Ферменты полинуклеотидных цепей

ДНК-полимераза I состоит из одного полипептида длиной 911 аминокислотных остатков (а. а.) (Air=102 000 D). Этот фермент отличается от прочих ДНК-полимераз Е. соИ наличием З -экзонуклеазной активности. Фактически ДНК-полимераза I — это два фермента на одной полипептидной цепи ограниченный протеолиз расщепляет эту ДНК-полимеразу на большой и малый фрагменты с разными активностями. Большой субфрагмент ДНК-полимеразы I (называемый также ДНК-полимеразой Кленова или фрагментом Кленова) обладает полимеризующей и З -экзонуклеазной (корректирующей) активностями. Малый субфрагмент несет З -экзонуклеазную активность, 5 -экзонуклеаза ДНК-полимеразы I действует на 5 -конец полинуклеотидной цепи только в составе дуплекса и отщепляет от него как моно-, так и олигонуклеотиды. Направление действия 5 -экзонуклеазы совпадает с направлением полимеризации новой цепи ДНК, т. е. в ходе полимеризации экзонуклеаза расчищает дорогу для полимеразы (рис. 29). Подобные свойства ДНК-полимеразы I соответствуют ее функциям в клетке эта полимераза удаляет различного рода дефекты из ДНК в ходе репарации и служит вспомогательной поли- [c.48]

Оказывается, новосинтезированные цепи ДНК всегда содержат на 5 -конце несколько рибонуклеотидов. Иными словами, сннтеэ ДНК начинается с синтеза РНК- РНК-затравку для синтеза ДНК образует специальный фермент, называемый ДНК-праймазой (от англ. праймер — затравка). Праймаза может быть отдельны. 1 ферментом, как у бактерий, илн входить в качестве субъединицы в ДНК-полимеразу (как у ДНК-полимеразы а животных). В любом случае праймаза — это фермент, отличный от РНК-полимераз, синтезирующих разнообразные клеточные РНК и тоже способных инициировать синтез новых полинуклеотидных цепей (см. гл. VII). Почему же в таком случае для инициации цепей ДНК используются рибонуклеотиды Возможное объяснение состоит в том, что в ходе эволюции прай.чазы произошли из РНК-полимераз. Но есть и другое, функциональное, объяснение. Поскольку требования инициа- [c.51]

Молекулы РНК не ассоциируют в пары с образованием аналогичной двойной спирали. Значительный объем дополнительной гидроксильной группы в углеводном фрагменте ограничивает конформационную гибкость полинуклеотидной цепи РНК. Главным образом эта гидроксильная группа определяет способность фермента различать ДНК и РНК. Внутри молекулы РНК могут образоваться короткие стержнеобразные двойные спиральные структуры за счет свертывания частей одной и той же нуклеотидной цепи. [c.321]

Рис, 4. Направленное расщепление полинуклеотидной цепи РНК ферментом РНКазой Н [c.15]

Во многих случаях рестриктирующие ферменты образуют разрывы в каждой из двух цепей в местах, расположенных симметрично относительно оси симметрии второго порядка. Этого и следовало ожидать в случае, если димерный фермент связывается с большой или с малой бороздкой двойной спирали и каждый активный центр взаимодействует с одной из полинуклеотидных цепей. [c.280]

В области синтеза Н. к. без копирования заданной природной матрицы также имеются значительные успехи. Т. к. методы классич. органич. химии применительно к Н. к. оказываются чрезмерно сложными, то с их помощью удается синтезировать лишь относительно небольшие олигомеры (до 10—12 нуклеотидов). Решение проблемы синтеза полинуклеотидных цепей достигнуто путем комбинирования химических и биохимических методов. Получение ряда ферментов в чистом виде позволило использовать их для синтеза полинуклеотидных цепей заданной структуры. [c.197]

Рис. 2.15. функционирование ДНК-полимераз. Двойная спираль ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей противоположной полярности (они антипа-раллельны ). Если свободная , не связанная с соседним нуклеотидом З -ОН группа находится у одной цепи на левом конце, то в другой цепи такая же группа находится на правом конце. Репликация ДНК катализируется ДНК-полиме-разами. Для функционирования такого рода ферментов необходимы 1) матрица, которая представляет собой одиночную цепь ДНК, 2) праймер-короткий отрезок реплицированной нуклеиновой кислоты и 3) смесь дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов. ДНК-полимеразы способны присоединять свободные нуклеотиды только к свободному З -ОН-концу нуклеотидной цепи. Таким образом, синтез протекает только в направлении 5 - 3, но не наоборот. [c.39]

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

И 5 углеводного компонента. Участие этих групп в формировании межнуклеотидных связей подтверждается результатами электрометрического титрования, поскольку при титровании в области pH от 12,0 до 13,5 не обнаружено свободных гидроксильных групп сахара. При помощи такого рода титрования и химических анализов установлено также наличие четырех первичных фосфорильных групп, трех аминогрупп и двух гидроксильных групп пурина — пиримидина на каждые четыре атома фосфора. Эти данные, а также почти полное отсутствие вторичных фосфорильных диссоциаций согласуются с предположением Левина о том, что молекула ДНК имеет вид длинной неразветвленной цепи. Молекулу ДНК можно изобразить в виде полинуклеотидной цепи с фосфо-диэфирными связями между углеродами в положениях 3 и 5 (фиг. 24). Обработка препаратов ДНК соответствующими ферментами, действие которых рассматривается в следующей главе, приводит к распаду ДНК с образованием нуклеозид-З -фосфатов или нуклеозид-5 -фосфатов. [c.68]

Рассматривая далее роль РНК в синтезе белка, полезно вернуться к описанной выше структуре дрожжевой транспортной РНК. Ее наиболее интересной особенностью является наличие неспаренных оснований в месте перегиба полинуклеотидной цепи. Для того чтобы было возможно образование спиральной структуры, в этом месте должны разместиться минимум три нуклеотида, у которых основания не связаны водородными связями. Эти три (или большее число) нуклеотида могут, весьма вероятно, играть решающую роль при включении той или иной конкретной аминокислоты в аминокислотную последовательность синтезируемого белка. Можно, например, представить себе, что код аминокислотной последовательности передается от информационной РНК к транспортной РНК путем образования водородных связей между указанными неспаренными основаниями и соответствующими основаниями информационной РНК. Если остальная часть молекулы транспортной РНК способна соединиться с определенной аминокислотой, предварительно активированной ферментом, то в результате данная аминокислота будет перенесена к определенному месту РНК-матрицы. [c.144]

Аналогичные закономерности наблюдаются прн катализированном ферментами синтезе (биосинтезе) полимеров. Мономеры в этом случае являются бифункциональными соединениями, но вследствие высокой специфичности катализатора оказывается возможным взаимодействие лишь одной из функциональных групп мономера с определенным концом растущей полимерной цепи. Например, фермент полинуклеотидфосфорилаза, с помощью которого происходит биосинтез полирибонуклеотидов из нуклеозиддифосфа-тов, катализирует взаимодействие концевой 3 —ОН группы растущей полинуклеотидной цепи с пирофосфатной связью в мономере [c.368]

Молекула т-РНК имеет сравнительно жесткую структуру. Примерно 80% ее полинуклеотидной цепи уложено в спираль. Как полагают, в одной из петель молекулы т-РНК находится антикодон— триплет нуклеотидов, комплементарный кодону (триплету) информационной РНК, кодирующей местоположение аминокислот в полипеетидной цепи. Один из концов полинуклеотидной нити Т-РНК заканчивается- триплетом Ц-Ц-А эт.о акцепторный конец, которым т-РНК захватывает активированную аминокислоту из их аденилатов с помощью фермента аминоацил-т-РНК-синтетазы. [c.12]

В 1953 г. Дж, Уотсон и Ф. Крик сумели правильно интерпретировать данные рентгеноструктурного анализа ДНК, накопленные в лабораториях Р. Франклин и 14. Уилкинса, и на их основе построить модель пространственной структуры ДНК- Они показали, что макромолекула ДНК — это регулярная двойная спираль, в которой две полинуклеотидные цепи строго комплементарны друг другу. Из анализа модели следовало, что после расплетания двойной спирали на каждой из полинуклеотидных цепей может быть построена комплементарная ей новая, в результате чего образуются две дочерние. молекулы, не отличимые от материнской ДНК. Через пять лет М. Мезельсон и Ф. Сталь экспериментально подтвердили этот механизм, а несколько раньше (1956) А. Корнберг открыл фермент ДНК-полимеразу, кщ-орый на расплетенных цепях, как на матрицах, синтезирует новые, комплементарные им цепи ДНК. [c.6]

В процессе деления клетки двойная спираль, состоящая из двух комплементарных полинуклеотидных цепей, раскручивается на отдельные цепи и одновременно начинается синтез новых полинуклеотидных цепей с участием ферментов в качестве катализаторов и исходных цепей ДНК в качестве матриц. Новая цепь, синтезирующаяся на одной из исходных цепей, идентична другой исходной цепи, в результате чего сохраняется комплементарность. Таким образом, когда процесс завер- [c.457]

В ходе Р. рост цеш1 осуществляется благодаря взаимод. дезоксирибонуклеозидтрифосфата с З -ОН концевым нуклеотидом уже построенной части ДНК при этом отщепляется ш1рофосфат и образуется фосфодиэфирная связь. Рост полинуклеотидной цепи (рис. 2) идет только с ее З -конца, т. е. в направлении 5 3 (см. Нуклеиновые кислоты). Фермент, катализирующий эту р-цшо,-ДНК-полиме-раза (см. Полидезоксирибонуклеотид-синтетазы)-пе способен начать матричный синтез на одноцепочечной ДНК, если нет хотя бы олигонуклеотидного биспирального участка (т. наз, затравочного ол ггонуклеотида) комплементарного матрице затравочным олигонуклеотидом во мн. случаях является не ДНК, а РНК. [c.252]

Для осуществления молекулярного клонирования недостаточно одних только ферментов рестрикции. Во-первьгх, водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, недостаточно прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Необходим какой-то инструмент для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы, т. е. для восстановления связи между 3 -гидроксильной концевой группой одной цепи и 5 -фосфатной группой другой. Таким инструментом является ДНК-лигаза бактериофага Т4. Этот фермент катализирует образование фосфо-диэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые уже удерживаются вместе благодаря спариванию липких концов. Кроме того, ДНК-лигаза Т4 сшивает тупые концы, которые сближаются друг с другом после того, как объединяемые фрагменты связываются с ферментом (рис. 4.6). Во-вторых, объеди- [c.55]

ДНК-полимераза (DNA polymerase) Фермент, катализирующий синтез полинуклеотидной цепи из отдельных нуклеотидов с использованием другой цепи в качестве матрицы и ДНК-затравки со свободной З -ОН-группой. [c.548]

Химическая структура нуклеиновых кислот будет описана в 2.3. Здесь же уместно кратко описать основные принципы, заложенные в структуре молекулы ДНК, которые обеспечивают возможность самокопирования ДНК независимо от нуклеотидной последовательности. При делении клетки информацию, заложенную в молекулах ДНК этой клетки в виде определенной последовательности нуклеотидов, необходимо передать двум вновь образованным дочерним клеткам. Поэтому из одной молекулы ДНК перед клеточным делением должно образоваться две с той же нуклеотидной последовательностью. В живых организмах ДНК в период между ее удвоением всегда существует в виде двух связанных друг с другом полинуклеотидных цепей (нитей). Связь эта осуществляется в результате того, что каждый из четырех составляющи. ДНК типов нуклеотидов резко предпочтительно взаимодействует с одним из тре.ч остальных. Поэтому нуклеотидные последовательности этих нитей взаимно однозначно соответствуют друг другу, или, как принято говорить, комплементарны друг другу. Следовательно, каждая цепь содержит информацию о комплементарной нуклеотидной последовательности другой цепи. Будучи разделенными, цепи со.чраняют необходимую информацию для построения из нуклеотидов новы.к комплементарны. цепей и, таким образом, осуществляют воспроизведение информации, заложенной в двуспиральной структуре. Процесс самоудвоения ДНК, т.е. образования двух новых двуни-тиевых молекул ДНК, идентичных первоначальной молекуле, называют репликацией ДНК. Химические события, лежащие в процессе репликации, состоят в последовательном присоединении нуклеотидов друг к другу. Этот процесс в живых организмах осуществляет специальный фермент — ДНК-полимераза. Изучение свойств и механизмов функционирования этого фермента в клетке показало, что он работает только в присутствии материнской двуспиральной ДНК. Цепи материнской ДНК направляют образование новых комплементарных цепей, т.е. на каждой стадии роста новой цепи осуществляют отбор одного из четырех мономеров и присоединения его к растущей цепи. [c.18]

Для того чтобы новые участки материнских нитей становились доступными репликации, должно происходить разделение нитей. Это достигается с помощью специальных ферментов — геликаз, которые перемещаются в рассматриваемом случае влево вдоль обеих цепей материнской ДНК, раскручивая их. Такое направленное перемещение ферментов требует затраты энергии, и каждый акт перемещения обеих геликаз сопровождается гидролизом пирофосфатной связи в молекулах АТФ. Таким образом, геликазы обладают АТФазной активностью. Гелика-зы неидентичны, поскольку им приходится двигаться в различных физических направлениях двух полинуклеотидных цепей. В ходе продвижения вилки репликации в определенном направлении, в рассматриваемом случае влево, вилка, а следовательно, и геликазы, в силу антипараллельной ориентации комплементарных материнских цепей, по отношению к одной из них движутся от 3 - к 5 -концу, а по отношению к другой от 5 - к 3 -концу. В случае Е.соИ первая получила название геликазы а или В,ер-белка, вторая — геликазы II. [c.179]

Одно из более сложных применений молекулярной селекции нуклеиновых кислот связано с попытками создать на этой основе рибозимы с новыми каталитическими функциями. С этой це.пью необ.ходимо создать новые методы селекции. Как уже говорилось в 6.4, открытие рибозимов вызвано повышенный интерес к возможности участия рибозимов на первых этапах эволюции. Для этой цели необходимы рибозимы с синтетическими функциями. Ниже приводится пример получения с помощью молекулярной селекции нуклеиновых кислот фермента, катализирующего реакцию соединения двух олигорибоиуклеотидов, один из которых (донорный) несет на 5 -конце трифосфатную группу, с помощью которой с отщеплением пирофосфата осуществляется образование новой межнуклеотидной связи с 3 -ОП-группой акцепторного олигонуклеотида. Эта реакция по своему типу идентична реакции элонгации полинуклеотидной цепи, в ходе которой осуществляется перенос нуклеотидного остатка от нуклеозид-5 трифосфата на 3 -ОН-группу растущей полинуклеотидной цепи. С.хема селекции представлена на рис, 87. Для большей эффективности этого процесса трифосфатная группа и 3 -ОН-группа донора долясны быть сближены. Это можно сделать создав конструкцию (рис. 87, а), в которой эти две группы оказываются комплементарными соседним нуклеотидам стебля в шпилечной структуре. Па 5 -конце акцепторного [c.307]

Непосредственно синтез новой цепи ДНК осуществляется при помощи ДНК-полимераз. У прокариот найдено три типа этих ферментов, а именно ДНК-полимераза I, ДНК-полимераза II и ДНК-полимераза III. ДНК-полимераза I — протомер с молекулярной массой около 100 kDa. Фермент полифунк-ционален он обладает полимеразной и нуклеазной активностью. Принимает участие в процессах репарации ДНК. Роль ДНК-полимеразы П пока не совсем ясна, известно, однако, что мутации генов, ее кодирующих, не сказываются на жизнеспособности клеток. Из этих ферментов ДНК-полимераза П1 оказалась наиболее функционально значимой именно этот фермент катализирует наращивание полинуклеотидной цепи ДНК. Он является олигомером и состоит из семи неравнозначных субъединиц, одна из которых обладает наибольшей полимеразной активностью. Оказалось, однако, что ДНК-полимераза III не может самостоятельно присоединяться к цепи ДНК и инициировать образование новой цепи, поэтому синтез должен быть инициирован какой-то другой структурой. Такой структурой является фрагмент РНК, который синтезируется в сайте инициации и к которому присоединяется ДНК-полимераза. Этот фрагмент называется праймером, а РНК-полимераза, катализирующая его образование, — праймазой. [c.451]

Получение генов. Их возможно получать методом химического синтеза, выделением из геномов живых организмов, а также при помоши обратной транскриптазы, которая на соответствующей мРНК кодирует комплементарную ДНК (кДНК). Первый и второй методы имеют ограниченное применение. Химический синтез — достаточно длительная и дорогостоящая процедура. Вьщеление однородных фрагментов ДНК осуществляется при помощи ферментов-рестриктаз, которые узнают и расщепляют ДНК в строго фиксированных точках. Эти ферменты функционально связаны с модифицирующими метилазами следующим образом метилазы осуществляют метилирование в сайтах ДНК, которые атакуются рестриктазами. Метилирование защищает собственную ДНК клетки от неспецифической фрагментации, в то время как чужеродная ДНК немедленно разрушается. В месте разрыва полинуклеотидных цепей образуются, в частности, липкие концы, способные образовывать между собой комплементарные пары оснований. Открытие В. Арбером рестрикции и использование ее для получения генов было отмечено Нобелевской премией. В настоящее время идентифицировано более 500 рестриктаз, причем их название складывается из первой буквы рода микроорганизма и двух пер- [c.499]

В блочном методе определения последовательности нуклеиновых кислот весьма существенна методология структурного анализа. В одном из возможных вариантов используется полное расщепление полинуклеотидной цепи двумя (или более) ферментами с различной специфичностью. В случае РНК это может быть осуществлено различными рибонуклеазами, например гидролиз последовательно рибонуклеазой Т,, а затем — панкреатической рибонуклеазой. Структуры полученных олигонуклеотидов сравниваются для поиска перекрывающихся последовательностей Если это оказывается недостаточным, используется третья РНаза. [c.314]

Нуклеотид состоит из ковалентно связанных молекул пентозы, фосфорной к-ты и азотистого основания. Если от такого звена отщепить фосфорную к-ту, получим нуклеозид (их названия аденозин, гуанозин, тимидин, цитидин и уридин). Цепь Н. к. несимметрична вследствие того, что фосфорная к-та, соединяющая попарно все нуклеозиды, присоединена к пентозе в двух структурно различных положениях к З -атому С и к 5 -атому С. Поэтому полинуклеотидная цепь векто-риальна, ей можно условно приписать направление. Все известные сейчас синтетич. ферменты, ведущие реакции наращивания полинуклеотидных цепей, присоединяют очередное звено всегда только к З -гидрокси- [c.190]

Все ферменты, гидролизующие полинуклеотидные цепи, можно отнести к числу фосфодиэстераз, поскольку они разрушают фос-фодиэфирные межнуклеотидные связи. Однако их легко можно разбить на две основные группы [1, 50, 52] [c.84]

Экстракты из тканей животных содержат фермент, осуществляющий добавление нуклеотидильных звеньев к концам полинуклеотидных цепей. Обычная ДНК-полимераза требует присутствия всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, ионов магния и ДНК-затравки, представляющей собой одноцепочечный полинуклеотид, на котором собирается новая, комплементарная цепь. Поэтому фермент можно назвать репдикациопным ферментом его активность подавляется при отсутствии одного или нескольких трифосфатов. Второй фермент, описанный в 1962 г. [46], катализирует включение концевых нуклеотидных звеньев в молекулу ДНК-затравки за счет отдельных трифосфатов. Он не стимулируется добавлением остальных трех трифосфатов, но цистеин усиливает его активность. Его можно назвать концевым или терминальным ферментом [47, 48] его можно использовать при биосинтезе полидезоксиадениловой кислоты [491. [c.211]

Насколько близка структура продукта, образующегося в ДНК-полимеразной реакции, к структуре ДНК-затравки Ответ на этот вопрос служит одновременно и ответом на вопрос о роли ДНК-затравки. Затравка может просто инициировать удлинение предсуществующих полинуклеотидных цепей или она может использоваться в качестве матрицы для фермента, катализирующего удвоение матрицы. Физические свойства синтезированного продукта явно противоречат нервому из этих двух предположений. Исследование в ультрацентрифуге показало, что синтезированный продукт поли-дисперсен и что среднее значение его константы седиментации приблизительно равно константе седиментации ДНК-затравки. Молекулярные веса и характеристические вязкости синтетической и затравочной ДНК приблизительно одинаковы. Наконец, присутствие 3, 5 -фосфодиэфирных связей в динуклеотидах, полученных при неполном ДНК-азном гидролизе синтезированного полимера, а такн е тот факт, что синтезированный полимер гидролизуется ДНК-азой, в свою очередь указывают на близость структур синтетической и затравочной ДНК. Таким образом, синтезированный поли- [c.509]

Практически, однако, дело обстоит несколько сложнее. Расщепление полинуклеотидов с концевой фосфатной группой гладко протекает лишь при использовании химических методов деградации, при расщеплении же под действием ферментов существенным условием быстрого протекания реакции является отсутствие фосфатной группы на З -конце полинуклеотидной цепи в случае фосфодиэстеразы змеиного яда и на 5 -конце—в случае фосфодиэстеразы селезенки (см. стр. 67). По этой причине перед ферментативным расщеплением необходимо удаление концевых фосфатных групп действием фосфомоноэстеразы, что приводит к исчезновению специфического фрагмента, образующегося из фосфорилированного конца цепи. [c.46]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология