соответствующего аналога. [c.44]

Как правило, первичную структуру белка не удается установить путем последовательного секвенирования всей полипептидной цепи. Для этого приходится анализировать фрагменты, полученные избирательным расщеплением полипептидной цепи химическим или ферментативным методом. Следователыю, стадия фрагментации полипептидной цепи па низкомолекулярные пептиды с целью последующего структурного анализа — это один из важнейших этапов в определении ковалентно (первичной) структуры белка. [c.82]

N-ацилирование проводят в присутствии большого избытка уксусного или муравьиного ангидрида. Для последующего секвенирования пептидных фрагментов необходимо провести гидролиз ацильных групп. Формильную защиту снимают кратковременной обработкой НС1 в метаноле при комнатной температуре, более устойчивые ацетильные группы отщепляют 0,01 М КОН. Из других методов расщепления 0-пептидных связей следует упомянуть реакцию с гидроксиламином или гидразином с образованием гидроксамовых кислот или гидра-зидов N-концевых партнеров гидроксиаминокислот (серина и треонина) для этих целей применяли также 1М пиперидин [64]. Относительно определения ацетильных и формильных групп см. разд. 8.13. [c.94]

Реакция с бромоцианом находит и иное нримененне. Пептидные фрагменты, полученные при расщеплении бромоцианом и несущие С-концевой гомосеринлактон, можно вводить в реакцию конденсации (с высоким выходом) с аминогруппами полимеров (34- 36). Этот метод позволяет избирательно фиксировать фрагменты через С-концевой аминокислотный остаток на нерастворимом носителе с целью твердофазного секвенирования [86]. [c.100]

Следует иметь в виду, что расщепление пептидной связи тирозина окислительным галогенированием обычно проводят в 50—80%-ной уксусной (или муравьиной) кислоте при комнатной температуре в течение нескольких часов по аналогии с расщеплением бромоцианом (разд. 2.4.1). Это довольно жесткие условия, при которых возможны побочные реакции, такие, как дезамидирование или расщепление лабильных пептидных связей (Asp-Pro). Фрагменты с С-концевым диоксоиндолилспи-ролактоном фиксируют ковалентно через 3-аминопропильную группу макропористого стекла с целью твердофазного секвенирования по Эдману [197]. [c.107]

Широкому применению метода расщепления по цистеину с целью получения крупных фрагментов препятствует то обстоятельство, что С-концевой фрагмент блокирован по аминогруппе остатком иминотиазолидина. Попытки деблокирования с помощью классического секвенирования по Эдману дали отрицательный результат [96]. Таким образом, полученные пептиды, за исключением N-концевого, не могут быть использованы для прямого секвенирования. Недавно предложен метод модификации указанных пептидов на никеле Ренея [133]. После обработки защищенных пептидов активным (нейтральным) катализатором W-6 в нейтральной среде при 50 °С в течение [c.121]

Специфичность. Гидролиз тромбином проходит по С-концевой пептидной связи остатков аргинина типа -Arg-X-. В нативном субстрате фибриногене этой связью является -Arg-Gly-, в других белках в качестве остатка X может быть аланин, aprii-нин, аспарагиновая кислота, цистеин, валин [64]. Наблюдаетс51 также гидролиз по связи -Arg-His- в кальмодулине [108]. Обработка тромбином приводит к расщеплению только очень ограниченного числа пептидных связей аргинина, и, следовательно, этот метод можно считать идеальным для получения крупных фрагментов белка, предназначенных для автоматического секвенирования. В некоторых случаях тромбин даже в жестких условиях гидролизует в белке только одну пептидную связь, в других случаях степень гидролиза зависит от продолжительности ])еакции и температуры. Соответствующие примеры приведены в работе [106]. [c.150]

К высокоспецифическим методам относятся расщепление по остаткам цистеина с помощью 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислоты (НТБК) [25]. Эффективность этого метода была продемонстрирована на примере антигенов гистосовместимости, когда с помощью этой методики сравнивались последовательно расположенные дисульфидные петли [15]. Размеры дисульфидных циклов определяли по длине полученных фрагментов. Метод может найти применение при выявлении структурной гомологии родственных белков. К сожалению, образующиеся фрагменты имеют на N-конце тиазолидиновые циклы и не могут быть секвенированы непосредственно. Имеются данные, что деблокирование можно проводить на никеле Ренея [32] (гл. 2). При этом остатки цистина превращаются в аланин, остатки метионина— в -аминомасляную кислоту, становится возможным секвенирование. [c.177]

Оптимальными, на наш взгляд, являются РНК-зонды и соответственно исследуемые на однонуклеотидные замены участки ДНК длиной от 100 до 1000 нуклеотидов. В этом случае и сам зонд, и продукты его расщепления легко выявляются при помощи денатурирующего гель-электрофореза в полиакриламидном геле, аналогичном используемому при секвенировании ДНК. При этом отношение сигнала к фону достаточно высоко для получения четких результатов. Совсем нетрудно наработать меченые одноцепочечные РНК-зонды гораздо большей длины, но результаты обработки таких длинных цепей РНКазой неоднозначны. Еще одна проблема, которая возникает при использовании зондов с длиной цепи более 1000 п. н., заключается в том, что под действием РНКазы наряду с расщеплением РНК—ДНК-дуплексов по неспаренным участкам может происходить (хотя и редко) расщепление цепи РНК по комплементарно спаренным участкам дуплекса. Кроме того, анализ продуктов расщепления длинных РНК-зондов (>-1000 п.н.) требует проведения денатурирующе- [c.127]

Если при амплификации геномной ДНК позвоночных в качестве праймеров для ПЦР используют олигонуклеотиды длиной 20 нуклеотидов и более, то процесс этот довольно специфичен и амплифицируется только один фрагмент ДНК- Однако иногда среди продуктов реакции наблюдается накопление фрагментов, происхождение которых трудно объяснить. А поскольку эти фрагменты могут мешать последующему анализу (РНКазному расщеплению, ДГГЭ, секвенированию), то рекомендуется провести еще одну серию амплификаций, с использованием другого набора олигонуклеотидных праймеров. Этот метод, именуемый nested oligo [22], состоит в следующем продукт первичной полимеразной цепной реакции используется в качестве матрицы в последующих раундах ПЦР, но уже с двумя другими олигонуклеотидами, имеющими гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифицированного фрагмента (рис. 6, Б). Такая процедура позволяет получить большое количество индивидуальной последовательности ДНК, несколько более короткой, чем исходный фрагмент, и использовать ее для последующего анализа. [c.139]

Приборы для автоматического секвенирования (секвенаторы) работают наиболее эффективно, когда длина полипептидов составляет 20 0 остатков. Эти требования в значительной мере способствовали разработке методов расщепления полипептидов на фрагменты нужного размера и их очистки. Основной задачей стало не получение большого числа малых фрагментов, пригодных для ручного секвенирования, а расщепление на малое число крупных фрагментов (от 30 до 100 остатков). При этом желательно было осуществить полное высокоспецифичное расщепление по ограниченному числу связей. Этим требованиям отвечает расщепление цианогенброми-дом (СЫВг), трипсином и о-иодозобензолом. [c.38]

Максам и Гильберт использовали для секвенирования меченные по 5 -концам радиоактивным фосфором одинарные нити денатурированных фрагментов ДНК [Махат, Gilbert, 1977]. Были разработаны химические методы расщепления полидезоксирибо-нуклеотидов по заранее известным нуклеотидам. Концентрации реагентов и условия гидролиза подобрали так, что подавляющее большинство индивидуальных нитей случайным образом разрывалось только в одном из множества возможных мест. Все эти места равноправны. В результате при каждом методе обработки огромного множества нитей получали полный набор всех возмож- [c.131]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология