Неспецифическое связывание

Однако существует оптимальная концентрация меченого антитела. Более высокие концентрации увеличивают неспецифическое связывание с захваченным антителом АЫ, а более низкие — больше подвержены ошибкам измерения. [c.572]

Осаждение иммуноглобулинов легко осуществить высаливанием при нейтральном pH, при котором они малорастворимы, так что в случае меченого антигена связанную метку можно осадить из раствора вместе с оставшимся свободным антителом, оставляя, таким образом, свободную метку на поверхности. В качестве соли предпочитают использовать сульфат аммония, но недостатком метода в таком случае является высокий уровень неспецифического связывания. [c.577]

Макромолекула полиэлектролита связывает противоионы. Поэтому полиион при взаимодействии с другими полиионами ведет себя как нейтральная система, что находит свое отражение в значениях второго вириального коэффициента, определяемого методом осмометрии (см. стр. 147) или светорассеяния (см. стр. 158) [80]. Противоионы могут специфически связываться ионизованными группами полиэлектролита — такое связывание зависит от химической природы макроиона и малого иона. Следует отличать это связывание, сводящееся к образованию солевых связей в фиксированных точках макромолекулы, от неспецифического связывания — образования ионной атмосферы, В солевой связи противоион находится на значительно меньшем расстоянии от полииона, чем то, на которое могут приближаться подвижные противоионы. Специфическое связывание противоионов определяет ионообменные свойства полиэлектролитов. Эти свойства имеют важные практические применения. Сшитые поперечными связями нерастворимые полиэлектролиты, набухающие в воде и других жидкостях, применяются в качестве ионообменных смол или ионитов [81], Иониты оказываются способ-и1 1ми сорбировать определенные ионы из растворов, что находит [c.170]

Все сайты неспецифического связывания первых и вторых антител на фильтре блокировали с помощью бычьего сывороточного альбумина (БСА). [c.336]

Бартон [42] нашел, что оптимальное значение pH для аргентометрического и меркуриметрического методов до некоторой степени зависит от используемой буферной и титрующей системы. Если данное сочетание буферного и титрующего растворов дает правильную нулевую точку с одной из аминокислот, то та же самая система при том же значении pH редко дает правильные результаты с другими соединениями. В то время как завышенные нулевые точки могут быть обусловлены неспецифическим связыванием атомов металла, нулевые точки, лежащие ниже теоретических, могут быть вызваны окислением групп —SH или связыванием атомов металла лишь частью групп —SH. [c.392]

Общие вопросы сорбции, элюирования и неспецифического связывания [c.258]

После перемешивания в течение 30 мин при 4°С суспензии разделяли центрифугированием в течение 10 мин (50 об/мин). Концентрацию а+-цепей в растворе определяли на основании измерений С-радиоактивности. Количество связанных а+-цепей рассчитывалось по разности общего содержания добавленных а+-ценей и определенным в растворе количеством свободных а+-цепей. Одновременно по связыванию таких же количеств человеческого иммуноглобулина О на агарозе в тех же условиях определялись поправки на неспецифическое связывание и включение жидкой фазы в матрицу. [c.373]

Первый контроль выявляет неспецифическую адсорбцию реперной ДНК на фильтре, второй — неспецифическое связывание реперной ДНК с исследуемой. [c.112]

Яо — высота кривой, соответствующая плотности окраски контрольного препарата (неспецифическое связывание красителя), [c.137]

В действительности же такое усиление, как мы видели, возможно только за счет неспецифического связывания красителя карбоксильными группами белка в слабокислой и особенно в нейтральной среде, что, видимо, и имело место в опытах упомянутых авторов. [c.150]

Таким образом, при работе с основными красителями источниками ошибок количественной цитохимии могут быть 1) неполнота извлекаемости НК экстрагентами и неполнота удаления РНК рибонуклеазой при выявлении неспецифического связывания красителя 2) недоступность части НК красителям вследствие блокирования их фосфатных групп аминогруппами белка или вследствие упаковки молекул НК белками и белково-липид-ными структурами (РНК в рибосомах, РНК и ДНК в компактном хроматине и т, д.) 3) неудачный подбор pH раствора красителя 4) неполная фиксация. [c.151]

Неспецифическое связывание красителя учитывается в параллельных препаратах, обработанных сначала хлорамином Т или уксусным ангидридом, затем РНК-азой. Неспецифическое связывание красителя после обработки хлорамином Т и уксусным ангидридом обусловлено двумя факторами. Во-первых, наличием в протоплазме свободных кислых групп белков и полисахаридов, во-вторых, некоторым смещением ИЭТ белка в кислую сторону за счет блокирования или удаления аминогрупп. [c.169]

В связи с этим определение неспецифического связывания пиронина Ж после удаления освободившейся РНК ферментом совершенно необходимо. [c.169]

Во многих случаях биологические системы содержат ряд компонентов, способных независимо специфически связывать лиганд. Более того, в практической работе исследователи часто сталкиваются и с процессами неспецифического связывания, идущего параллельно со специфическим. Кинетику поведения лиганда в такого рода системах удобнее всего проследить на простейшей системе, содержащей один одновалентный лиганд и два типа независимых центров связывания (под независимостью центров связывания понимается отсутствие влияния процесса комплексообразования лиганда с одним центром связывания на кинетические константы скорости связывания лиганда другим центром связывания). [c.271]

АНАЛИЗ ПРОЦЕССА СПЕЦИФИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ В ПРИСУТСТВИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАНИЯ ЛИГАНДОВ [c.292]

Анализ систем с неспецифическим связыванием проводят, как правило, в координатах Скэтчарда. Подставляя в (11.141) вместо Ьр выражение Вр/К, легко прийти ас аналитическому виду зависимости Й от Вр [c.293]

Зависимость К от Вр при неспецифическом связывании представлена на рис. 136, а. Видно, что, в отличие от случая с двумя специфическими центрами связывания, при Ьр-)-с К стремится не к [c.293]

Определение параметров комплексообразования с учетом неспецифического связывания [c.295]

Кислотные свойства циклопентадиена (р/Са 15), который достаточно легко теряет протон, переходя в сравнительно устойчивый карбанион, можно рассматривать как подтверждение устойчивости его аниона, стабилизованного за счет ароматизации. Квазиароматичность не может быть продемонстрирована электрофильным замещением, так как атака реагентом Х+ приведет просто к неспецифическому связыванию с анионом. Истинный ароматический характер подобных квазиароматических систем (участие в реакции Фриделя — Крафтса и т. д.) был показан на примере таких особо стабильных соединений нейт- ральной природы, как ферроцен X (который получается взаимодействием между 1Ха и РеС12) [c.256]

В полистироловую пробирку вносят по 100 мк раствора кроличьих антимышиных антител и Na-фосфатного буфера 0,4 М. К смеси добавляют 1 мКи 1—Nal. При непрерывном перемешивании добавляют 50 мкл раствора хлорамина Т. Инкубируют в течение 1 мин. Реакцию останавливают добавлением 200 мкл тиосульфата Na. Дауэкс суспендируют в 0,15 М Na l и помещают в 1—2 мл колонку. Через колонку пропускают 1 мл кроличьей сыворотки для предотвращения неспецифического связывания антител. Реакционную смесь пропускают через колонку с Дауэксом для удаления несвязавшегося 1. Промывают колонку 1 мл 0,15 М Na l. Раствор меченых антител (1 мл) смешивают с 1 мл 3%-ного раствора БСА в фосфатном буфере и хранят при 4°С. [c.324]

Во всех методах сложно осуществить присоединение белка к поверхности преобразователя, поскольку оно не должно затрагивать активный участок. Если модифицированную поверхность использовать непосредственно без метки или медиатора, нужно предотвратить все иеспецифические взаимодействия, поскольку прямые измерения без метки, включающие обычно контроль изменения массы или показателя преломления на поверхности, не могут различить специфические или неспецифические взаимодействия. При иммобилизэл ции поверхности с плотной упаковкой неспецифическое связывание не происходит, тем не менее, иммобилизация часто бывает неэффективной для о а-зования комплекса антитело-антиген из-за стерических препятствий. Наоборот, упаковка с большими промежутками обычно допускает неспецифические взаимоде твия с расположенной ниже поверхностью, и, таким образом, можио з егистрировать значительные ошибочные сигналы. [c.525]

Из кривых на рис. 7.9-5 очевидно, что изменение сигнала в результате [AAg ] является функцией концентрации антитела, используемой в анализе (рис. 7.9-5,б), и что уровень антител, даюищй максимальную чувствительность, зависит от концентраций меченого и определяемого антигена. Традиционно системы иммунного анализа имеют тенденцию давать погрешность при высокой концентрадии реагента со степенями связывания 0,4-0,5. Действительно, из рис. 7.9-3,а и б, видно, что связывание в этой области (0,4-0,5) слишком велико, чтобы привести к большому изменению степени связывания антигена при низкой концентрации последнего. Однако нельзя игнорировать сигнал, относящийся к неспецифическому связыванию, поэтому чувствительностью поступаются в пользу более низких помех за счет неспецифического связывания при более высоких концентрациях антител. [c.571]

Меченое антитело АЬ2 должно быть способно специфически соединяться с поверхностью связанного антигена. В идеальном случае сандвичевого анализа в отсутствие меченого антитела нет никакого сигнала. На практике всегда есть некоторый сигнал, возникающий за счет неспецифического связывания АЬ2 с АЫ, так что даже в отсутствие общего сигнала [c.572]

В качестве материала налболее широко используют полистирол, а в некоторых случаях увеличивают емкость за счет высушивания на нем антитела одним из главных достоинств является высокая степень адсорбции, несмотря на то, что площадь поверхности мала по сравнению с площадью частиц, обсуждавшихся выше. Однако это преимущество в адсорбции способствует также неспецифическому связыванию, так что определение всегда включает этап блокировки , использующий белок, такой, как казеин, для связывания любых ненаселенных областей на поверхности полистирола после того, как была присоединена первичная распознающая молекула. [c.581]

Эффекты неспецифического связывания могут также быть источником проблем. Изменение поверхности частиц влияет на агрегацию частиц и адсорбцию реагента, так что следует оптимизировать условия, чтобы уменьшить вандерваальсово притяжение между частицами, обеспечив достаточное куло-товское отталкивание, но не ингибируя реакцию антитело—антиген. [c.585]

При токсическом действии металлов вырабатывается общая переносимость (толерантность) организма к повышенному количеству металлов или к чужеродным металлам, происходит неспецифическое связывание металлов или их накопление в коже, костях, волосах, в вакуолях растений и лизо-сомах до определенного порогового уровня. Часто выделяются слизистые жидкости (особенно у рыб), содержащие полисахариды и другие связывающие металлы вещества, богатые группами -ОН, -СООН, -SO3H все они вступают в реакцию с катионами. Вот почему в организме рыб обнаруживают высокие концентрации металлов свинца, цинка, марганца и др. [c.41]

Эволюционные аспекты развития бенздиазепиновых рецепторов рассмотрены в работе [105]. Нервную ткань различных животных гомогенизировали и из нее выделяли синаптосомы. Специфичность связывания Н-диазепама оценивали после его добавления в концентрации 1,9 10 моль/л в среду, содержащую синаптосомы. Для установления неспецифического связывания Н-диазепам добавляли после инкубации синаптосом с немеченым лоразепамом (3 10 моль/л). [c.263]

Противоионы могут связываться заряженными группами полиэлектролита специфически — такое связывание зависит от химической природы и макроиона, и малого иона. Следует отличать это специфическое связывание, сводящееся к образованию солевых связей в фиксированных точках макромолекулы, от неспецифического связывания — образования ионной атмосферы. В солевой связи противоион находится на значительно меньшем расстоянии от заряженной группы полииона, чем расстояние между этой группой и подвижными противоиоиами. Специфическое связывание противоионов определяет ионообменные свойства полиэлектролитов, имеющие важные практические применения. Сшитые поперечными связями нерастворимые полиэлектролиты, набухающие в воде или в других жидких средах, применяются в качестве ионообменных смол или ионитов. Иониты способны сорбировать определенные ионы из растворов, что находит применение при [c.85]

Здесь могут быть использованы методы, известные из энзимологии и белковой химии равновесный диализ, ультрацентрифугирование, гель-хроматография и ультрафильтрация. Основной проблемой является здесь выяснение различий между специфическим и неспецифическим связыванием, в особенности при изучении связывания, проводимом на препаратах мембран и на частично очищенных белковых фракциях. В центральной нервной системе концентрации рецептора могут составлять несколько пикомолей на 1 г ткани, а нейромедиаторы благодаря своим полярным свойствам легко взаимодействуют, хотя и слабо, с полярными мембранными компонентами, расположенными вне рецепторной области. Если даже такое неспецифическое связывание имеет сродство на несколько порядков ниже, чем специфическое связывание с рецептором (т. е. более высокую Ко), оно все же оказывается важным фактором, который следует принимать во внимание из-за большого числа присутствующих неспецифических связывающих центров. Таким образом, обнаружение рецептора в центральной нервной системе посредством изучения связывания возможно, если имеется лиганд с очень высоким сродством и с очень высокой удельной радиоактивностью (>185-10 ° раоп./(с-ммоль). [c.249]

Один из экспериментов по связыванию представлен на рис. 9.3. Кривая 1 дает общее количество связанного лиганда, как функцию его концентрации она отражает как специфическое, так и неспецифическое связывание. Для доказательства этого факта получена кривая 2, показывающая связывание радиоактивного лиганда в присутствии 100- кратного избытка холодного , т. е. немеченого лиганда. Последний вытесняет горячий лиганд из его специфически насыщаемого рецептора (с. 242, критерий 3) линейность кривой 2 свидетельствует о ненасыщаемом характере остаточного неспецифического связывания. Разность кривых 1 п 2 дает гиперболу 3, т. е. кривую насыщения, которая характеризует специфическое связывание лиганда и рецептора. Кривая 3 преобразована в график обратных величин 4), из которого и определяются/Со и максимальное связывание. Константы диссоциации и число центров связывания рассчитываются из диаграммы Скетчарда, в которой на оси координат откладывается отношение концентраций овязаннога [c.249]

Для исключения ложноположительных результатов реакцию сопровождают рядом контролей, среди которых особое значение имеет контроль с гетерологичным АГ (например, с бактериальной культурой, не соответствующей в антигенном отношении используемой антисыворотке). При изучении инфицированных культур клеток обязательно используют контроль с нормальной, неинфицированной культурой (для исключения аугофлюоресцен-ции и неспецифического связывания меченых АТ с поверхностью клеток). Для подавления аутофлюоресценции препаратов можно использовать бычий альбумин, меченный родамином. [c.76]

Морроу и др. [23] разработали иолуколичественную теорию неспецифического связывания белков на замещенных хроматографических аффинных носителях, которое обусловлено электростатическими и гидрофобными взаимодействиями. В разд. 5.1 детально рассмотрено выделение р-галактозидазы из Es heri hia соИ, проводимое на сефарозе с прикрепленным ингибитором (п-аминофе-нил-р-о-тиогалактопиранозидом) [31]. Активный сорбент получали присоединением ингибитора через пространственную группу, полученную из бис-(3-аминопропил) амина и янтарного ангидрида. Однако активность сорбента была значительно ниже, если эта пространственная группа обладала гидрофильными свойствами [26]. Робинсон и др. [29] использовали аффинный сорбент, при- [c.95]

Если многоточечное связывание является одной из причин сильного неспецифического связывания, то одним из способов понижения последнего могло бы быть уменьшение степени замещения так, чтобы расстояния между отдельными молекулами аффин- [c.278]

Интенсивность пиронинофилии препарата определяется на микрофотометре (МФ-2 или МФ-4). Полученные данные выражаются в единицах оптической плотности. Поправку на неспецифическое связывание красителя берут от параллельных препаратов после удаления из них РНК. [c.166]

Пиронинофилия протоплазмы контрольных препаратов (без освобождения связанных фосфатных групп РНК) за вычетом неспецифического связывания красителя (после удаления РНК рибонуклеазой или 1 н. H IO4 при 4° в течение 18 часов) соответствует относительному содержанию свободных фосфатных групп РНК. [c.166]

Срезы второй партии сначала подвергают кислотному гидролизу, затем споласкивают водой и обрабатывают РНК-азой, вторично споласкивают водой и после этого окрашивают. В окрашенных срезах учитывают неспецифическое связывание красителя. Разность в интенсивности пиронинофилии между препаратами первой и второй партий соответствующих экс- [c.166]

Сумма показателей пиронинофилии контрольных препаратов за вычетом неспецифического связывания красителя (в клетках кончика корня — 25,1, в алейроновых клетках—17,4) и максимального прироста пиронинофилии при гидролизе(соответственно 8,7 и 3,5) равна общей сумме свободных и связанных фосфатных групп РНК. [c.167]

Примечание. Неспецифическое связывание красителя учтено после удаления РНК 1 н. НСЮ4 при 4 в течение 18 часов. [c.168]

Неспецифическое связывание красителя при определении свободных фосфатных групп РНК замеряют на параллельных препаратах, обработанных перед окрашиванием РНК-азой. При определении фосфатных групп РНК, связанных с липидами, оно учитывается в препаратах, обработанных сначала липидорастворителями, затем РНК-азой (табл. 6). [c.171]

При разделении субклеточных компонентов мы сталкиваемся с двумя основными затруднениями. Первое из них связано с возможностью возникновения артефактов. В процессе разделения могут образоваться структуры, которых не было в исходной клетке. К артефактам относится, например, расщепление индивидуальных клеточных компонентов на субъединицы, утрата биологической активности субклеточными компонентами (в результате ферментативной шш иной деградации) в процессе выделения, неспецифическое связывание белков с нуклеиновыми кислотами и т. д. Хотя нет единого и притом надежного способа избежать артефактов, но в общеммы можем сказать, что при соблюдении определенных условий вероятность появления артефактов можно свести к минимуму. Условия эти следующие быстрота проведения всех операций по фракционированию, работа на холоду, применение наиболее мягких спо- [c.11]

Рис. 131. Кривые процесса связывания Н-нзитоксоиа препаратами мембран коры больших полушарий головного мозга крыс. Связывание определялось с использованием стеклянных фильтров Whatman GF/B. 1, 2, 3 — соответственно кривые об щего, специфического и неспецифического связывания (последнее определялось при добавлении ЮцМ немеченого налоксона). Условия -налоксон с удельной активностью 50 Ки/ ммоль, мембраны в концентрации 1,6 мг белка/мл, 37°С (экспериментальные результаты Зайцева, Курочкина, Породен-ко)

Рис. 136. Комплексообразование одновалентного лиганда с одним (а) и двумя (б) независимыми типами специфических центров связывания прн наличии в системе процесса неспецифического связывания лнганда. Анализ процесса в координатах Скэтчарда. Кривые 1 на рис. а и б соответствуют общему связыванию, кривые 2 — процессу специфического комплексообразования

Изучение процессов комплексообразования лигандов с центрами связывания существенно осложняется наличием в системе процесса неспецифического связывания. Поэтому целесообразно рассмотреть, каким образом из экспериментальных данных по изучению связывания лигандов в системе могут быть получены параметры, соответствующие только процессу специфического комплексообразования. Вопрос этот в общем случае наиболее подробно разобран в работе (Blondeau, Robel, 1975). [c.295]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология