Электрофорез изотахофорез

Электрофорез использует различия скорости и направления движения заряженных частиц в электростатическом поле. Направление движения зависит от знака заряда, скорость — от величины заряда и размеров частицы. Изотахофорез представляет собой разновидность электрофореза, развивающуюся в течение последнего десятилетия. [c.247]

Изотахофорез (вытеснительный электрофорез) применен для разделения смеси NHt, К+, Na+, Li+ и Fe(III) [606]. [c.52]

Это широкое определение охватывает также такие методы, которые обычно не относят к хроматографии, например фракционирование в поле тока и электрофорез. В то же время изотахофорез не подпадает под это определение. [c.8]

В зависимости от типа электролитических систем различают а) зонный электрофорез при постоянном значении pH, или просто электрофорез 48—57] б) изоэлектрическое фокусирование в градиенте pH [58—64] в) изотахофорез с ведущими и за- [c.111]

Электрофорез в гелях, и особенно в полиакриламидном геле, занимает сейчас ведущее положение среди методов разделения макромолекул. Поэтому оправдано то углубленное внимание, которое авторы уделили данному вопросу. Оно нашло выражение в детальном описании многих модификаций метода, рассмотрении преимуществ и недостатков различных гелей, а также в обсуждении возможных причин артефактов, возникающих иногда при электрофорезе этого типа. В первой части книги рассмотрены также теоретические и практические аспекты новых видов электрофореза — изоэлектрического фокусирования и изотахофореза, причем хорошо очерчены возможные области применения этих методов, их сильные и слабые стороны. Все это позволит читателю уверен-но выбрать тот вариант электрофореза, который поможет ему наиболее удачно решить поставленные задачи. [c.6]

Электромиграция третьего типа (стационарный, или вытесняющий, электрофорез) характеризуется тем, что через некоторое время после начала разделения зон устанавливается состояние равновесия, при котором ширина зон в дальнейшем не изменяется. К электрофорезу такого типа относятся два метода изоэлектрическое фокусирование (гл. 1.12) и изотахофорез (гл. 1.13). [c.15]

Преимущества и недостатки неоднородных буферных систем. Основное преимущество диск-электрофореза заключает- ся в концентрировании разделяемых веществ с образованием очень узких зон. Недостатком является то, что в процессе изотахофореза белки могут достигать такой высокой концентрации, что это вызывает их осаждение. Кроме того, некоторые белки нестабильны в зоне pH, используемой для их исследования методом диск-электрофореза. [c.88]

Изотахофорез можно также проводить на полосках из ацетата целлюлозы [1349] и сочетать с классическим электрофорезом в опытах по двухмерному разделению [1188, 1351, 1352]. [c.171]

Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН можно проводить как в однородных, так и неоднородных буферных системах [325, 756, 1171, 1379], в которых концентрирование белков происходит в результате изотахофореза [732, 922]. [c.225]

Коллективная монография, написанная ведущими специалистами, работавшими в Базельском институте иммунологии (Швейцария), посвящена методам иммунохимии и клеточной иммунологии. Авторы имеют большой опыт в этой области, что определяет основные достоинства книги — удачный подбор методов и исчерпывающее, но вместе с тем краткое описание каждого из них. Рассмотрены определение активности антител, их анализ методом пептидных карт, исследование белков методами электрофореза, изоэлектрофокусирования и изотахофореза, методы иммунофлуоресценции, культивирования лимфоцитов, изотопные и другие методы. [c.4]

Разделять смеси белков посредством электрофореза начали еще в первые годы XX в. Однако до сравнительно недавнего времени этот метод применялся лишь в аналитических целях. В течение 30 и более лет широко использовался довольно Сложный аппарат Тизелиуса для электрофореза в свободном растворе, однако с его помощью не всегда удавалось добиться полного разделения компонентов. И до сих пор остается справедливым утверждение, что электрофорез — это в основном аналитический метод. Все современные более тонкие электрофоретические методы, такие, как гель-электрофорез, изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез, были разработаны главным образом с целью улучшить способы анализа смесей белков. Тем не менее каждый из этих методов может быть приспособлен для препаративных целей с использованием десятков и даже сотен миллиграммов белковой смеси. [c.213]

Высокая степень разрешения этого метода обусловлена одним важным преимуществом его по сравнению с другими разновидностями электрофореза. Это преимущество отражено в термине фокусирование . В других методах разделения белков (за исключением изотахофореза — см. ниже) диффузия и перемешивание зон белка возрастают во времени. При изоэлектрическом фокусировании диффузия ограниченна, потому что, как только белковая молекула диффундирует и попадает в зону, отличающуюся по значению pH от ее изоэлектрической точки, она становится заряженной и мигрирует в обратном направлении. По завершении фокусирования теоретически ни один компонент системы не должен двигаться, и потому ток не может проходить (других ионов в системе нет). Следовательно, наложение сильных электрических полей должно приводить лишь к незначительному нагреванию, причем фокусирование будет осуществляться очень быстро. На самом деле слабый ток все же идет, и, если использованное напряжение слишком велико, градиент может исказиться и стать менее четко выраженным. [c.226]

В свободном растворе сопротивление движению ионов за счет трения между ними и раствором минимально, что обусловливает -быстрое продвижение ионов. Поскольку близкие по структуре молекулы обладают близкими зарядами, в электрическом поле они передвигаются совместно в виде полосы с границами раздела, образованными веществами с несколько различающимися электрофоретическими подвижностями. Метод электрофореза, называемый в соответствии с этим методом подвижной границы, требует слишком сложной и дорогостоящей аппаратуры, чтобы его можно было использовать в повседневной лабораторной практике в данном руководстве мы ограничимся рассмотрением электрофокусирования я изотахофореза (разд. 4.4.5 и 4.4.6.) [c.115]

Электрофокусирование и изотахофорез, обладая хорошим разрешением, применяются при аналитических исследованиях, но, подобно непрерывному электрофорезу, особенно широко используются для препаративных целей. Этими методами можно разделять относительно большие количества материала, который в конце разделения может быть получен обратно. С их помощью успешно проводили вьщеление пептидов, белков, нуклеотидов и т. д. [c.137]

Более современные методы разделения веществ включают хроматографию, электрофорез, изотахофорез, электрофокусировку, которые основаны на принципах экстракции и адсорбции. [c.71]

Различают след, методы электромифац. разделения смесей зонный электрофорез фокусирующий ионный обмен фронтальные методы изотахофорез. [c.436]

Наряду с КЗЭ, при котором удается осуществить разделение только за счет разницы в подвижности, и который в настоящее время представляет собой наиболее распространенный метод, выделяют также капиллярный гель электрофорез (КГЭ) с капилляром, заполненным гелем. При этом на электрофоретическую миграцию молекул оказывает влияние матрица геля, и поэтому достигается селективное разделение молекул по размерам. Незаряженные молекулы можно разделять с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). В данном случае к буферу добавляется детергент, и нейтральные молекулы распределяются между буфером и мицеллами в соответствии с их гидрофобностью. Разделение основано на подвижности мицелл, заряженных в большинстве случаев отрицательно. Поскольку в основе разделения лежит процесс распределения, можно с полным основанием говорить о хроматографическом методе. При изоэлектрической фокусировке (ИЭФ) происходит разделение в градиенте pH, формируемом добавлением амфолита к буферу в электрическом поле. Небольшое распространение получила пока электрохроматография (ЭХ), при которой применяется стационарная среда ВЭЖХ, а течение эдюента и перенос пробы происходит только за счет электроосмотического потока. В качестве самой старой капиллярной техники следует упомянуть изотахофорез (ИТФ), который в настоящее время вновь приобрел значение для концентрирования проб в КЭ. [c.7]

Изотахофорез представляет собой также разновидность электрофореза в ПАГ с использованием прерывистой буферной системы, в которой ведущий ион имеет высокую под вижность, а замыкающий — низкую, что обеспечивает высокую разрешающую способность метода, [c.148]

Весьма перспективными методами разделения белков (как и определения ряда физико-химических свойств) оказались разные варианты метода изоэлектрического фокусировання-изотахофореза, основанные на проведении электрофореза в поддерживающих средах (на колонке или в тонком слое) с градиентом pH. Точное местоположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки, т.е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд белковой частицы при данном значении pH равен нулю. При использовании [c.31]

Fe(III) Вода ЭДТА Пред- 25 мМ MES + 10 мМ бис-трис-пропан, pH = 6,6 (первичный 10мМНС1 + 20 мМ L-гистидин + 0,1% НРМС, рн = 6,0 конечный 5 мМ MES) прямое 254 нм 10 ppb Прямой капиллярный изотахофорез, капиллярный зонный электрофорез [c.381]

Полиакриламидный гель наименее химически активен. Его> слабое сродство к красителям позволяет осуществлять быстрое обнаружение биополимеров, главным образом белков, нуклеиновых кислот и продуктов их деградации, с помощью окрашивания. Прозрачный полиакриламидный гель обладает хорошими механическими свойствами, допускающими изменение концентрации полиакриламида в самых широких пределах. Электроос-мотические эффекты в этом геле очень малы. Условия аналитических и препаративных разделений на полиакриламидном геле путем зонного электрофореза в гомогенных и дискретных системах буферных растворов [48, 77], а также изотахофореза и изо-электрического фракционирования хорошо изучены. [c.299]

И Орнштейном [73]. Метод дискретного электрофореза, описанный этими авторами, или метод так называемого многофазного [48] зонного электрофореза в полиакриламидном геле, предусматривает объединение двух основных принципов электромиграции. На начальной стадии разделения происходит процесс фокусирования, сходный с изотахофорезом (см. разд. 12.3), который постепенно трансформируется в процесс зонного элек- [c.301]

Для электрофореза можно использовать один буферный раствор определенного состава ( непрерывный буфер) либо систему из двух буферных растворов ( ступенчатый буфер). В последнем случае собственно разделению образца на компоненты предшествует стадия его концентрирования в виде узкой стартовой зоны на границе раздела буферов (ступенчатый электрофорез). Если разделение проводится в трубках с полиакриламидным гелем, образующиеся зоны имеют форму дисков. В условиях изотахофореза [50] мигрирующие вещества образуют соприкасающиеся друг с другом зоны, которые расположены между лидирующим и замыкающим электролитом. Чтобы эти зоны не соприкасались, в исходную смесь добавляют вещества- разделители (spa ers), которые по своей электрофоретической подвижности занимают промежуточное положение между двумя наиболее близкими по этому параметру компонентами смеси. Таким образом, изотахофорез в опре- [c.28]

Многофазный зонный электрофорез включает три стадии а) концентрирование (фокусирование) в слое, б) расфокусиро ванне и в) собственно разделение [67]. Весь процесс представ ляет собой программируемую последовательность стадий, кото рые определяются выбранными граничными условиями (рис 3.11). Первая стадия — концентрирование (фокусирование) про водится так же, как и при изотахофорезе, но без спейсеров [c.122]

Редкоземельные металлы вместе с 5с, и Ас составляют 18% всех элементов периодической таблицы. Эффективного метода разделения этих элементов вплоть до разработки хроматографии практически не существовало. Первые успешные работы по разделению этой группы металлов были проведены во время второй мировой войны [44, 45], и эти работы являются одними из лучших примеров того, как можно, используя подходящий комплексообразующий агент, разделить эти металлы на ионообменнике. В дальнейшем были разработаны многочисленные методики колоночной хроматографии, включая ВЭЖХ [46, 47], тонкослойной хроматографии (рис. 14.28) [48, 49], электрофореза на бумаге (рис. 14.29) [50] и изотахофореза (рис. 14.30) [51]. [c.334]

Существует три типа электрофоретических систем электрофорез по Тизелиусу (с подвижной границей) зональный электрофорез (например, в среде с капиллярной структурой) стационарный электрофорез (изоэлектрическое фокусирование, изотахофорез). В медицинской и фармацевтической практике чаще применяется зональный электрофорез на фильтровальной бумаге, пленке из ацетатцел-люлозы, агаровом, агарозном, крахмальном или полиакриламидном гелях. Электрофорез белков сыворотки крови ведут в буферной среде с pH 8,6, когда молекулы белка и липопротеинов заряжаются отрицательно и движутся к аноду. После заверщения электрофоретического разделения электрофореграммы фиксируются и окрашиваются. Затем производят визуальную и денситометрическую оценку разделения белков. Для окраски различных белков на электрофоре-граммах используют специальные красители, часть из которых представлена в табл. 5. [c.44]

Концентрирующий гель можно с успехом использовать в препаративной колонке (для которой иногда требуются большие количества геля), чтобы устранить нежелательные эффекты, вызванные наличием солей и отсутствием преэлектрофоре-за [1184]. Концентрация этого геля должна быть такой, чтобы белки до. вхождения в разделяющий гель подверглись предварительному фракционированию в соответствии с размерами их молекул. Подобным способом можно предотвратить закупоривание разделяющего геля концентрированным раствором белков. Если же исследуемая проба очень разбавлена, то рекомендуется применить более разведенный концентрирующий гель,, не обладающий свойствами молекулярного сита. Это даст возможность сконцентрировать белковые компоненты ири помощи изотахофореза. Таиим образом, концентрирующий гель играет довольно существенную роль при препаративном электрофорезе в полиакриламидном геле. [c.115]

При классическом электрофорезе разделяемые ионы находятся в однородном электрофоретическо М буфере и движутся в электрическом поле с разньши скоростями. В условиях изотахофореза все ионы перемещаются с одной и той же скоростью, но располагаются друг за другом в соответствии с их подвижностями. Рассмотрим зоны, содержащие отрицательно заряженные ионы А и В с подвижностями тА">Шв" и общим противоионом Р+ (рис. 62,Л). При наложении электрического поля ионы будут двигаться с одинаковой скоростью в последовательно расположенных зонах (рис. 62, Б). Если учесть наличие ионов Н+ и ОН , а также все ионизированные формы соединений А, В и Р, то удельную проводимость в зоне 1 мож- [c.165]

Для изотахофореза белков желательно испольэовать узкие трубки и проводить его в полиакриламидных гелях, не проявляющих по отношению к исследуемым веществам свойства молекулярного сита. Изотахофорез обладает почти таким же хорошим разрешением, как и диск-электрофорез или изоэлектрическое фокусирование. Изо-тахофореграммы белковых смесей очень похожи на картины изоэлектрофокусирования [1116], так как компоненты таких смесей в кислотной системе разделяются главным образом в результате различий в значениях их ИЭТ [501]. Преимущество же изо тахофореза заключается в том, что в отличие от изо- [c.175]

Белки эффективно концентрируются с помощью электрофореза в ПААГ [63, 196, 276, 277, 382] или изотахофореза [283J. Применение электрофоретической процедуры для концентрирования макромолекул путем осаждения [308] или извлечения белков из неионных растворов с использованием мембран [3] может осложняться необратимой сорбцией белка иа мембране. С этой проблемой сталкиваются также и при работе с жидкими мембранами [384, 385] (см. дальше). Белки из разбавленного раствора (100—800 нг/мл) были выделены осаждением после введения радиоактивной метки с помощью [ Н]-1-фторо-2,4-ди-иитробензола [280]. Для снятия белков с ДЭАЭ-целлюлозы в высококонцентрированной форме использовался карбоксиметил-декстран [367]. [c.246]

В 34 главах изложены методы определения, выделения и очистки антител (включая дансилироваиие, двумерную хроматографию, изоэлектрофокусирование, электрофорез в полиакриламидном геле и изотахофорез) методы определения констант равновесия (равновесный диализ, равновесная фильтрация и седиментация) способы маркировки реагентов изотопами и флуоресцентными красителями и определение компонентов клеточной поверхности меры предосторожности при работе в изотопной лаборатории методы химической модификации белков, гаптенов и нерастворимых носителей приемы получения аитн-сывороток к аллотипам и антигенам гистосовместимости и получения антител доминирующего клонотипа методы оценки гистосовместимости и реакций в смешанной культуре лимфоцитов методы разделения клеток на гелях, несу- [c.7]

Подобного рода затруднения можно, по крайней мере в изученных нами случаях, преодолеть, используя изотахофорез (ИТФ) — один из методов электрофореза, основанный на принципе регулирующей функции Кольрауша (Kohlraus h, 1897). При ИТФ ионы разделяемого образца располагаются в порядке уменьшающейся электрофоретической подвижности между двумя соответственно подобранными видами ионов, один из которых ( ведущие ионы ) имеет более высокую подвижность, чем другой ( замыкающие ионы ). Так как принцип регулирующей функции действителен как для больших, так и для малых ионов, ИТФ при выполнении некоторых условий позволяет анализировать белки без особых затруднений. Эти условия следующие [c.143]

Изотахофорез — это третий метод разделения белков в электрическом поле. Простой электрофорез, осуществляемый в постоянном электрическом поле при постоянном pH, основан на разделении молекул по их истинной подвижности. В методе изоэлектрического фокусирования используется постоянное электрическое поле и градиент pH, что позволяет компонентам смеси двигаться до тех пор, пока они не станут электроней-тральными. В методе изотахофореза также создается градиент pH и все компоненты движутся в электрическом поле с одинаковыми скоростями, но напряженность электрического поля в точках локализации каждого компонента различна. Разделение происходит на основе различий в подвижности компонентов (подвижности на единицу напряженности поля), тогда как истинные скорости каждого компонента остаются идентичными. Чтобы получить различную напряженность электрического поля в разных точках, не требуется какого-то сложного оборудования для управления градиентом напряжения. Система является самоформирующейся (так же, как и система создания градиента pH при изоэлектрическом фокусировании), при условии что отсутствует избыток токопроводящих ионов, которые могли бы разрушить границы между компонентами. В отсутствие ионов с промежуточной подвижностью два типа одинаково заряженных ионов, имеющих разную подвижность, будут разделяться до тех пор, пока все ионы, движущиеся быстрее, не ока- [c.231]

Проводимости белковых молекул настолько низки, что устойчивая граница может существовать лишь при чрезвычайно высоких потенциалах, представляющих к тому же опасность для персонала лаборатории. Чтобы избежать этого, препаративный изотахофорез белков проводят в присутствии амфолитов, которые ипрают роль прокладок (spa ers), имеющих промежуточную по сравнению с белковыми компонентами подвижность. Эти прокладки увеличивают проводимость и способствуют образованию более устойчивых границ между компонентами. Их присутствие облегчает также создание градиента pH. Таким об разом, изотахофорез белков сходен с изоэлектрическим фокусированием, за исключением того, что компоненты в случае изотахофореза продолжают перемещаться (и со временем выходят из колонки), причем индивидуальные компоненты никогда не достигают области, где значения ipH соответствуют их изоэлектрическим точкам. Этам способом удается преодолеть три недостатка изоэлектрического фокусирования. Белок способен выходить из канала разделения и может быть собран так же, как и при простом электрофорезе. Неустойчивость белков в их изоэлекпрических точках перестает быть проблемой, если сохраняется более высокое значение pH (или более низкое при изменении общего направления потока). Не нужно также опасаться не растворимости белка в изоэлектрической точке. Основной недостаток этого метода по сравнению с изоэлектрическим фокусированием заключается в том, что он обладает [c.234]