ДНФ-аминокислот работа хроматографической колонки

Для того чтобы закончить рассмотрение вопросов фотометрии, определим возможность применения двухлучевого фотометра для компенсирования ошибок, связанных с нестабильностью нулевого тока, изменением окрашиваемого фона и т. д. Этот вопрос специально разбирался Гамильтоном [22], который показал, что применение двухлучевого фотометра с двумя хроматографическими колонками, из которых одна является рабочей (на ней разделяются аминокислоты), а другая — эталонной (через нее прокачиваются буферные растворы), нецелесообразно, так как невозможно добиться полной идентичности в работе обеих колонок, [c.146]

В аналитической химии сравнительно простое разделение, например металлов, можно производить непосредственно ионообменной сорбцией, а в более сложных случаях, в частности при разделении аминокислот, иониты можно использовать в качестве насадки хроматографических колонок. Применение ионитов в настоящее время достигло чрезвычайно широкого масштаба, о чем свидетельствует огромное число опубликованных научных работ, обзор которых дается в статье Купина и Мак-Гарвея с 400 ссылками на литературу [43]. [c.306]

Оригинальный прием хроматографического разделения энантиомеров использован в работе [296[. Ее авторы применили хроматографическую колонку, заполненную силикагелем с привитыми протеазами трипсином и а-химотрипсином, для разделения метиловых эфиров В,Ь-аминокислот. При этом в полной мере реализуется стереоспецифическая способность данных ферментов к расщеплению эфирных связей только в эфирах Ь-аминокислот. При введении в хроматографическую колонку (авторы называют ее ферментативным реактором) смеси метиловых эфиров В,Ь-аминокислот происходит количественный ферментативный гидролиз Ь-формы. Высокая условная энантиоселективность разделения для ароматических кислот от 2,5 до 17,6 связана не столько с селективным распознаванием, сколько с заметными различиями в хроматографических свойствах свободной аминокислоты и ее метилового эфира. Другой, не менее эффективной, возможностью создания белковых хиральных фаз может оказаться закрепление на поверхности силикагеля моноклональных антител на определенный хиральный оптически активный субстрат, хотя в этом случае может возникнуть вопрос об универсальности использования таких сорбентов. [c.448]

Применение газовой хроматографии для аминокислотного анализа лимитировалось несколькими факторами. В литературе можно найти много методов, явно удовлетворительных в руках их авторов, которые оказалось трудно или невозможно воспроизвести в любой другой лаборатории. Хорошей хроматографической методике свойствен выбор и проверка произвольных величин для ряда взаимосвязанных переменных — носителей, жидких фаз, температур и т. д. Если принять во внимание дополнительные переменные, связанные с выбором производных и метода синтеза, то неудивительно, что множество работ имеет мало общих точек соприкосновения и в каждой из этих работ говорится о каких-либо улучшениях или преимуществах. На этом основании доверие к ГХ как практическому методу определения аминокислот поколебалось. Те же особенности усложняли и написание обзора литературы, так как многоразмерная матрица, определяемая всеми переменными, ни в коей мере не являлась полностью исследованной. Часто объяснение, выдвигаемое в одной работе, нельзя подтвердить ссылкой на другую Например, производные, полученные в процессе А, анализируются одним исследователем на колонке типа X, и при этом пик аргинина не обнаруживается, другой автор получает производные по схеме В, анализирует их на колонке У и указывает пик аргинина. Неизвестно, то ли первому исследователю не удалось получить желаемое производное аргинина, то ли он [c.87]

В некоторых случаях, однако, выгодно применять реакционноспособный газ. Это можно рассматривать как средство, увеличивающее гибкость хроматографического метода. Восстановительную способность водорода, например, можно использовать для упрощения детектирования и калибровки при хроматографическом анализе альдегидов, получаемых окислением аминокислот [142]. Пары альдегида в водороде пропускают в качестве газа-носителя через нагретую колонку, расположенную между аналитической колонкой и детектором и заполненную никелем, нанесенным на кизельгур. Пары альдегида в водородной среде подвергаются крекингу в метан и воду, причем вода удаляется в осушительной колонке. Таким образом, единственным веществом, проходящим через детектор, является метан. Это упрощает калибровку, поскольку для получения количественных результатов необходимо знать только число углеродных атомов в альдегиде и величину сигнала детектора по отношению к метану. Кроме т го, детектор может работать при комнатной температуре без опасности конденсации компонентов пробы. [c.98]

Нейтральные вещества можно отделить от кислот или оснований, фильтруя пробу через ионообменники. Содержащиеся в водных растительных экстрактах алкалоиды можно концентрировать следующим образом. Подкисляя экстракт, сначала получают их сильно гидрофильные соли, затем экстрагируют липофильные компоненты межклеточного вещества органическим растворителем, например хлороформом, далее переводят свободные основания алкалоидов в щелочную форму и экстрагируют их хлороформом. Подобным образом можно повысить содержание липофильных кислот, но при этом кислотную обработку и перевод в щелочную форму проводят в обратном порядке. Для концентрирования ряда соединений можно использовать большинство видов колоночной хроматографии ( (хроматографической фильтрации). При работе с сухим исходным материалом экстракцию обычно ведут в аппарате Сокслета растворителями различной полярности. Например, в результате фильтрации водных растительных экстрактов в колонке, заполненной порошкообразным полиамидом, удерживаются соединения фенольного типа, а другие растворимые в воде соединения, например сахара, аминокислоты и т. п., проходят через колонку. Оставшиеся в колонке соединения можно элюировать мета- [c.87]

Что касается скорости, чувствительности и стоимости, любой из газохроматографических методов выгодно отличается от существующих автоматических анализаторов на смоле, но последние удобнее и проще в обращении. Более широкое использование ГХ будет зависеть главным образом от развития автоматизированных методов. Нетрудно представить себе прибор с помещенным в нем рядом образцов пептидов или белков, которые обрабатываются по очереди определенными реагентами и затем по одному подаются на хроматографическую колонку в ходе элюирования пики идентифицируются, интегрируются, а результаты печатаются в виде количества наномолей аминокислоты. Сароф (личное сообщение) уже работает в этом направлении, используя газофазное получение производных. Реагенты для приготовления ТФА-метиловых эфиров проходят вместе с газом-носителем над образцом, который затем упаривают в токе горячего газа и подают на колонку. Следует отметить, что при метилировании раствором НС1 в метаноле может протекать алкоголиз пептидов и белков, что позволяет обойтись без длительной и утомительной стадии гидролиза [11]. Сароф также снизил время элюирования менее летучих аминокислот и отказался от программирования температуры, применив колонку из трех секций с уменьшающейся температурой, каждая секция работает в изотермическом режиме [84]. С помощью кранов между секциями аминокислоты направляются или на следующую секцию, или же непосредственно в детектор. Этот метод должен облегчить автоматизацию, ускорить разделение и значительно увеличить срок службы колонки. [c.132]

Предпринимались также попытки проведения полного анализа аминокислот на одной колонке, что сокращало время анализа и, кроме того, уменьшало количество анализируемого продукта. В этом направлении наибольших успехов достиг Гамильтон с сотрудниками [2, 22], которому удалось на основе теоретического исследования процесса элютивной хроматографии аминокислот предложить разделительные колонки высокого разрешения. Ниже мы кратко из.иагаем работу Гамильтона, Богю и Андерсона [31], посвященную теории элютивного хроматографического анализа аминокислот. Вводится понятие коэффициента разделения Кл соседних пиков аминокислот а и и, поскольку форма пиков при элютивной хроматографии имеет гауссову форму, этот коэффициент может быть записан следующим образом [c.152]

В этом отношении весьма интересной является работа [30], в которой проведено исследование диссоциации хлоргидратов и ацетатов метиловых эфиров 20 аминокислот при хроматографическом анализе их па двухметровой колонке с неопентилгли-кольсукцинатом, нанесенным на флюоропак 80. Указанные соли легко диссоциируют при температурах, которые обычно используются при анализе эфиров аминокислот в виде свободных осно- [c.261]

Так, в работе [300[ поверхность силикагеля обрабатывали продуктом взаимодействия 3-аминопропилтриэтоксисилана с хлорметилированным линейным полистиролом с последующей прививкой Ь-оксипролина по хлорметильным группам. В этом случае полимерный слой прочно связан с поверхностью силикагеля за счет взаимодействия триэтоксисилильных групп с силанольными, что позволяет эксплуатировать полученную хиральную фазу для разделения В,Ь-аминокислот в варианте лигандообменной хроматографии в сравнительно жестких условиях слабокислые (pH = 4,0ч-4,5) водные элюенты, термостатирование хроматографической колонки при температурах до 80° С. [c.448]

Наряду с одноколоночным анализом в непрерывном градиенте был разработан одноколоночный анализ в ступенчатом градиенте [8]. Вначале этот метод сильно уступал по эффективности двухколоночной схеме анализа время анализа белкового гидролизата составляло 38 ч. Разделение проводили на колонке (0,63X100 см) с амберлитом Щ-120 (20—40 мкм) в трех буферных растворах с pH 2,95 4,15 и 5,0 при 40 и 50 °С. Удовлетворительное разделение этим методом достигалось при правильном выборе градиента и тщательном подборе прочих условий анализа. Дальнейшее развитие этой схемы шло по линии сокращения времени анализа, т. е. повышения эффективности, а также повышения хроматографического разрешения при анализе нингидринположительных компонентов из биологических материалов. В результате продолжительность анализа белковых гидролизатов была доведена до 260 мин [40]. При анализе физиологических жидкостей основная задача состоит в том, чтобы разделить все имеющиеся компоненты на одной колонке и определить объемы их выхода в идентичных условиях. В связи с этим следует отметить работу Гамильтона [41], в которой указаны объемы выхода 180 веществ. Эти данные можно использовать для идентификации компонентов физиологических жидкостей, а также для выбора условий анализа нингидринположительных веществ природных смесей. Для повышения разрешения смесей амидов и других трудноразделяемых пар аминокислот также используют буферные растворы на основе солей лития [42, 43]. [c.348]

Отдельные пики получены при хроматографировании ТМС-аминокислот на ряде силиконовых жидких фаз (таких, как 5е-30 [8, 77, 116], силиконорое масло [106], 5е-52, рр-1, ВС-200 [П4] и ПС-550 [116]). На полиэфирах и полигликолях были получены неидентифицируемые пики 114], поэтому можно с уверенностью утверждать, что ТМС-производные недостаточно устойчивы для хроматографического анализа на этих жидких фазах. Ценной особенностью реакции силилирования является то, что она проходит количественно в одну стадию за короткий промежуток времени, однако без подходящих для анализа газохроматографических колонок количественное превращение не всегда осуществимо. В работах, проиллюстрированных хроматограммами, разделение ограничивалось несколькими аминокислотами [8, 106, 116]. Можно только предполагать, что достигаемое раз- [c.102]

О возрастающем интересе к применению автоанализаторов Д.ЧЯ хроматографического разделения аминокислот, пептидов и белка свидетельствует работа бельгийских авторов [47]. В этой работе описывается применение автоанализатора для хроматографического разделения аминокислот. В автоанализатор вводится как один из блоков разделительная колонка с ионообменной смолой. Пропорциональный насос автоанализатора используется для прокачивания элюирующего раствора через колонку, подачи нингидринового реактива и циркуляции воды через рубашку разделительной колонки для ее термостатирования. В проточном реакторе автоанализатора проводится нингидриновая реакция. Автор работы указывает, что благодаря фрагментации элюата с помощью пузырьков азота удается использовать в реакторе широкую (2 мм) стеклянную капиллярную трубку, что исклю- [c.177]

Эфиры аминокислот в виде свободных оснований нестабильны и даже при комнатной температуре легко превращаются к дике-топиперазины, причем скорость этого превращения зависит от структуры аминокислоты и характера алкильной группы эфира. Поэтому многие авторы исследовали возможность применения в хроматографическом анализе хлоргидратов различных эфиров аминокислот или некоторых их солей. Сароф с сотрудниками [29] изучали разделение хлоргидратов этиловых и бутиловых эфиров аминокислот при добавлении аммиака к потоку газа-носителя (N2). При этом на двухметровой колонке с полинеопентилгликоль-сукцинатом (22% на хромосорбе ) оказалось возможным осуществить лишь неполное разделение низкокипящих эфиров аланина, глицина, валина, изолейцина, лейцина и пролина, а также лизина и оксипролина. Степень образования амидов в зависимости от длины колонки, температуры и других параметров хроматографического разделения в данной работе не определялась. [c.261]

Отметим еше ряд особенностей анл.гшзатора В 500. Скорость анализа заметно улучшается при миниатюризации системы хроматографического разделения. Система В 500 рассчитана на работу при высоких давлениях с использованием колонок из нержавеющей стали. Давление в системе может достигать 211 кг/см . Используется одноколоночная методика, причем размеры колонки уменьшаются до 43 см х 1,75 мм, в качестве заполнителя применяют шарики катионообменной смолы диаметром 10 2 мкм. Чтобы полностью реализовать возможности системы с управляющей ЭВМ, применяется восемь линий подачи буфера и окрашивающего реагента и четыре насоса с двойными шприцами и гидравлическим приводом, способные к плавной работе при давлении -211 кг/см . Развитие окраски с нингидрином контролируется при 150 °С, что устраняет необходимость во втором фотометрическом канале для детектирования пиков пролина и оксипролина, что существенно при использовании температуры 50 - 70 °С. Фотометрический блок представляет собой двухлучевой фотометр с модуляцией по длине волны. В качестве датчика в фотометре применяется фотодиод с линейной зависимостью сигнала от коэффициента поглощения в пяти диапазонах 0,1, 0,2, 0,5 1,0 и 2,0 единиц коэффициента поглощения. Чтобы свести к минимуму перекрывание пиков, используется кювета с небольшим оптическим путем /0,5 см). Кювета попеременно освещается излучением 590 нм (измерение) и 690 нм (контроль фона). Сигналы фотодиода подаются параллельно на самописец с диаграммной лентой и в ЭВМ, принимающую 600 точек в минуту. Стабильность фотометра такова, что для 1 нмоля аминокислоты отношение сигнала к щуму равно 30 1. Вследствие этого исходные объемы проб могут быть небольшими, порядка 10—20 мкл. [c.301]

Вестли и др. [259] провели систематическое исследование влияния структуры диастереомеров эфиров и амидов аминокислот на их разделение. В работе , [261] описана методика газо-хроматографического анализа плохо поддающихся разделению рацематов аспарагиновой кислоты, триптофана и аминокислот, содержащих гидроксильную или сульфгидрильную группу. Эта же методика была использована для определения аминокислот в метеоритах [268, 269, 272], для оценки оптической чистоты меченных 1 С аминокислот [277], а также для установления конфигурации алло-изолейцина, присутствующего в плазме крови больных кетоацидозом [270]. В работе [278] описано разделение аминокислот в виде их 3,3-диметил-2-бутиловых эфиров на насадочных колонках. Оптическая чистота 14 полученных диастереомеров соответствовала 93% и более исключение составили лишь аспарагиновая кислота и пролин, оптическая чистота которых составляла соответственно 70 и 82%. [c.82]

В конце 70-х — начале 80-х годов происходил взрывообразный рост числа публикаций по ВЭЖХ ФТГ-производных аминокислот, причем в разных лабораториях работали на разных приборах, колонках и применяли разные буферы. Поэтому новичку трудно сделать правильный выбор условий разделения. В этом разделе описываются те системы, относительно кото-рых мы имеем личный опыт. Замечания и оговорки, относящиеся к этим и другим системам, помогут читателю сделать выбор хроматографической системы. [c.406]

Актуальность дополнительной обработки для стабильной работы колонки становится очевидной из результатов исследований воспроизводимости хроматографического разделения при длительном использовании колонок в экстремальных для белка условиях. Так, например, в работе [55] указано, что при длительной (несколько недель) экспозиции колонок с сорбентами Separon НЕМА 1000-BSA и Separon НЕМА 1000-BIO-BSA при pH = 10 времена удерживания уменьшаются для монокарбоновых и аминокислот и увеличиваются для дикарбоновых, причем скорость этих изменений возрастает при введении в элюент пропанола или канри-ловой кислоты (до 3%) в качестве органических добавок. Очевидно, здесь имеет место частичная денатурация иммобилизованного белка, в результате которой изменяются некоторые стерические факторы, критически влияющие на механизм удерживания. [c.553]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология