Ферментативная активность, количественное

Рис. 9-7. Количественное определение ферментативной активности. Эта процедура проводится в три этапа 1) определение /С (рис. 9-4 и дополнение 9-2), 2) измерение начальных скоростей (А) при различных концентрациях фермента и при концентрации субстрата, близкой к насыщающей, например при концентрации, равной 10 Км.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ [c.68]

Мы остановились на этих примерах, чтобы показать возможности расшифровки взаимодействий между активным центром фермента и лигандами. Химия выявляет поведение функциональных групп фермента и кофакторов. Однако этого недостаточно для количественного объяснения ферментативной активности, характеризуемой понижением энергии активации. Для ферментативного катализа необходима вся белковая глобула. Нельзя отрезать часть белковой цепп без ущерба для активности фермента. Химия не отвечает на вопрос о роли глобулярной структуры, описывая лишь события в активном центре. Эти задачи стоят перед физикой. [c.186]

Наличие у мальтозы редуцирующей способности делает возможным количественное ее определение в растворе. Таким образом, по скорости образования мальтозы из крахмала в присутствии исследуемой вытяжки можно судить об интенсивности процесса осахаривания крахмала и, следовательно, о ферментативной активности амилазы в исследуемой жидкости. [c.123]

Кирквуд считал механизм флуктуационного взаимодействия фермента и субстрата универсальным и определяющим явление ферментативной активности в целом [97, 98, 100]. Все изложенное показывает, что за ферментативную активность ответствен ряд факторов, и здесь весьма важны конформацнонные явления. Теория Кирквуда не решает проблему. Вместе с тем и механизм Михаэлиса, и механизм Кирквуда отражают реальные свойства полиэлектролитной системы. Остается неясным, в какой мере, так как отсутствуют строгие количественные оценки и получить их трудно. [c.397]

Несомненно, что все рассмотренные выше эффекты дают свои вклады в ферментативную активность. Однако количественные оценки здесь недостаточно достоверны и не решают проблему. [c.399]

Все это, однако, совершенно не исключает для советских биологов необходимость вести аналитические работы по изучению природы отдельных физиологических процессов. В этих работах применяется все разнообразие методов исследования и изучение кинетики отдельных процессов, и упрощение и вычленение отдельных звеньев процессов или структур (например, изучение фотохимической и ферментативной активности изолированных хлоропластов, хлорофилла в растворах), и математический анализ кинетических и других количественных данных и т. д. [c.286]

В изложенных выше исследованиях моделированы свойства фермента как среды реакции, что позволяет количественно оценить соответствующий вклад в ферментативную активность. Как можно найти этот вклад теоретически [c.404]

Очевидно, что скорость ферментативной реакции в присутствии ингибитора будет определяться концентрацией активного комплекса [ES], а она, в свою очередь — концентрацией ингибитора [I], константой ингибитора Ki и кинетическими константами самой ферментативной реакции. Количественная оценка действия ингибитора может быть дана путем расчета Ki по экспериментально определяемой скорости реакции в присутствии ингибитора при известных концентрациях реагирующих веществ. [c.84]

Используя ДНК-содержащие микрогели и галлоцианин как краситель, можно обнаружить 0,1 нг дезоксирибонуклеазы [1482]. Применение для фракционирования дезоксирибонуклеаз полиакриламидного геля, содержащего Н-ДНК, улучшает результаты их количественного определения. После электрофореза гели разрезают и инкубируют в соответствующем буфере. Ферментативную активность определяют по количеству выходящих в среду радиоактивных фрагментов. Величина этой радиоактивности пропорциональна количеству фермента в пределах от 10 до 0,1 нг, а воспроизводимость определений составляет 5%. [c.295]

Ферментативная активность зависит от степени диссоциации ионогенных групп, которая изменяется с изменением pH среды, что приводит к различному количественному взаимодействию субстрата с ферментом. [c.28]

Ингибирование субстратом. Согласно уравнению Михаэлиса — Ментен (6.8), при увеличении концентрации субстрата начальная скорость ферментативной реакции гиперболически возрастает, стремясь к своему предельному значению. Однако в ряде случаев при увеличении концентрации субстрата начальная скорость ферментативной реакции проходит через максимум и затем уменьшается (рис. 88). Обычно подобный тип зависимости v от [S] можно количественно описать исходя из предположения об образовании тройного комплекса SES, не обла-даюш,его ферментативной активностью [c.235]

При поглощении квантов света светочувствительными пигментами, хромофорные молекулы которых встроены в мембраны клетки, наблюдаются конформационные изменения белковых участков молекулы фитохрома, а через них и мембранных образовании, что приводит к изменению условий ферментативного катализа. Количественное содержание и активность липоксигеназы могут контролироваться иа генном уровне и зависеть от концентрации промежуточных или конечных продуктов в биохимической цепи реакций. Липоксигеназа, участвуя во вторичном окислении каротиноидов, приводит к образованию продуктов [c.484]

Пример количественного анализа ферментативной активности определение содержания дегидрогеназы [c.68]

Количественное определение ферментативной активности 68 [c.376]

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ АНАЛИЗ, количественный хим. анализ с использов. ферментов. Достоинства методов Ф. а. обусловлены избирательностью действия ферментов и их высокой активностью, позволяющей проводить анализ в мягких условиях. С помощью Ф. а. определяют в-ва, к-рые влияют яа скорость ферментативных р-ций субстраты (т. е. в-ва, претерпевающие хим. превращение), эффекторы (ингибиторы или активаторы р-ции) и сами ферменты (в первую очередь при анализе биол. жидкостей в клинич. лабораториях). Концентрацию в-ва устанавливают по абс. значению или по изменению скорости ферментативной индикаторной р-ции в присут. определяемого в-ва (кинетич. методы) концентрацию субстрата можно также рассчитать по кол-ву образовавшегося продукта после завершения р-ции или достижения равновесия (Стехиометрич. методы). Ферментативные индикаторные р-ции в зависимости от числа участвующих ферментов подразделяют на индивидуальные и сопряженные в последнем случае использ. последовательные р-ции, как правило, биферментные, когда продукт первой (вспомогательной) служит субстратом для второй (индикаторной), в к-рой образуется легко детектируемый продукт. Контроль за скоростью р-ции осуществляют электрохим., спектрофотометрич., люминесцентными и др. методами. [c.617]

Попытки непосредственно показать взаимопревращение пи-ридоксаминфосфат-ферменга и пиридоксальфосфат-фермента до сих пор были безуспешными , по-видимому, вследствие ряда экспериментальных трудностей, обусловленных тем, что в соединение с ферментом вступает лишь очень небольшое количество кофермента и при этом отсутствует достаточно хороший метод количественного отщепления и определения связанного с ферментом кофермента. Задача осложняется еще и тем, что добавленный синтетический кофермент может присоединяться к белковой молекуле фермента не только там, где он необходим для проявления ферментативной активности, но и в других ее участках. Исследования с применением кофермента, меченного радиоактивным фосфором, позволили обнаружить неспецифическое [c.251]

Наличие йода и нитрогруппы в пара-положении к тетразо-цепи придает ИНТ высокую чувствительность к восстановлению [67—70]. Поэтому ИНТ может с успехом применяться для количественного определения ферментативной активности, основанного на вымывании образующегося из ИНТ формазана органическим растворителем и его кoлopимeтpиpoвa НИИ [71]. ИНТ применяют также при исследованиях функции печени, почек, сердца [72], растительных и животных опухолей [73], [68], для определения качества свежезамороженной рыбы, основанного на количественном определении ферменг тов, выделяемых гнилостными бактериями на поверхности рыбы [74], для локализации моноаминооксидазной активности [75]. [c.136]

Таким образом, при обеззараживании воды УФ-излучением угнетается дегидрогеназная и декарбоксилазная активность кишечной и брюшнотифозной палочек. Ферменты кишечной палочки более резистентны к воздействию УФ-излучения по сравнению с брюшнотифозной палочкой. Под влиянием ультрафиолетовых лучей происходят глубокие нарушения в молекуле ДНК кишечной и брюшнотифозной палочек за счет количественного сдвига в пиримидиновых основаниях. Изменяется показатель специфичности. С помощью электронной микроскопии выявлены изменения в морфологии кишечной палочки, выразившиеся в нарушении проницаемости протоплазмы, повреждении клеточных оболочек и исчезновении жгутиков. Штаммы S. typhi с измененной под влиянием УФ-излучения ферментативной активностью способны восстанавливать ее с сохранением вирулентности для белых мышей и должны рассматриваться как возможные возбудители брюшного тифа. [c.139]

Одновременно с изучением эффективности и фитоцидности жидкого и гранулированного ГХБД изучалось их влияние на микробиологические процессы, протекающие в почве, т. к. на их течение может оказывать влияние не только химический состав, но и форма применяемых соединений (1). Выбор показателей, характеризующих состояние полезной почвенной микрофлоры, сделан нами на основании накопленного опыта и литературы. Проведенные микробиологические исследования включали изучение количественного состава почвенной микрофлоры по отдельным группам, биологической и ферментативной активности почвы и ее нитрофицирующей способности в продолжении 2-х лет после закладки опыта. [c.43]

Наконец, было показано, что все воздействия на.кристаллические препараты ферментов, отражающиеся на ферментативной активности, вызывают и строго параллельные изменения, денатурацию белка. Наоборот, любые воздействия, вызывающие денатурацию белка, приводили к соответстаую-шему понижению ферментативной активности. Это явилось доказательством того, что имелось четкое количественное соотношение между белком и связанной с ним ферментативной активностью. [c.156]

Гипотеза двух групп допускает простое математическое описание, а качественная картина ясна из общих соображений. При малых значениях pH обе рассматриваемые группы будут протонированными, и в связи с этим фермент окажется неактивным. При высоких pH обе группы лишены протонов, в связи с чем фермент также окажется неактивным. И только в области pH, лежащей между рК1 и рКг, значительная часть фермента содержит одну протонированную и одну депрото-нированную группу, что по сделанному предположению отвечает активной форме. Количественная обработка этой гипотезы сводится к подсчету концентрации промежуточной формы фермента с помощью двух констант ионизации и Кг для соответствующих групп. Формальная сторона задачи совпадает с изучением диссоциации двухосновной кислоты, что в свое время было использовано Михаэлисом в кинетике ферментативных реакций для описания кривой зависимости ферментативной активности от pH. Если через ЕНг, ЕН и Е обозначить три рассматриваемые формы фермента, из которых активна только ЕН , то сказанному отвечает схема [c.75]

Ферментативная активность церулоплазмина была впервые описана Холмбергом и Лоуреллом [46], которые показали, что это единственный фермент, катализирующий окисление полиаминов и полифенолов в плазме. Катализируемая церулоплазмином реакция окисления п-фенилендиамина и других аналогичных соединений используется обычно для количественного определения белка в растворе [31, 47, 48]. Однако не было замечено, чтобы церулоплазмин играл сколь-нибудь существенную физиологическую роль при окислении таких важных биологических субстратов, как адреналин, норадреналин, серотонин, катехоламин или допамин [49]. [c.369]

Металло-КПА, не катализирующие гидролиз, могут тем не менее присоединять субстраты. При образовании комплексов дипептидов или ацилпептидов с Сд-, Си- и Нд-КПА происходит изменение скорости обмена металлов. В качестве примера можно привести присоединение ГФЛ к неактивной Си-КПА [88]. Количественные данные по константам связывания отсутствуют, однако само сохранение связывания означает, что утрата ферментативной активности не является следствием потери способности присоединять субстрат в активном центре. [c.544]

Метод количественного онределения фермента в капле крови позволил А. Н. Баху ежечасно учитывать активность каталазы и протеазы в течение суток. При этом оказалось, что в крови животных и человека эта активность подвергается весьма существенным изменениям в зависимости от времени взятия проб для анализа. Этот установленный А. Н. Бахом суточный ритм ферментативной активности имеет выдающееся общебиологи-ческое значение. Впоследствии он был подтвержден и развит в работах Института биохимии Академии Наук СССР на многочисленных растительных объектах. [c.666]

Из разрушенного смесью фенол — вода нуклеопротеина TMV Анде-рер [55] смог иыде.лить белок TMV (из фенольного раствора). Выделенный белок снова соединялся с нуклеиновой кислотой TMV с образованием кристаллического нуклеопротеина TMV. Это показывает, что белок не денатурируется в жидком феноле необратимо. Кикхефен [56] недавно показал, что различные ферменты — рибонуклеаза, химотрипсин, трипсин, лизоцим и др.— после растворения в жидком феиоле можно количественно выделить сходным способом без потери ими ферментативной активности. Некоторые ферменты даже выдерживают нагревание в фенольном растворе до 80—100°. [c.331]

При изучении гомогенности можно отдать предпочтение любой легко определяемой биологической активности, особенно ферментативной активности, которая имеется в исходном материале и относительно которой можно определенно предполагать, что она не связана с изучаемым гликонротеи-ном [601. Например, сыворотка эмбриона теленка содержит вещество, которое способствует соединению клеток данной культуры, и эта биологическая активность была использована Спиро [901 как показатель гомогенности препаратов фетуина. Фетуин не обладает этой активностью, хотя она сопровождает его на ранних стадиях фракционирования. Проба на ферментативную или иную постороннюю биологическую активность является ценной для установления гомогенности конечного продукта только тогда, когда показано, что в используемых условиях фракционирования не происходит инактивации. Полученные этим путем доказательства еще более вески, если можно показать, что фермелтативнан или иная активность количественно удалена в побочных фракциях. [c.55]

Параллельно этим кинетическим исследованиям в некоторых важных препаративных работах было показано, что при низких значениях pH удается выделить устойчивое моноацетильное производное химотрипсина [395, 396]. Это моноацетильное производное является промежуточным соединением [FerS в уравнении (71)], образующимся при каталитическом разложении п-нитрофенилацетата химотрипсином. Оно не проявляет ферментативной активности, но легко отщепляет ацетильную группу. Ацетил-химотрипсин реагирует с водой, образуя уксусную кислоту, а со спиртами (предпочтительно с первичными)— даже в разбавленных водно-спиртовых растворах— образует соответствующие эфиры уксусной кислоты [397]. В обоих случаях ферментативная активность восстанавливается количественно- Было приготовлено [c.145]

Наличие разных моноклональных антител к одному и тому же продукту лежит в основе количественного иммунологического анализа белка методом сэндвича , когда одно антитело используется в качестве твердой фазы для связывания присутствующего в растворе антигена, а другое антитело используется в качестве меченого зонда для обнаружения иммобилизованного материала. Хотя мы работали как с зондами, меченными так и с зондами, меченными ферментативно активными конъюгатами (в последнем случае обычно к антителам присоединяли биотин и использовали конъюгат фермента с авиди-ном), здесь мы приводим описание только первой методики, поскольку в нашей практике она оказалась более удобной. Этот метод пригоден также и для выяснения следующего вопроса о том, конкурируют ли между собой антитела за взаимодействие со стерически тесно ассоциированными участками, а также для изучения белок-белковых взаимодействий. [c.197]

Другой, по-видимому чаще используемый, подход основывается на количественном исследовании ферментативной активности в случаях с хромосомными аномалиями. Большинство ферментов характеризуются четко различимым эффектом дозы гена, т.е. гетерозиготы по ферментативной недостаточности обнаруживают примерно 50%-ную ферментативную активность. Сходный эффект дозы гена можно ожидать и в том случае, когда ген теряется вследствие делеции. Такой подход к картированию использовался для большого числа генетических маркеров. Чаще всего результат оказывался отрицательным, но такого рода исключающее картирование полезно тем, что может сузить область вероятной локализации генов-маркеров. Следует, правда, учесть, что на основе этого подхода были сделаны и неправильные выводы, поскольку наличие молчащего (нулевого) аллеля, т.е. непроявляющейся мутации, может имитировать эффект делеции. [c.199]

Трудности в выявлении гетерозигот. Если о гетерозиготности судят по уровню ферментативной активности или на основании какого-либо количественного анализа крови, часто возникают осложнения, связанные с перекрыванием значений. Методы поиска гетерозигот могут заметно различаться для носителей аутосомно-рецессив-ных или сцепленных с Х-хромосомой мутаций, с одной стороны, и для носителей гена аутосомно-доминантного заболевания, с другой. В большинстве случаев средние уровни анализируемого вешества у гетерозигот и у нормальных индивидов достоверно различаются. Однако при этом, как правило, имеет место значительное перекрывание выборочных распределений, так что многие здоровые люди по уровню анализируемого вешества могут быть ошибочно приняты за гетерозигот. Причины этого явления не вполне ясны, возможно, оно связано с сушествованием невыявлен-ных изоаллелей , каждый из которых определяет свой диапазон уровней ферментативной активности (разд. 3.6). При использовании количественных тестов для правильной интерпретации результатов важно оценить априорную (или байесовскую) вероятность гетерозиготности. [c.59]

На рис. 55, а показаны кривые зависимости остаточной ферментативной активности мышечной изоформы ЛДГ от времени облучения. Для количественного описания данного процес- [c.188]

В большинстве случаев способ обнаружения фермента состоит в том, что электрофореграмму разрезают на небольшие участки, элюируют из них фермент и определяют его активность обычными методами. Такая методика позволяет проводить количественное определение ферментативной активности, однако иногда при этом снижается степень разрешения, поскольку фрагменты геля, как правило, шире, чем зоны разделенных белков. С точки зрения разрешающей способности более предпочтительными являются методы локализации ферментов in situ. Краткое описание таких методов дается в настоящей главе. [c.279]

ВОЛЬНО часто, проблеме количественного анализа энзимограмм до сих пор уделялось сравнительно мало внимания. При этом нередко применяют методы, широко используемые для определения белков в зонах, окрашенных специфическими белковыми красителями. Энзимограммы сканируют с помощью денситометров и вычисляют площади пиков, которые служат мерой ферментативной активности. Другие методы количественной оценки ферментов- основаны на элюции и последующем определении ферментативной активности в растворе или на элюции окрашенного продукта, образовавшегося под действием фермента in situ. [c.282]

Изящный вариант каскадной методики такого типа был продемонстрирован недавно на примере выделения цитрат-син-тетазы (К. Ф. 4.1.3.7) и фумаразы (К. Ф. 4.2.1.2) с использованием одной и той же аффинной колонки, содержащей пиромел--литовую кислоту (ПМК), присоединенную к сефарозе 4В через пространственную группу диаминопропанола. Экстракт ткани наносят на колонку с ПМК-сефарозой 4В в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,3), содержащем 0,01 М меркаптоэтанол. Цитрат-синтетаза сорбируется полностью, в то время как связывание фумаразы в присутствии фосфата подавляется (фосфат — конкурентный ингибитор этого фермента). Цитрат-синтетазу элюируют тем же буфером, содержащим 0,01 М лимонную кислоту. Полученный элюат наносят на колонку с гелем голубой сефарозы 4В, где фермент связывается количественно, и далее элюируют 0,01 М фосфатным буфером (pH 7,3), содержащим меркаптоэтанол (но не содержащим лимонной кислоты). Фракцию фумаразы, не сорбированную на ПМК-сефарозе 4В в условиях элюирования фосфатом и содержащую 100% ферментативной активности, подвергают диализу против 0,01 М трис-ацетатного буфера (pH 7,3), содержащего 0,014 М меркаптоэтанол и наносят на колонку с ПМК Сефарозой 4В в указанном буфере. При этом наблюдается количественное связывание фермента, элюирование которого проводят в присутствии ь-яблочной кислоты и далее, после удаления последней, фумаразу сорбируют на колонке с голубой сефарозой, а затем проводят элюирование, вновь добавляя яблочную кислоту в рабочий трис-ацетатный буфер. [c.190]

Другие методики. Когда определение ферментативной активности или прямые измерения радиоактивности не подходят для контроля элюирования, следует рассмотреть другие возможности для анализа связывания. Наибольшего внимания в качестве общего чувствительного метода количественного измерения подвижного компонента заслуживает, по-видимому, радиоиммуноанализ. Кроме того, может оказаться целесообразным измерение количества элюированного подвижного компонента с помощью количественного лигандсвязывающего анализа, например в случае доступности радиоактивно меченного лиганда, аналогичного по структуре иммобилизованному лиганду. [c.232]

Перспективный метод ИФА основан на применении антител, иммобилизованных на водорастворимом полимере. Принцип анализа состоит в следующем. К раствору иммобилизованных на полианионе антител добавляют определяемый и меченный ферментом антиген и проводят реакцию конкурентного связывания. Для разделения свободного и связавшегося в комплексе конъюгата вносят поликатион, который быстро и количественно образует с полианионом нерастворимый поликомплекс. После разделения жидкой и твердой фаз регистрируемая в надосадочном растворе или осадке ферментативная активность дает информацию о начальной концентрации исследуемого антигена. Для удобства измерения активности полученный осадок может быть вновь легко растворен при увеличении ионной силы. [c.112]

Второй новый метод требует применения техники рекомбинантных ДНК и клонированных зондов ДНК для идентификации и количественной оценки аллельного полиморфизма. К настоящему времени выявлено более 100 полиморфных генов в геноме человека и установлена их хромосомная локализация банк этих данных быстро увеличивается. Они оказываются чрезвычайно удобными маркерами, даже если эти гены не экспрессируются в структурные или ферментативно-активные белки. Окрининг этих маркеров с помощью блоттинга по Саузерну в настоящее время используется, хотя и в небольших масштабах, при идентификации клеточных линий [32]. [c.146]

Методы иммуноанализа, предназначенные для нелабораторного использования, должны требовать лишь минимальной калибровки или вовсе ее не требовать и должны давать надежные результаты при самых разных внешних условиях. Можно ожидать, что иммунохроматографический анализ мало чувствителен к продолжительности инкубации и температуре, поскольку количественное определение в этом методе не базируется на точном измерении ферментативной активности. Результаты, согласующиеся с этим предположением, были получены при построении калибровочных кривых для определения теофиллина при различных температурах (рис. 10-18). Как видно из рисунка, расстояние миграции существенно не зависит от температуры в интервале от 4 до 37 "С. В другой серии опытов (данные не представлены) варьировали время последовательной инкубации индикаторных полосок в ферментном реагенте и проявителе. Хотя при увеличении времени инкубации до 30 мин в каждом реагенте результаты количественного определения не изменяются, продолжительная инкубация приводила к получению расплывчатых окрашенных зон и снижению воспроизводимости. Вероятно, это обусловлено совместным влиянием диффузии и испарения растворителя. [c.154]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология