Нуклеиновые кислоты денатурирование

Освободить препараты нуклеиновых кислот от белка можно также путем обработки их солевого экстракта двойным объемом хлороформа, содержащего немного изоамилового спирта после тщательного перемешивания в течение 15 мин до получения стойкой эмульсии смесь центрифугируют и отделяют верхнюю водную фазу, содержащую нуклеиновые кислоты (денатурированный белок остается на границе водного и хлороформного слоев) нуклеиновые кислоты из водной фазы осаждают двойным объемом охлажденного этанола. [c.190]

Опыты по гибридизации позволили исследовать гомологичность нуклеиновых кислот из разных источников. Вначале молекулы расщепляют (например, с помощью ультразвука) на фрагменты длиной 1000 нуклеотидов и подвергают денатурации. Фрагменты денатурированной ДНК смешивают с денатурированной ДНК из другого источника. Участки ДНК разных видов, имеющие близкие нуклеотидные последовательности, в той или иной степени гибридизуются, тогда как участки с сильно различающимися последовательностями гибридизации не поддаются. Рассмотрим один из вариантов постановки таких экспериментов. Денатурированную ДНК определенного организма, не подвергавшуюся деградации, заключают в агаровый гель [90] или наносят на нитроцеллюлозный фильтр [91]. Фрагменты ДНК из другого источника пропускают через колонку с ДНК-содержащим агаром или через фильтр с абсорбированной ДНК. Комплементарное спаривание соответствующих фрагментов задерживает их на колонке или фильтре, тогда как фрагменты, не нашедшие себе партнеров , свободно проходят дальше. [c.143]

Спирализация ДНК отчетливо проявляется в ее спектральных свойствах — в эффекте гипохромизма в области собственного поглощения азотистых оснований при 2600 А (см. стр. 288—290). Интенсивность полосы поглощения 2600 А у двуспиральной нуклеиновой кислоты значительно меньше, чем у денатурированной формы. Степени спиральности ДНК и РНК определяются по гипохромному эффекту без труда. [c.498]

Роль Н-связи при денатурировании нуклеиновых кислот. [c.354]

Нативную ДНК можно отделить от денатурированной ДНК и комплексов ДНК-РНК хроматографией на нитроцеллюлозе, причем порядок выхода нуклеиновых кислот при ступенчатом элюировании будет обратным порядку выхода из колонки с гидроксиапатитом [57, 78]. Путем модификации существующей техники хроматографии на нитроцеллюлозе [79] достигнута почти 100-кратная очистка меченой ДНК [80]. [c.75]

До сих пор мы говорили лишь о тепловой денатурации ДНК, обусловленной энтропийной выгодностью денатурированного клубкообразного состояния. Энергия молекул ДНК и других нуклеиновых кислот меньще в спиральном состоянии, которое поэтому является устойчивым при достаточно низких температурах. В энергетический баланс молекул нуклеиновых кислот вносят существенный вклад не только внутри- и межмолекулярные водородные связи и взаимодействие гидрофобных групп, но и электростатическое взаимодействие заряженных групп цепи. Поэтому температура денатурации нуклеиновых кислот зависит от степени ионизации макромолекул, определяемой концентрацией водородных ионов, а также от ионной силы раствора, т. е. от концентраций других низкомолекулярных ионов. [c.371]

Присоединение ароматических углеводородов. Полициклические ароматические углеводороды способны, хотя и не очень прочно, связываться с нуклеиновыми кислотами, по-видимому, за счет межплоскостного (гидрофобного) взаимодействия с ядрами гетероциклических оснований 297,298 Показано, что 3,4-бензпирен образует комплексы с ДНК . При облучении в области Я > 300 — 400 ммк в водном нейтральном растворе 3,4-бензпирен или, возможно, продукты его фотопревращения ковалентно связываются с денатурированной ДНК. Наличие или отсутствие кислорода не влияет иа ход этой реакции. ДНК в данных условиях, по-видимому, не деградирует, по крайней мере при непродолжительном облучении Место присоединения 3,4-бензпирена или его фотопродуктов к ДНК не установлено. [c.687]

Тем не менее на основании длины спирали ДНК можно заключить, что частичная денатурация вполне возможна, если последовательность нуклеотидов содержит довольно длинные участки, состоящие из гуанин-цитозиновых пар, и соответствующие промежутки, которые содержат в основном аденин-тиминовые пары. Микрофотографии ДНК, денатурированной при разбавлении ее растворов 1304], подтверждают это заключение. Нативные ДНК выглядят как длинные и довольно прямые нити, тогда как денатурированная нуклеиновая кислота образует аморфные узлы . Иногда, однако, удается наблюдать 1160, 304] остатки нитей, на концах или в центре которых находятся узлы , что указывает на то, что процесс денатурации может приостанавливаться на относительно устойчивы.х участках цепи. [c.603]

Формальдегид сильно препятствует образованию водородных связей в денатурированной ДНК [395—397[, стабилизируя довольно вытянутую конформацию ее молекул это приводит к уменьшению устойчивости по отношению к ферментативному гидролизу и намного увеличивает эффективность образования комплексов антиген — антитело [396]. На микрофотографиях ДНК, обработанной формальдегидом, видны длинные тонкие нити с диаметром, значительно меньшим, чем у нативной ДНК [397]. Очень удачные микрофотографии были получены для денатурированной ДНК, обработанной диазониевой солью 8-амино-1,3,6-нафталин-трисульфокислоты (связывающейся, по-видимому, с Сз гуаниновых остатков) с последующим прокрашиванием уранилацетатом в разбавленном растворе формальдегида. Маркер отчетливо виден на микрофотографии, и вполне вероятно, что этот метод может быть использован для электронномикроскопического определения последовательности оснований в нуклеиновых кислотах [397]. [c.608]

Денатурация ДНК под действием концентрированных растворов солей, которая обнаруживает тот же порядок чувствительности к природе соли, что и денатурация белков, может быть объяснена также влиянием солей на коэффициенты активности оснований нуклеиновых кислот, которые в денатурированной ДНК более доступны для растворителя, чем в нативной [51]. Такое поведение ДНК становится понятным, если учесть, что гетероциклические основания содержат большие диполи и построены в значительной степепи из карбонильных групп, примыкающих к атомам азота фактически они обладают свойствами циклических амидов. [c.295]

С. Образовавшуюся эмульсию охлаждают сначала при комнатной температуре до 25°С, а затем 1—2 ч в холодильнике до 4—5°С. В результате 30-минутного центрифугирования (1000 g) смесь разделяется на три слоя а) верхний водный, содержащий липополисахарид и нуклеиновую кислоту б) промежуточный фенольный, содержащий белок, и в) нижний, содержащий остатки разрушенных клеток и денатурированный белок. На поверхности раздела фенольной и водной фаз может находиться нерастворимый остаток. Водный слой отделяют с помощью сифона, а органический — дважды экстрагируют водой (400 мл), нагретой до 68 °С. Водные вытяжки объединяют и диализуют 36—48 ч против проточной воды (10°С). Получающийся при диализе раствор может быть мутноватым. Раствор упаривают до объема - 100 мл при 40°С и после центрифугирования лиофилизуют. Выход неочищенного препарата липополисахарида составляет 6—8%, считая на вес сухих клеток. Как правило, в продукте содержится приблизительно 50% липополисахарида и столько же рибонуклеиновой кислоты. [c.128]

Оксиапатпт сорбирует довольно широкий спектр биополимеров, куда входят кислые и щелочные бедки, нативные двунитевые ДНК, денатурированные однонитевые ДНК и РНК. Незаряженные макромолекулы, например полисахариды, не сорбируются, так же как аминокислоты, короткие пептиды и нуклеотиды. Нуклеиновые кислоты сорбируются прочнее, чем белки, двунитевые ДНК — прочнее, чем однонитевые. Сорбции нуклеиновых кислот и кислых белков [c.225]

Разумеется, без достаточных экспериментальных подтверждений мы не можем настаивать на таком объяснении, однако это и не так уже существенно. Важен надежно установленный экспериментальный факт для элюции нативной ДНК (или двунитевой РНК, а также гибридных молекул ДНК—РНК) с оксиапатита требуется почти вдвое более высокая концентрация фосфатного буфера, чем для элюции денатурированной ДНК или однонитевой РНК. Это обстоятельство открыло возможность быстрого и надежного отделения двунитевых молекул нуклеиновых кислот от однонитевых, что сыграло очень важную роль как в изучении структуры генома (исследования кинетики ренатурации), так и в развитии современных методов генной инженерии (гибридизация молекул НК и др.). Как и в случае кислых белков, присутствие даже относительно высоких концентраций неорганических солей в элюирующем буфере практически не сказывается на процессах элюции одно- и двунитевых молекул НК с оксиапатита. Вместе с тем, варьируя концентрацию Na l или КС1 в буфере, можно управлять изменением конформации самих нуклеиновых кислот, а также характером их гибридизации (например, отделять истинные , полноценные, гибридные молекулы от несовершенных гибридов ). [c.230]

Если в белках максимум низкоэнергетической полосы поглощения соответствует Я. г280 нм, то для полинуклеотидов Я,тах = 260 нм (38 500 см ). При исследовании оптических свойств нуклеиновых кислот особенно важной характеристикой является гипохромный эффект. В то время как поглощение денатурированного полинуклеотида примерно равно суммарному поглощению его компонентов, при образовании двухцепочечной структуры с укладкой оснований одно над другим поглощение при 260 нм уменьшается на 34%. Это явление лежит в основе оптического метода исследования плавления полинуклеотидов (рис. 2-28). Физическая природа гипохромного эффекта кроется во взаимодействии тесно уложенных одно над другим пар оснований (стэ-кинг-взаимодействие) [38]. [c.22]

Температурная зависимость поглощения УФ-света при 260 нм (длина волны, при которой свет поглощается нуклеиновыми кислотами эффективнее всего) называется кривой плавления (рис. 2-28). В нативном состоянии нуклеиновые кислоты поглощают свет менее интенсивно, чем в денатурированном. Этот так называемый гипохромный эффект (гл. 13, разд. Б.4.Д) обусловлен стэкинг-взаимодействием между основаниями, плотно уложенными стопками в структуре нативной молекулы. Температура плавления, Т л, — это точка, при которой прирост поглощения составляет половину максимального (рис. 2-28). Чем выше ОС-содер-жание нуклеиновой кислоты, тем более устойчива она к денатурации, причем зависимость Т л от ОС-содержания почти линейна. Для раствора, содержащего 0,15 М КаС1 + 0,015 М цитрата натрия, pH 7,0, справедливо уравнение (2-15). Точное соотношение между ОС-содержани-ем ДНК и Тпл очень сильно зависит от ионного состава и pH среды [87, 88]. [c.142]

В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Она лежит в основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет выявлять степень сходства различных ДНК (а также РНК). Для этого денатурированную ДНК (если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей (ионная сила раствора — около 0,2 температу за — на 10—20 "С ниже Тт нативной ДНК). В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в двуспиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК (или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязав-шейся ДНК- Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК (или РНК), комплементарных другим ДНК (или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [c.30]

Сенжер и Коулсон создали метод анализа последовательности ДНК, который основан на ферментативном копировании однонитевых частиц ДНК [18]. Максам и Гилберт создали метод, в основу которого положена химическая модификация четырех оснований, входящих в состав ДНК, и который с одинаковым успехом применим как к однонитевым, так и к двунитевым молекулам ДНК [19]. Оба метода используют авторадиографическое определение згр-меченных олигонуклеотидов, которые разделяют в зависимости от их длины электрофорезом денатурированных фрагментов в полиакриламидном геле. На практике, успех этих методов во многом определяется недавними достижениями в энзимологии нуклеиновых кислот, особенно использованием ферментов рестрикции, расщепляющих молекулы ДНК, и обратной транскриптазы, с помощью которой получают циклические ДНК, комплиментарные РНК-матрице. Нижеследующее описание методики анализа будет, однако, предполагать наличие гомогенных образцов ДНК подходящей длины. [c.188]

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот среднего размера обычно применяют агарозные гели. Агароза — это особо чистая фракция, получаемая из агара или непосредственно из агарообразующих морских водорослей. В 1,0% агарозном геле можно разделять молекулы ДНК размером от 600 до 20 ООО п. н. Для фракционирования более крупных молекул ДНК (миллионы пар оснований), денатурированной ДНК и РНК приходится использовать специальные системы электрофореза. Иногда для решения специальных задач для разделения ДНК применяют полиакриламидные гели. Так, в 20% полиакриламидном геле можно разделить фрагменты ДНК, состоящие всего из шести оснований и различающиеся лишь одним нуклеотидом. [c.54]

При использовании ферментов в первом случае ставится задача неспецифического использования специфических свойств ряда ферментов. Здесь используются прежде всего ферменты гидролизующего типа, которые легко разрущают и растворяют различные денатурированные структуры белка и нуклеиновых кислот, разрушают скопления и сгустки плазматических, тканевых и клеточных остатков и отторжений. Задача в подобных случаях сводится, естественно, к тому, чтобы поскорее вывести из организма эти шлаки. [c.316]

Несмотря на то что область температурного перехода для ДНК относительно узкая, она все же шире, чем можно было бы ожидать для длинной идеально уложенной спиральной структуры. Внутри этой области с помощью метода электронной микроскопии удалось обнаружить только полностью денатурированные или совершенно нативные структуры [239]. И вновь внутри этой области понижение вязкости быстро достигает предельного значения, а дальнейшее понижение вязкости происходит только при повышении температуры, что указывает на существование известного распределения специфических температур денатурации. Вполне обоснованное объяснение этого заключается в том, что вклад двух типов пар оснований в стабильность спирали различен. В таком случае тепловая денатурация должна была бы зависеть от относительного состава либо всей двуспиральной структуры, либо ее отдельных больщих участков. Показано, что температуры плавления (т. е. точки перегиба на кривых зависимости оптической плотности от температуры), определенные в стандартных условиях (0,15 М хлористого натрия в 0,015 М цитрата натрия) для большого числа дезоксирибонуклеиновых кислот, различающихся по составу оснований, прямо пропорциональны содержанию гуанина и цитозина в нуклеиновой кислоте (рис. 8-20) [240]. Линейная зависимость температур плавления от содержания гуаиин-цитозиновых иар исключительно точна, и поэтому измерение этих температур может быть использовано для определения нуклеотидного состава данной ДНК [241, [c.574]

Что касается низкой гетерогенности бактериальных ДНК по составу (но не обязательно по последовательности), то она очевидна также из данных по определению плотности ДНК методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности [245, 246[. При изучении большого числа дезоксирибонуклеиновых кислот вновь была найдена линейная зависимость между плотностью ДНК и содержанием гуанина и цитозина. Экстраполирование этих результатов показало, что двойная спираль из аденин-тиминового полидезокси-нуклеотида должна иметь плотность 1,662, а плотность соответствующего гуанин-цитозинового полимера должна быть 1,764. Если известна плотность нативной ДНК и ее величина укладывается между этими крайними значениями, то это позволяет точно определять состав ДНК. Соответствующие денатурированные ДНК имеют плотность на 0,015 выше. Если гетерогенность двух препаратов ДНК из животных тканей удалось выявить по увеличению ширины полос, то бактериальные нуклеиновые кислоты характеризуются узким распределением по составу (половина ширины полосы соответствует 3—5 мол. % гуанина + цитозина по сравнению с 11 % для ДНК из зобной железы теленка), а распределение по составу ДНК бактериофага настолько узко, что его не удалось измерить. Избирательная тепловая денатурация ДНК из зобной железы теленка (с низким содержанием гуанин-цитозиновых пар) дает фракцию нативного препарата с более высокой плотностью, чем плотность исходного препарата, из которого она была выделена [245[. [c.577]

За последние годы были получены точные доказательства того, что носителем инфекциопности вирусов, и в частности бактериальных вирусов, т. е. фагов, является исключительно нуклеиновая кислота. Впервые такие доказательства представили Гирер и Шрамм в результате опыта на вирусе табачной мозаики. РНК очищалась многократной деиротеииизацией с помощью фепола и додецилсульфата, сохраняя свою инфекционность при введении в растение. При этом удельная инфекционность снижается в 200—300 раз, если рассчитывать ее на единицу вирусной РНК. Следовательно, белковая оболочка вируса небезразлична для процесса заражения. Однако примесь белка в тщательно приготовленных препаратах была мала (меньше 0,02%), и электронный микроскоп показывал полное отсутствие вирусных частиц. Если какое-то количество белка и оставалось в препаратах, то это были денатурированные макромолекулы, неспособные образовать структуру вирусных палочек. [c.358]

Оптическая активность белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот обусловлена их оптически активными компонентами — аминокислотами и сахарами, а также асимметрией их вторичной структуры, имеющей форму право- или левовинтовых спиралей. Денатурированный белок имеет конформацию беспорядочного клубка и поэтому дает оптическое вращение, отличное от того, которое дает соответствующий нативный белок, содержащий спиральные участки. Оптическое вращение растворов амилопектина, имеющего в основном неспиральное строение, отличается от оптического вращения свежеприготовленной спиральной амилозы, если проводить сравнение в пересчете на один и тот же вес глюкозы. Изменения во вторичной структуре макромолекул удается регистрировать путем измерения удельного вращения не только по всему спектру, но и при одной длине волны. Уже с давних пор известно, что белок по мере денатурации приобретает все более и более отрицательное удельное вращение. Величины [а]п для полностью денатурированных белков и беспорядочно свернутых полипептидов лелсат в интервале от —90 до —125°, тогда как удельное вращение белков в нативном состоянии составляет - -100° и больше. Изменения конформации белков, обусловленные изменением pH, также отражаются на величине удельного вращения. Все эти свойства белковых растворов известны по наблюдениям их удельного вращения при одной длине волны — как правило, при длине волны D-линии натрия. [c.435]

Было доказано, что меченный по углероду порфиромицин алкилирует нуклеиновые кислоты и связывается с молекулой нуклеиновой кислоты [261], РНК и ДНК алкилируются в равной степени и имеют примерно одну поперечную связь на 500 нуклеотидных остатков. Предполагалось, что основное прикрепление порфиромицина к ДНК происходит не поперек сдвоенной спирали с образованием поперечной связи. Эта гипотеза подтверждается тем, что денатурированная нагреванием ДНК алкилируется так же хорошо, как и естественная. Был сделан вывод, что большинство молекул порфиромицина присоединяется к нуклеиновым кислотам путем монофункционального алкилирования. Фрагментация ДНК может происходить также и после алкилирования. [c.196]

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

Интересные результаты были получены при исследовании связывания катионов со стереорегулярной полиметакриловой кислотой. Катион Си + был прочнее связан с изотактическим полиионом [869], а ионы магния образовывали более устойчивый комплекс с синдиотактическим полимером [870]. Эти результаты позволяют предположить, что в образовании хелатов участвуют карбоксильные группы, которые удерживаются на строго определенном расстоянии друг от друга за счет предпочтительной конформации цепи главных валентностей. Тогда относительная устойчивость комплекса должна зависеть от геометрии хелата, характерного для данного катиона. Значение предпочтительной конформации цепи главных валентностей было убедительно нродемонстрировано в случаях, когда полимер может подвергаться переходам спираль — клубок. Связыванию катионов щелочноземельных металлов с поли-а-Ь-глутаминовой кислотой, несомненно, благоприятствует спиральная конформация полимерной кислоты [871]. Наоборот, Mg + связан более слабо с нативной спиральной формой ДНК, хотя эта форма связывает Na+ гораздо сильнее, чем денатурированная нуклеиновая кислота [872]. Другая интересная проблема возникает, если связанным компонентом является органическая молекула, имеющая две катионные группы. В этом случае вполне возможно, что расположение катионов в малых молекулах будет совпадать с расположением анионных групп в полимере, и такое соответствие должно приводить к исключительно прочному взаимодействию. По-видимому, такой эффект наблюдался для хон-дроитинсульфата-А [873] и гиалуроновой кислоты [874], которые образуют прочные комплексы с кураре [c.316]

Это затруднение можно преодолеть, если иммобилизовать один из препаратов ДНК таким образом, чтобы он не мог ренатурировать. Для этой цели используют ни-троцеллюлозные фильтры, которые адсорбируют одноцепочечную ДНК и не адсорбируют РНК. Фильтры с адсорбированной одноцепочечной ДНК обрабатывают специальным образом, для того чтобы предотвратить дальнейшую адсорбцию одноцепочечных молекул. На рис. 2.16 показана схема эксперимента, в котором препарат ДНК денатурировали, полученные одноцепочечные молекулы адсорбировали на фильтре и затем добавляли второй препарат денатурированной ДНК (или препарат РНК). Связывание второй нуклеиновой кислоты происхо- [c.37]

Где располагаются блоки сателлитной ДНК Развитие техники гибридизации нуклеиновых кислот позволило определить расположение последовательностей сателлитной ДНК непосредственно в хромосоме. При гибридизации in situ или цитологической гибридизации хромосомную ДНК денатурируют, обрабатывая клетки, распластанные на покровном стекле. Затем к препарату добавляют радиоактивный ДНК- или РНК-зонд. Зонд гибридизуется с комплементарными ему участками денатурированного генома. Расположение участков гибридизации можно определить с помощью радиоавтографии. [c.301]

Смотреть страницы где упоминается термин Нуклеиновые кислоты денатурирование: [c.30] [c.246] [c.97] [c.228] [c.171] [c.321] [c.71] [c.76] [c.79] [c.320] [c.573] [c.212] [c.219] [c.417] [c.451] [c.596] [c.604] [c.632] [c.143] [c.119] [c.178] [c.107]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология