Белки изоэлектрофокусирование

Ионообменная хроматография для фракционирования смеси белков используется значительно реже, чем для их очистки. Большие молекулярные массы обусловливают замедленную диффузию белков в жидких фазах и в связи с этим — невысокую разрешающую способность метода. Для смеси небольшого числа относительно некрупных белков ионообменное фракционирование еще себя оправдывает, однако в более сложных ситуациях оно явно уступает электрофорезу и изоэлектрофокусированию. Приведем несколько примеров фракционирования белков методом ионообменной хроматографии в более или менее благоприятных ситуациях. [c.309]

Определение гомогенности выделенного белка кристаллизация (у чистого белка кристаллы одного типа) кривые растворимости (у чистого белка один перелом кривой растворимости) аналитическое ультрацентрифугирование (чистый белок дает один узкий пик) электрофорез в ПААГ, изоэлектрофокусирование (чистый белок дает одну полосу) иммунохимический (чистый белок дает одну полосу преципитации со смесью антител). [c.52]

Рис. 19. Схема изоэлектрофокусирования на ПАГ-пластинке белков с пероксидазной активностью, выделенных из растений табака, зараженных ВТМ, после хроматографирования на ДЭАЭ-сефадексе А-50

Поскольку все указанные методы можно сочетать друг с другом, число возможных вариантов двухмерного электрофореза огромно. На практике же число этих комбинаций несколько ограниченно, так как изоэлектрофокусирование применяют только в первом направлении (отчасти это обусловлено высокой стоимостью амфолитов-носителей), а ДСН-содержащие гели —только на второй стадии электрофореза из-за трудностей, связанных с удалением ДСН из комплексов с белками. В зависимости от изменений, вводимых при электрофорезе во втором направлении,, можно выделить следующие типы двухмерного электрофореза [c.229]

Описанные в настоящей главе методы можно использовать для обнаружения, а в некоторых случаях и для количественного определения белков после их разделения с помощью электрофореза в средах, содержащих обычные буферные растворы. В присутствии высоких концентраций таких добавочных агентов, как ДСН или мочевина, следует уделять особое внимание правильной фиксации белков. Амфолиты-носители, применяемые при изоэлектрофокусировании, создают дополнительные трудности, так как образуют со многими белковыми красителями нерастворимые комплексы. Поэтому при наличии в растворах указанных добавок необходимо применять модифицированные методы окрашивания. Некоторые примеры окрашивания белков после электрофореза в присутствии ДСН или амфолитов-носителей приведены в главах, посвященных соответствующим методам разделения. [c.278]

При обнаружении ферментов после электрофореза, как и в любой ферментативной реакции, важную роль играет pH среды. Этот фактор имеет особенно большое значение тогда, когда электрофорез проводят при значении pH, сильно отличающемся от оптимума pH для данной ферментативной реакции, а также при разделении белков путем изоэлектрофокусирования в неоднородной буферной системе с разными значениями pH. В этих случаях перед определением активности фермента гели инкубируют в охлажденном буфере с соответствующим значением pH. [c.281]

Выбор ионообменника зависит от свойств исследуемых белков. Обычно хроматографию проводят в том буфере, при котором целевые компоненты смеси предельно различаются по величине суммарного заряда. При выборе рабочего диапазона pH можно руководствоваться результатами электрофореза или изоэлектрофокусирования (т. е. изоточками компонентов смеси) (разд. 1.3.2.4). При отрицательном суммарном заряде хроматографию проводят на анионите, при положительном суммарном заряде — на катионите. Выбору оптимальных условий ионообменного разделения должна предшествовать предварительная оценка свойств разделяемой смеси с помощью простых тестов. [c.40]

Фиксация и высушивание. После изоэлектрофокусирования белки в гелях фиксируют погружением на 10 мин в раствор 10%-ная трихлоруксусная кислота—1%-ная сульфосалициловая кислота. Промывают 10 мин 95%-ным этанолом. Сушат в потоке теплого воздуха. [c.308]

Аппарат со вставленной, как описано выше, стойкой с гелями подсоединяют к источнику тока при постоянном напряжении 200 В на 1 ч. В течение этого времени устанавливается градиент pH (рис. 11-10). Если этот этап опустить, то не исключено выпадение в осадок белка в верхней части геля. Последующее медленное растворение выпавшего в осадок белка в ходе изоэлектрофокусирования может привести к искривлению полос. [c.207]

При слишком длительном изоэлектрофокусировании наблюдается неудовлетворительное разделение белков на щелочном конце геля. Причиной этого является нестабильность градиента [c.214]

Коллективная монография, написанная ведущими специалистами, работавшими в Базельском институте иммунологии (Швейцария), посвящена методам иммунохимии и клеточной иммунологии. Авторы имеют большой опыт в этой области, что определяет основные достоинства книги — удачный подбор методов и исчерпывающее, но вместе с тем краткое описание каждого из них. Рассмотрены определение активности антител, их анализ методом пептидных карт, исследование белков методами электрофореза, изоэлектрофокусирования и изотахофореза, методы иммунофлуоресценции, культивирования лимфоцитов, изотопные и другие методы. [c.4]

Использование метода электрофореза в полиакриламидном геле для анализа и разделения сложных смесей белков и нуклеиновых кислот значительно расширило наши знания о многих клеточных и вирусных системах. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет ряд преимуществ перед другими аналитическими методами он отличается простотой в исполнении, хорошей воспроизводимостью результатов и не требует сложного оборудования. В комбинации с двумерным разделением и изоэлектрофокусированием он может быть использован не только для аналитических, но и для препаративных целей. [c.118]

ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ, метод разделения и анализа амфотерных в-в, гл. обр. белков, в электрич. поле в среде с изменяющимся в определ. направлении pH. В-ва при зтом смещаются к катоду или аноду до тех пор, пока каждое из них не достигнет зоны, pH к-рой совпадает с его изоэлектрич. точкой, и не сконцентрируется в ней ( фокусирование ). Градиент pH создают, помещая в электрич. поле смесь амфолитов с широким набором изоэлектрич. точек, напр, смесь полиаминов, замещенных в разл. степени карбоксиалкильными группами (т. н. амфолинов). Для стабилизации градиента разделение проводят в вертикальных колонках с градиентом плотности, наполненных сахарозой или глицерином, либо в слоях гелей (полиакриламида, се-фадексов). Метод обладает высоким разрешением и примен. для выделения и очистки от десятков миллиграммов до неск. граммов белков, идентификации (неск. мкг) и анализа их сложных смесей и т. д. [c.216]

Изоэлектрофокусирование — один из вариантов электрофоретического разделения макромолекул. Принцип метода состоит в следующем. Если на колонку, вдоль длины которой сформирован градиент pH, нанести образец белка, а потом подключить концы колонки к источнику тока, то молекулы белка будут двигаться по колонке до тех пор, пока не достигнут той области, где величина pH окажется равной величине изоэлектрической точки белка. Для создания градиента pH используются сложные смеси амфотерных соединений, по-разному обозначаемые фирмами-изготовителями (например, амфолины, фармалиты, сервали-ты и т. д.). Эти соединения обычно имеют небольшую молекулярную массу (400—800 Да) и получаются пууем химического синтеза. Общая формула некоторых типов амфолитов может быть представлена в виде [c.98]

При изоэлектрофокусировании белок можно наносить на любую точку предварительно сформированного градиента pH или формировать градиент pH в присутствии белка. В начальные периоды фокусирования электрический ток имеет достаточно большую величину. По мере фокусирования он уменьшается и к концу фокусирования достигает какой-то минимальной величины. Охлаждение обеспечивает получение более четких и узких зон белка. Увеличение времени электрофо-жусирования не сопровождается размыванием белковых зон. [c.99]

В последние годы широкое распространение для фракционирования белков получили различные сочетания изоэлектрофокусирования и диск-электрофореза в полиакриламидном геле —методы двухмерного электрофореза, которые позоляют параллельно анализировать сотни и даже тысячи белковых фракций. [c.32]

В табл. 5.2-5.4 приведены примеры получения гомогенных по данным аналитического изоэлектрофокусирования и (или) электрофореза в полиакриламидном геле эндоглюканаз (см. табл. 5.2), целлобиогидролаз (см. табл. 5.3) и целлобиаз (см. табл. 5.4) из различных микробных источников. Как видно из представленных данных, во всех случаях для получения высокоочищенного фермента требуется 4-6 стадий. Помимо упомянутой выше близости множественных форм эндоглюканаз и других компонентов комплекса по биохимическим характеристикам, сложность и трудоемкость процесса получения очищенных целлюлаз связана с большим количеством примесей белкового (ксиланазы, ламинари-назы, пектиназы, протеиназы, другие белки и ферменты) и небелкового характера. Все это приводит к тому, что для ферментов из каждого, а нередко и из одного продуцента разрабатываются оригинальные схемы очистки. [c.121]

Интересно применение тонкослойной ГёЛь-хромаТо-графии белков в сочетании с техникой изоэлектрофокусирования [199]. [c.118]

Изоэлектрическое фокусирование обладает наивысшей разрешающей способностью, когда-либо достигавшейся при разделении белков цо зар5 дам [58—64, 92]. Этот метод позволяет разделить белки, велйчины р/ которых различаются всего на 0,01 ед. pH. Иногда Для такого разделения бывает достаточно различия между двумя структурами на одну заряженную группу. При помощи метода изоэлектрофокусирования можно также обнаружить другй различия в зарядах, которые, строго говоря, не связаны с макроскопической егомогенностью белков. Вот некоторые из факторов, обусловливающих такие различия посттрансляционная модификация первичной структуры (например, дезамидирование), связывание лигандов, химическая модификация, вариации в небелковых компонентах, например липидах, углеводах и других простетических группах, ассоциация и диссоциация, изменения окислительно-восстановительного состояния металлоферментов. Если при анализе картины изоэлектрофокусирования иметь в виду эти факторы, то полученные данные могут приобрести дополнительную ценность, поскольку в принципе они позволяют обнаружить микрогетерогенность белковых структур. В настоящее время метод изоэлектрического фокусирования применяют в сочетании с другими электрофоретическими методами, например в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, для получения двумерных карт разделяемых компонентов. В одном направлении производят разделение белков в соответствии со значениями их рД а в другом — в соответствии с размерами их молекул, т. е. в соответствии с их молекулярными массами. При помощи этих методов можно охарактеризовать смеси, содержащие тысячи белков [94]. Еще несколько лет тому назад разделение с таким высоким разрешением было просто немыслимо, а в настоящее время этот метод анализа находит все более широкое и все более успешное применение в различных биохимических исследованиях. [c.126]

Однако методом изоэлектрофокусирования на ПАГ-пластинках, содержащих амфолины в диапазоне pH 3,5—9,5, определено 14 белков с пероксидазной активностью (рис. 9). Из них три катионных с изоэлектрическими точками — 9,4 8,7 и 8,0 пять изоэнзимов нейтральных и слабокислых — 7,0 6,7 6,5 6,3 и 5,9 остальные — кислые анионные белки с изоэлектрическими точками — 5,3 5,0 4,5 4,2 4,0 и 3,8. Итак, в составе изопероксидаз растений дурмана преобладают в основном кислые изоэнзимы фермента. Три быстро движущихся изоэнзима содержатся в наибольшей концентрации. Именно для этих пероксидаз из зараженных ХтВК растений интенсивность окраски и скорость проявления с различными субстратами идут всегда быстрее, чем в контроле [Андреева, Омельченко, 1985]. [c.68]

Различия в количестве изопероксидаз, полученные методом электрофореза (рис. 8) и при изоэлектрофокусировании (рис. 9), очевидно, происходят от того, что при электрофорезе некоторые изоэнзимы движутся в электрическом поле вместе и занимают одинаковое положение. Факты эти в литературе описаны. При изоэлектрофокусировании амфолины, входящие в состав геля, способствуют более четкому разделению белковых препаратов, удерживая белки в их изоэлектрических точках. [c.68]

Таким образом, на основании проведенных исследований было показано, что изоэнзимы пероксидазы растений D. stramonium имеют молекулярную массу от 10 до 58 кДа. Методом изоэлектрофокусирования выявлено 14 зон с пероксидазной активностью, следовательно, в составе изопероксидаз, выявленных электрофорезом, присутствует более чем шесть белков. Остальные белки имеют сходный заряд и подвижность в гелях разной концентрации, и их масса укладывается в пределы, идентифицированные методом электрофореза. Различия в молекулярной массе изоэнзимов изучаемого фермента подтверждают его физико-хими-ческую гетерогенность. Выявленные 14 изоэнзимов с различными изоэлектрическими точками, лежащими в пределах pH 3,8—9,4, свидетельствуют о том, что в состав фермента растений D. stramonium входят пероксидазы с различным рН-оптимумом биохимического действия на субстраты. [c.70]

При выделении ферментных белков все этапы очистки должны сохранять фермент в неизменном, приближенном к нативному состоянии. Профиль элюции пероксидазы после разделения на G-100 представлен на рис. 12. В табл. 18 и 19 приведены данные поэтапной очистки и соотношение очищенных препаратов из здоровых и зараженных ВТМ растений табака сорта Ксанти нк. После гель-фильтрации методом изоэлектрофокусирования на ПАГ-пластинках было идентифицировано по 8 изопероксидаз для листьев как вирозных, так и контрольных растений табака. Изоэлектрические точки белков с пероксидазной активностью лежали в широком диапазоне pH — от 3,6, где фокусировался самый кислый изоэнзим, до 9,8 (точка фокусирования самого щелочного изоэнзима). [c.83]

Классические методы исследования мембранных белков, в том числе нейрорецепторов, включают практически все биохимические методы с учетом присутствия детергентов (электрофорез, изоэлектрофокусирование, гель-фильтрация, высокоэффективная жидкостная хроматография, аффинная хроматофа-фия и др.). Основным приемом специфического выделения ничтожно малых количеств нейрорецепторов является аффинная хроматография, которая позволила добиться впечатляющих успехов в изучении молекулярных свойств самых разнообразных типов нейрорецепторов. [c.268]

Кох и Бакс 689] сконструировали U-образный лрибор для изоэлектрофокусирования малых количеств белка в градиенте плотности. Этот лрибор (рис. 54) состоит из двух трубок, одна из которых покрыта для устранения электроэ ндоомоса попе- [c.134]

Для изотахофореза белков желательно испольэовать узкие трубки и проводить его в полиакриламидных гелях, не проявляющих по отношению к исследуемым веществам свойства молекулярного сита. Изотахофорез обладает почти таким же хорошим разрешением, как и диск-электрофорез или изоэлектрическое фокусирование. Изо-тахофореграммы белковых смесей очень похожи на картины изоэлектрофокусирования [1116], так как компоненты таких смесей в кислотной системе разделяются главным образом в результате различий в значениях их ИЭТ [501]. Преимущество же изо тахофореза заключается в том, что в отличие от изо- [c.175]

Хорошим примером, показывающим, какое высокое разрешение может быть достигнуто при комбинации ИЭФ с электрофорезом в ДСН-полиакриламидном геле, служит разделение суммарной смеси белков Е. oli на 1100 фракций 1[935]. При изоэлектрофокусировании было получено 70 зон. Если же белки фракционировали только с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН, то на электрофорепрам>ме обнаруживали 100 зон. Таким образом, в результате комбинации этих методов в двухмерной системе можно было бы разделить около 7000 компонентов. Но эта величина превышает максимально возможное число белков Е. oli (4000), рассчитанное на основании средней мол. массы белков и числа кодонов в ДНК данного организма. [c.232]

Pu . 81. Двухмерный электрофорез белков E. oli 5333 [935]. Первое направление— изоэлектрофокусирование (ИЭФ) в амфолинах с pH 5—7 второе направление-электрофорез в ДСН-содержашем полиакриламидном геле с градиентом концентрации геля 9—15%. Нанесено около 15 мкг белка (300000 имп./мин). Белки локализовали методом радиоавтографии. [c.233]

Фельгенхауэр [370] проводил иммунофиксацию белков после микроэлектрофореза в полиакриламидном геле. Гель помещали в небольшие сосудики, содержавшие 50—60 мкл антисыворотки. Преципитация происходила при 4°С в процессе встряхивания сосудиков. Преципитаты окрашивали после удаления непрореагировавшего белка путем промывания гелей. Крейг и Вайхер [716] предложили аналогичную методику для столбиков геля обычных размеров. Коттон и Мильштейн [249] разде-, ляли белки методом изоэлектрофокусирования на пластинах полиакриламидного геля. Затем электрофореграммы покрывали полосками фильтровальной бумаги (ватман № 3 ММ), пропитанными антисывороткой в соответствующем разведении. Гель вместе с полосками фильтровальной бумаги инкубировали в течение 24 ч при 37 °С во влажной атмосфере. После интенсивного промывания гель окрашивали. При разделении радиоактивных антигенов высушенные гели подвергали радиоавтографии. [c.246]

Если для разделения белков в первом направлении прибегают к изоэлектрофокусированию (перекрестное иммуноэлектрофокусирование), то возникает ряд проблем. Агароза является мало подходящей средой для ИЭФ, поскольку этот метод требует среды, в которой отсутствует электроосмос (см. разд. 1.12.2). Можно, конечно, использовать для ИЭФ полиакриламидный гель, а разделение во втором направлении проводить в агарозном геле, содержащем антитела. Однако, как будет видно из дальнейшего изложения, применение разных сред также имеет ряд недостатков. Один из возможных путей решения этой проблемы заключается в приготовлении агарозы, из которой получается гель почти с нулевым зарядом (см. разд. 1.9.2). В этом случае весь анализ (изоэлектрофокусирование и последующий электрофорез в геле, содержащем антитела) можно проводить в агарозном геле. Таким способом осуществляли перекрестное иммуноэлектрофокусирование Йохансон и йертен [631], а также Вейс и др. [1392]. Первые авторы проводили электрофорез во втором направлении при pH 8,2—8,6, так как в применяемой ими среде подвижность антител при этом pH была близка к нулю. [c.255]

Обнаружение с помощью кумасси белков и полипептидов после изоэлектрофокусирования [370]. Кумасси бриллиантовый голубой R250 не может быть использован в обычных условиях [c.304]

ДЛЯ обнаружения белков на ПААГ после изоэлектрофокусирования, поскольку носители-амфолиты (полиаминополикарбоно-вые кислоты) реагируют с красителем. Для преодоления этих ограничений было предложено использовать коллоидные суспензии кумасси К250 и 0250 в хлорной [311] и трихлороуксусной [26, 313] кислотах. Приведенная ниже методика дает хорошие результаты. [c.305]

Метод применим к ПААГ-системам, содержащим ДСН и 8 М мочевину. Полипептиды и белки (М 1665—68 000) с изоэлектрическими точками при pH 2,2—10,2 были разделены изоэлектрофокусированием в градиенте pH 3,5—10,5. Чувствительность обнаружения для тридекапептида а-меланостимулирующего гормона составила 20 мкг. [c.305]

В 34 главах изложены методы определения, выделения и очистки антител (включая дансилироваиие, двумерную хроматографию, изоэлектрофокусирование, электрофорез в полиакриламидном геле и изотахофорез) методы определения констант равновесия (равновесный диализ, равновесная фильтрация и седиментация) способы маркировки реагентов изотопами и флуоресцентными красителями и определение компонентов клеточной поверхности меры предосторожности при работе в изотопной лаборатории методы химической модификации белков, гаптенов и нерастворимых носителей приемы получения аитн-сывороток к аллотипам и антигенам гистосовместимости и получения антител доминирующего клонотипа методы оценки гистосовместимости и реакций в смешанной культуре лимфоцитов методы разделения клеток на гелях, несу- [c.7]

Другой метод окрашивания белков в полиакриламидном геле с помощью того же красителя в разведенной хлорной кислоте предложили Рейснер и сотр. (Reisner et al., 1975). Метод основан на том, что при связывании с белком краситель восстанавливает свой цвет, измененный в хлорной кислоте. Поскольку гель окрашивается в бледно-оранжевый цвет, а полосы белка — в интенсивно синий, при этом методе не требуется обесцвечивание. Кроме того, метод очень удобен для окрашивания гелей после изоэлектрофокусирования, так как краситель в хлорной кислоте не связывается амфолитами. [c.108]

ДСН благодаря своим превосходным солюбилизирующим свойствам очень часто оказывается наилучшим средством для диссоциации биологических комплексов. Однако после разделения комплексов белок-ДСН перед дальнейшим изучением полученных образцов (например, изоэлектрофокусированием или проведением серологических реакций) необходимо удалить детергент. Простого диализа может быть недостаточно для полного удаления связанного ДСН (Weber, Kuter, 1971). Однако описаны два метода, с помощью которых можно количественно отделить ДСН от белка. Освобождение ряда ферментов от ДСН ведет к их ренатурации и частичному восстановлению активности. [c.116]

Источником гомогенных антител чаще всего служат миеломы (Eisen et al, 1968). При аналитическом изоэлектрофокусировании (ИЭФ) такие антитела обычно дают от трех до пяти полос (Askonas et al., 1970). Имеются данные, что эта микрогетерогенность — следствие тех небольших модификаций, которые антитела претерпевают в момент секреции или (и) после выхода из антителообразующих клеток (Awdeh et al., 1970). Поэтому даже при работе с миеломными белками необходима дополнительная очистка антител. В этой главе будет рассмотрено применение препаративного ИЭФ для выделения кроличьего моноклонального IgG из материала поликлонального происхождения. [c.135]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология