Конкурентное связывание

Рис. 7.8-17. Экспериментальный отклик анализа при конкурентном связывании в мертвом объеме в сравнении с точками данных моделирования, предполагающего простую кинетику конкурентного связывания, а — экспериментальные, б — расчетные, в — предсказанные точки.

Сродство флавоноидов 1-5 коррелировало с их гидрофобностью. Была вычислена константа связывания К<.з для веществ 1-4 с САЧ и расстояние между Тгр 214 остатком и первым участком связывания 1-5. Прослежено конкурентное связывание 1-2 с олеатом и веществ 1 и 3 с веществом 5 [19]. Таким образом, различные флавоноиды способны связываться как с липидами биологических мембран, так и с белками. [c.577]

Если флуориметрический метод применяется для исследования конкурентного связывания НАД+ и НАД-Н согласно уравнению (2), то необходимо учитывать, что НАД+ в какой-то мере снижает наклон Е—НАД-Н/НАД-Н [95] [c.407]

Процессы связывания, протекающие по схеме (10.1) — (10.2), часто используются в двух аспектах а) для определения равновесных констант комплексообразования с помощью конкурентного вытеснения меченого лиганда изучаемым б) для аналитического определения концентраций лигандов конкурентным методом. Рассмотрим эти аспекты применения систем конкурентного связывания подробнее. [c.247]

Несмотря на то что конкурентные методы, представленные в табл. 32, основаны на использовании различных типов центров связывания, теоретическое их описание близко и в самом простейшем случае основано на схеме (10.1) — (10.2). Ключевыми характеристиками любого метода анализа, в том числе и конкурентного, являются чувствительность и специфичность. Остановимся подробно на том, какие факторы определяют эти характеристики для конкурентных методов анализа. При этом для простоты будем полагать, что процесс конкурентного связывания меченого и це-меченого лигандов протекает по схеме (10.1) —(10.2). [c.259]

Bll Распознавание глутамата. Конкурентное связывание Гли, Ала, СТФ и ТТФ. [c.107]

Bj Распознавание NH . Конкурентное связывание Гис, глюкоз-амин-6-фосфорной кислоты. [c.107]

Механизм взаимодействия при кооперативном и конкурентном связывании на примере двух различных сайт-специфических ДНК-связывающих белков будет обсуждаться дальше в связи с проблемой регуляции транскрипции (гл. 10). [c.106]

Установление концентрации антигена основано на принципе конкурентного связывания антителами меченого и немеченого антигена. Сущность этих методов описывается следующим уравнением [c.106]

Первая группа методов является обычным конкурентным связыванием в присутствии ограниченного постоянного количества меченого антигена или специфического антитела, немеченый реагент при этом может быть связан с твердой подложкой. По завершении реакции количество меченого реагента, связанного с твердой фазой, будет обратно пропорционально количеству определяемого вещества в образце. Естественно, что наличие ( нового сигнала будет оказывать диспропорционирующий эффект на результаты измерения высоких концентраций вещества. В случае хорошо оптимизированной методики вещество можно определять с высокой точностью (коэффициент вариации менее 10%) в широком (два-три порядка) диапазоне концентраций. Чувствительность методики зависит как от ошибок практического характера (точность отбора пробы, антител, антигена и способ измерения сигнала), так и от аффинности антител. [c.9]

ЮмМ раствор K l 3 - пластификатор 4-антитела к дигоксину. б Конкурентное связывание дигоксина при постоянной концентрации антитела [11]. [c.63]

Концепция сенсора на основе конкурентного связывания впервые была предложена в работе [22]. В сенсорах этого типа фаза иммобилизованного реагента содержит как [c.479]

В лаборатории, где работает автор, в настоящее время разрабатывают сенсоры, в которых конкурентное связывание сочетается с флуоресцентным переносом энергии. В этом случае лиганд содержит метку донора, а реагент - акцептора (или наоборот). Подбирают возбуждающий свет с такой длиной волны, чтобы селективно возбуждался только донор. Если лиганд связан с реагентом, то расстояние между донором и акцептором так мало, что возможен перенос энергии от донора к акцептору. При связывании определяемого вещества с реагентом лиганд вытесняется, и расстояние между донором и акцептором увеличивается настолько, что переноса энергии между ними не происходит. Это приводит к увеличению испускания света донором и уменьшению - акцептором. Измеряемой величиной является отношение интенсивностей флуоресценции донора и акцептора. Для получения сигнала сравнения удобно использовать две различные длины волны. [c.480]

Помимо глюкозного сенсора [23], конкурентное связывание в принципе можно применять и в случае многих других реакций. Помимо возможности определять вещества, прямое детектирование которых затруднено, этот подход привлекателен тем, что позволяет до некоторой степени контролировать диапазон определяемых концентраций, варьируя концентрацию лиганда. [c.480]

Практическое применение конкурентного связывания в сенсорных устройствах более детально описано в гл. 32. [c.480]

Для использования моноклональных антител в изучении белковых антигенов важно знать, с одной и той же или разными антигенным и детерминантами (эпитопами) антигена связываются полученные антитела. Эпитопную специфичность антител определяют методом их конкурентного связывания. Антитела одного клона конъюгируют с пероксидазой (с. 317). Берут 96-луночный микропланшет для ИФА и сорбируют в лунках антиген, как обычно (с. 320). После тщательной отмывки в каждую из 12 лунок вносят по 75 мкл культуральной жидкости того же или других клонов или раствор очищенных антител — 100 мкг/мл (рис. 42). Все остальные лунки содержат 50 мкл фосфатного буфера с 1%-ным БСА. Делают серийные разведения антител, перенося по 25 мкл раствора из каждой лунки в соседнюю (рис. 42) на 5—6 лунок. К каждой лунке добавляют 10 мкл меченных пероксидазой автител в концентрацию 20 мкг/мл. Инкубируют 2—4 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании. После тщательной [c.322]

В ЭТОЙ форме они связываются с анионной группой сульфированной смолы. Элюция аминокислоты достигается либо повышением pH и, таким образом, смещением равновесия (2) влево, либо увеличением ионной силы, что приводит к конкурентному связыванию со смолой аминокислот и катионов элюата. Аспарагиновая, глутаминовая и цистеиновая кислоты [последняя образуется в результате окисления цист(е)иновых остатков (см. разд. 23.3.3)] элюируются легче всего, ибо это двухосновные кислоты. Лизин и аргинин, напротив, элюируются с трудом в силу того, что каждый из них несет в боковой группе протонированную группу. М.ежду этими крайними случаями располагаются остальные аминокислоты по мере того как увеличивается гидрофобное взаимодействие их боковых групп с ароматической структурой ионообменной смолы. Не удивительно, что ароматические аминокислоты обладают наибольшим гидрофобным связыванием и выходят лишь перед лизином и аргинином. С другой стороны, присутствие нейтральной полярной группы, такой как гидроксильная или амидная, уменьшает силу гидрофобного взаимодействия, так что серин, треонин, аспа--рагин и глутамин элюируются раньше лейцина, изолейцина и валина. [c.261]

При добавлении органических субстратов происходит конкурентное ингибирование, которое является следствием конкурентного связывания в полости циклоамилозы. [c.321]

Принцип РИА основан на конкурентном связывании идентичных лигандов и антитела. В случае РИА оценивается конкуренция с радиоактивномеченым лигандом (обозначим его как 1 ). Меченый и немеченый лиганды конкурируют друг с другом за связывающий центр на лигандспецифичном антителе АВ свободные компоненты связанные компоненты [c.316]

Аткинсон [18, 19] исследовал недавно вопрос о том, как влияет на кинетику процесса изменение концентрации субстрата в условиях, когда сумма концентраций субстрата и продукта реакции сохраняется на постоянном уровне и продукт является конкурентным ингибитором. Явление конкурентного связывания субстрата и продукта одноцентровой молекулой фермента хорошо известно. Новое здесь — условие сохранения постоянной общей концентрации конкурирующих реагентов. Иными словами, речь идет о реакции А- Х, начальная скорость которой исследуется в зависимости от А при А- X = = onst. Такого рода ситуация характерна для реакций с участием коферментов, при которых происходит взаимопревращение молекулярных форм, имеющее значительно большую скорость, чем реакции синтеза или распада основной структуры. [c.242]

Рис. 109. Конкурентное связывание двух одновалентных лигандов Li и Lj с одним типом цент ров комплексообразования в условиях L2a>Qa. Зависимости в координатах Bip—Lip (а) н 1/Bip—1/Lip (б). 6, в — определение равновесных констант Kai и I ol

Помимо Ка2 из ззвисимостей по конкурентному связыванию в ко- [c.251]

По-видимому, при непродуктивном или конкурентном связывании используются некоторые из взаимодействий, возникающих в продуктивном фермент-субстратном комплексе. Так, из пяти связей, образуемых молекулой Gly-Tyr, только одна — между аминогруппой субстрата и остатком Glu-270 —считается непродуктивной. Другие неактивные комплексы могут образовываться в результате смещения субстрата вдоль связывающей выемки , приводящего к присоединению карбоксильной группы к атому цинка, или в результате неправильного связывания, при котором N-ацильный заместитель ацилдипептида занимает полость, определяющую специфичность, а концевая группа СОО вступает в контакт с остатком Arg-71 [2,3]. [c.533]

Несмотря на большую вероятность этого предположения, очень мало известно о том, какими именно путями осуществляется само подавление синтеза белков. По мнению многих исследователей, биологическая активность тетрациклинов тесно связана с их способностью образовывать прочные хелаты с ионами магния, марганца, железа и ряда других двух- и трехвалентных металлов. Действительно, было установлено, что уже упоминавшееся угнетение тетрациклинами нитрат-редуктазы обусловлено их взаимодействием с ионами марганца, а нодавление процессов фосфорилирования — связыванием ионов магния прибавление больших количеств этих ионов приводит к ослаблению или полному прекращению действия тетрациклинов. Однако в ряде случаев наблюдаются не просто антагонистические, а очень сложные отношения между тетрациклинами и ионами двухвалентных металлов при их действии на ферменты например, подавление хлортетрациклином липазы и а-ами-лазы животного происхождения даже стимулируется в присутствии ионов кальция. Эти данные показывают, что нельзя сводить весь механизм действия тетрациклинов к простому конкурентному связыванию ими ионов металлов, важных для жизнедеятельности микроорганизмов. [c.252]

Круговорот маннозофосфатного рецептора был прослежен с помощью специфических антител, позволяющих локализовать этот белок в клетке. В норме рецепторы маннозо-6-фосфата обнаруживают в мембранах аппарата Гольджи и эндолизосом, но не в зрелых лизосомах. Если некоторые культивируемые клетки обработать слабым основанием (например аммиаком или хлорохином), которое накапливается внутри органелл с кислой средой и поднимает там рП до нейтрального, то рецепторы исчезают из аппарата Г ольджи и появляются в эндолизосомах. Можно вызвать в таких клетках возвращение рецепторов в аппарат Гольджи, либо удалив слабое основание, либо добавив в культуральную среду большое количество маннозо-6-фосфата. При обоих воздействиях рецептор отделяется от связанного с ним фермента в эндолизосоме, в одном случае в результате вторичного закисления среды в органелле, а в другом - за счет конкурентного связывания с рецептором поглощенного маннозо-6-фосфата. Эти эксперименты свидетельствуют о том, что перемещению рецептора обратно в аппарат Г ольджи способствует его конформационное изменение, связанное с отщеплением гидролазы. [c.70]

Б. Связывание альдост ерона с рецепторами. В цитоплазме и ядре клеток-мишеней выявлены рецепторы, связывающие альдостерон с высоким сродством (К 1 нмоль/л). Общее связывание (емкость рецепторов) в цитоплазме в 80— 100 раз выше, чем в ядре однако по специфичности и аффинности связывание в ядре намного превосходит общую связывающую активность цитозоля. Как обнаружилось в опытах in vitro, в цитозоле присутствуют три типа связывающих белков. Белки I и II типа связывают альдостерон с высоким сродством, белки типа III —с низким. Тип I — это минералокортикоидный рецептор, а тип И — видимо, глюкокортикоидный рецептор, одновременно связывающий альдостерон. Рецептор типа I жадно связывает альдостерон, но очень хорошо связывает также ДОК и кортикостерон. Исходя из того, что уровень каждого из )тих двух стероидов в плазме намного вьпие, чем альдостерона. можно, казалось бы, предположить, что именно они будут предпочтительно связываться с рецептором типа I и, следовательно, эффект альдостерона будет слабым. Однако вспомним, что в плазме крови ДОК и кортикостерон связаны со стероид-транспор тирующим белком транскортином, тогда как альдостерон не имеет специфического транспортною белка. Отсюда следует, что в плазме эффективная свободная концентрация альдостерона выше, чем кортикостерона или ДОК. Благодаря этому альдостерон беспрепятственно проникает в клетки, и in vivo это обеспечивает ему преимущество в конкурентном связывании с рецептором типа I. [c.218]

I жадно связывает альдостерон, но очень хорошо связывает также ДОК и кортикостерон. Исходя из того, что уровень каждого из этих двух стероидов в плазме намного выше, чем альдостерона, можно, казалось бы, предположить, что именно они будут предпочтительно связываться с рецептором типа I и, следовательно, эффект альдостерона будет слабым. Однако вспомним, что в плазме крови ДОК и кортикостерон связаны со стероид-транспортирующим белком транскортином, тогда как альдостерон не имеет специфического транспортного белка. Отсюда следует, что в плазме эффективная свободная концентрация альдостерона выше, чем кортикостерона или ДОК, Благодаря этому альдостерон беспрепятственно проникает в клетки, и in vivo это обеспечивает ему преимущество в конкурентном связывании с рецептором типа I, [c.218]

На рис.4.4 приведены гистограммы распределения значений функций, полученных для моделей Б и Ж. Видно, что распределения для модели I перекрываются существенно меньше, чем для модели Б. Возможны следующие причины перекрывания распределений 1) несовершенство модели, наличие каких-либо факторов, не учтенных в модели, например вторичная структура мРНК, препятствующая связыванию рибосомы, или конкурентное связывание какого-нибудь белка-регулятора 2) наличие в выборке несайтов неидентифицированных сайтов инициации трансляции, которое может быть вызвано их относительной слабостью, синтезом коротких или нестабильных пептидов и другими причинами. [c.128]

Перспективный метод ИФА основан на применении антител, иммобилизованных на водорастворимом полимере. Принцип анализа состоит в следующем. К раствору иммобилизованных на полианионе антител добавляют определяемый и меченный ферментом антиген и проводят реакцию конкурентного связывания. Для разделения свободного и связавшегося в комплексе конъюгата вносят поликатион, который быстро и количественно образует с полианионом нерастворимый поликомплекс. После разделения жидкой и твердой фаз регистрируемая в надосадочном растворе или осадке ферментативная активность дает информацию о начальной концентрации исследуемого антигена. Для удобства измерения активности полученный осадок может быть вновь легко растворен при увеличении ионной силы. [c.112]

ИФА, основанный на использовании антител против активного центра фермента. При использовании сывороточного альбумина человека как модельного антигена разработан гомогенный ИФА, основанный на конкурентном связывании с конъюгатом фермент — антиген двух типов антител специфических антител против определяемого антигена и антител против фермента, вызывающих при связывании полную потерю его каталитической активности. Вследствие стерических затруднений связывание с конъюгатом антител против антигена приводит к потере способности взаимодействия антител второй специфичности с ферментом. В присутствии определяемого антигена доля специфических антител, вязанных с конъю- [c.117]

Мы можем получитБ дополнительные сведения, изучая конкурентное связывание олигонуклеотидов. Допустим, например, что мы добавили слабо связывающийся и не содержащий радиоактивной метки тример в количестве, значительном по сравнению с присутствующей в растворе тРНК, которая тем не менее имеется в избытке по сравнению с меченым олигонуклеотидом. Тогда присутствие конкурирующих молекул проявится в том, что они образуют комплекс с частью тРНК, величина которой зависит от их константы связывания [c.425]

Конкурентное связывание приводит к уменьшению концентрации доступной тРНК, с которой может связываться меченый олигонуклеотид отношение последней к исходной концентрации тРНК равно [c.425]

Описан также электрод, селективный к дигоксину калий-се-лективная мембрана этого электрода состоит из ковалентно связанного с дигоксином бензо-15-крауна-5 и поливинилхлорида [8 ]. Принцип иммуноанализа состоит в конкурентном связывании ди-, гоксина в мембране и в пробе с ограниченным количеством антител. В ходе анализа некоторое количество конъюгата ионофора связывается антителами на внешней поверхности мембраны, что снижает способность мембраны к транспорту ионов. Количество связанного конъюгата обратно пропорционально концентрации дигоксина в растворе. При данной кс нцентрации иона калия на электродный потешщал влияет эффективность удаления различного количества ионофора из мембраны. Калибровочная кривая постро-ога в диапазоне концентраций дигоксина 1-100 нмоль/л. [c.212]

В описанном Хайнеманом и др. [8] методе гомогенного иммуноанализа антиген эстриол метят ацетатом ртути и проводят его конкурентное связывание с антителом. Отделения свободного эстриола от связанного не требуется, поскольку в используемом диапазоне потенциалов эстриол неэлектроактивен. Более того, связанный с антителом меченый антиген восстанавливается при более отрицательном потенциале, чем свободный. Меченный ртутью эстриол восстанавливается при — 300 мВ (отн. н. к. э.) чтобы избежать мешающего влияния кислорода, пробы необходимо тщательно дегазировать. В противном случае при низких концентрациях антигена чувствительность определения снизится. В следующей работе группы Хайнемана [16] с эстриолом как модельной системой электроактивность эстриола изменяли нитрованием. При нитровании эстриола в положения 2 и 4 он становится электроактивным и характеризуется волнами восстановления при — 422 и — 481 мВ относительно хлоридсеребряного электрода сравнения. Это соединение авторы и использовали в гомогенном иммуно- [c.60]

Измеряемый оптический параметр так или иначе связан с взаимодействием лиганд - реагент. Первый описанный в литературе сенсор на основе конкурентного связывания разрабатывали для определения глюкозы. В этом приборе реагент, конканавалин А, иммобилизовали на внутренней поверхности полой трубки, проницаемой для глюкозы [23]. Конец оптического волокна помещали внутри полой трубки, при этом иммобилизованный конканавалин А находился вне оптического пути. В результате меченный флуоресцирующим веществом лиганд (декстран, меченный флуоресцеином) не возбуждается при связывании с конканавалином А. Добавленная глюкоза замещает декстран, позволяя ему диффундировать в область оптического пути, где флуоресцеин возбуждается. Следовательно, увеличение содержания глюкозы сопровождается увеличением наблюдаемого сигнала флуоресценции. Поскольку молекулы декстрапа слишком велики, чтобы проникнуть через стенки полой трубки, он остается иммобилизованным. [c.480]

Основное ограничение метода конкурентного связывания, видимо, заключается в низкой скорости отклика. Прочное связывание лиганда и определяемого вещества с реагентом приводит к тому, что скорость диссоциации мала. Поскольку отклик сенсора определяется диссоциацией комплекса лиганда или определяемого вещества с реахентом, то, очевидно, время отклика должно быть велико. [c.480]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология