Специфическое и неспецифическое связывание

Макромолекула полиэлектролита связывает противоионы. Поэтому полиион при взаимодействии с другими полиионами ведет себя как нейтральная система, что находит свое отражение в значениях второго вириального коэффициента, определяемого методом осмометрии (см. стр. 147) или светорассеяния (см. стр. 158) [80]. Противоионы могут специфически связываться ионизованными группами полиэлектролита — такое связывание зависит от химической природы макроиона и малого иона. Следует отличать это связывание, сводящееся к образованию солевых связей в фиксированных точках макромолекулы, от неспецифического связывания — образования ионной атмосферы, В солевой связи противоион находится на значительно меньшем расстоянии от полииона, чем то, на которое могут приближаться подвижные противоионы. Специфическое связывание противоионов определяет ионообменные свойства полиэлектролитов. Эти свойства имеют важные практические применения. Сшитые поперечными связями нерастворимые полиэлектролиты, набухающие в воде и других жидкостях, применяются в качестве ионообменных смол или ионитов [81], Иониты оказываются способ-и1 1ми сорбировать определенные ионы из растворов, что находит [c.170]

Любой вид дезинфекции или стерилизации приводит к поражению бактериальной клетки — свертыванию белков, неспецифическому химическому связыванию, специфическому химическому связыванию, действию на поверхностях, комбинированному действию. [c.110]

В настоящее время нет единого мнения по поводу причин различного действия ионов и, хотя известно, что катионы сильно связываются с ДНК, не ясно, происходит ли это за счет неспецифических электростатических эффектов или имеет место также и специфическое химическое связывание [c.266]

Во многих случаях биологические системы содержат ряд компонентов, способных независимо специфически связывать лиганд. Более того, в практической работе исследователи часто сталкиваются и с процессами неспецифического связывания, идущего параллельно со специфическим. Кинетику поведения лиганда в такого рода системах удобнее всего проследить на простейшей системе, содержащей один одновалентный лиганд и два типа независимых центров связывания (под независимостью центров связывания понимается отсутствие влияния процесса комплексообразования лиганда с одним центром связывания на кинетические константы скорости связывания лиганда другим центром связывания). [c.271]

АНАЛИЗ ПРОЦЕССА СПЕЦИФИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ В ПРИСУТСТВИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАНИЯ ЛИГАНДОВ [c.292]

Зависимость К от Вр при неспецифическом связывании представлена на рис. 136, а. Видно, что, в отличие от случая с двумя специфическими центрами связывания, при Ьр-)-с К стремится не к [c.293]

Заметим, что 1) в формуле (11.181) В% — исправленное значение концентрации комплекса с учетом неспецифического связывания (поокольку, как это следует из соотношений (11.176) и (11.177), Bip и Вгр имеют смысл специфически образованных ком- [c.298]

Неспецифическое связывание меченого соединения в значительной степени обусловлено его концентрацией, концентрацией иммуносорбента и временем их контакта. Оптимальные соотношения этих факторов в каждом конкретном случае надо выбирать экспериментально. Однако очевидно, что уменьшение концентрации меченого соединения и проведение анализа в кинетическом режиме должно способствовать уменьшению неспецифического связывания. Реально возможность его снижения таким путем зависит от требуемой чувствительности анализа и соотношения-констант скоростей образования специфического и неспецифического комплексов. - [c.215]

Равновесный диализ имеет и свои специфические сложности, главным образом из-за применения целлюлозных мембран. Диффузия, особенно через мембраны, — это медленный процесс поэтому достижение равновесия требует значительного времени, что исключает какие-либо кинетические исследования в системе. Еще большую проблему создает неспецифическое связывание лиганда, которое заставляет вести измерения в области высоких концентраций антител, а это в свою очередь вызывает явление электроосмоса и удорожает процедуру. [c.32]

Так происходит в идеальном случае, когда неспецифическое связывание пренебрежимо мало. Чтобы проверить, так ли это, подвергают фильтрации ряд разведений антител (с титрами от 1 до 50) и сравнивают титры до и подле фильтрации. Если обнаружится, что часть антител задержана мембраной, то эксперимент повторяют с фильтрами, подвергнутыми до помещения в фильтрующую ячейку предварительной обработке мембраны выдерживают (не погружая ) на поверхности 0,2%-ного раствора желатины в буфере в течение 10 мин при комнатной температуре и подсушивают между двумя листами впитывающей бумаги. Такая обработка обычно уменьшает неспецифическое связывание до приемлемого уровня, но она примерно вдвое увеличивает время фильтрации. Если эта обработка не вполне удовлетворительна, мембраны выдерживают на 0,1%-ном растворе глобулина, гомологичного исследуемому, но не содержащего специфических антител. Последняя процедура дороже и еще больше снижает скорость фильтрации, но она практически полностью исключает неспецифическое связывание. После предварительной обработки мембран желатиной или глобулином их можно хранить в сухом виде (между двумя листами фильтровальной бумаги) и использовать по мере надобности. [c.35]

Чашки с клетками, подлежащими разделению, помещают на встряхиватель, движущийся по горизонтали с амплитудой 1,5 см и частотой 1,33 Гц, смонтированный на платформе, которая отклоняется по вертикали с амплитудой 20° и частотой 0,33 Гц. Таким образом обеспечивается то, что клетки не скапливаются в центре или у краев чашек, а постоянно движутся по всей поверхности слоя геля. Их перемещение не должно быть слишком быстрым, чтобы не препятствовать специфическому связыванию, или слишком медленным —во избежание неспецифического связывания. [c.284]

Для каждого фильтра, анализируемого с помощью описанного оборудования, в качестве меры ферментативной активности выступает скорость нарастания сигнала, выражаемая обычно в милливольтах в минуту. Типичный набор кривых для серий калибровочных стандартных препаратов дигоксина показан на рис. 20-5. Наибольшая скорость реакции соответствует минимальной концентрации дигоксина в препарате с ростом концентрации скорость постепенно уменьшается. На основании этих данных строят калибровочную кривую. Определение скорости реакции характеризуется высоким отношением сигнала к фону и линейностью нарастания сигнала на протяжении интервала в несколько минут. Обычно измерение для каждого фильтра продолжается в течение 30 с. Особенно важно отметить чрезвычайно низкую скорость реакции, наблюдаемую для отрицательного контроля (рис. 20-5). Этот контроль представляет собой фильтр, покрытый слоем антител, отличных от антител к дигоксину. Специфическое связывание с таким фильтром невозможно. Чрезвычайно низкая скорость реакции в отрицательном контроле свидетельствует о том, что в системе практически не происходит неспецифического связывания. Стекловолокнистая фильтровальная бумага сама по себе в отношении адсорбции фактически инертна, а после покрытия анти- [c.306]

Специфическое и неспецифическое связывание [c.134]

Белок можно модифицировать таким образом, чтобы отношение эффективности специфического и неспецифического связывания увеличилось. Рассмотрим два подхода к решению этой задачи. [c.137]

Отношение эффективности специфического и неспецифического связывания увеличится и в том случае, если увеличить в равной степени число специфических и неспецифических контактов. [c.137]

Обратите внимание, что, удвоив размеры репрессора и оператора, мы увеличили отношение эффективностей специфического и неспецифического связывания с 10 до 10 . Другими словами, величина K /Kqp возросла в 10 раз. Итак, наш анализ показывает, что более крупный репрессор работает гораздо эффективнее, чем небольшой по размеру. Однако теперь мы сталкиваемся с кинетической проблемой абсолютное значение константы неспецифического связывания настолько велико, а неспецифических мест так много, что репрессоры практически все время связаны с ними. В результате равновесие между специфическими и неспецифическим связыванием достигается слишком долго. [c.138]

Благодаря кооперативности фактически увеличивается отношение эффективностей специфического и неспецифического связывания. Вероятность связывания двух молекул репрессора на соседних неспецифических участках пренебрежимо мала, поскольку таких участков очень много. В случае фага X два связанных с ДНК димера репрессора взаимодействуют слабо и ДНК-белковые комплексы легко диссоциируют. В других случаях между связанными с ДНК белками могут возникать более прочные связи, и в них может участвовать несколько разных белков. Такие взаимодействия обеспечат образование весьма стабильных комплексов даже при условии, что сродство изолированных белковых молекул к ДНК сходно со сродством А,-репрессора к его оператору. Один из примеров такого рода рассмотрен в приложении 3. [c.140]

Во всех методах сложно осуществить присоединение белка к поверхности преобразователя, поскольку оно не должно затрагивать активный участок. Если модифицированную поверхность использовать непосредственно без метки или медиатора, нужно предотвратить все иеспецифические взаимодействия, поскольку прямые измерения без метки, включающие обычно контроль изменения массы или показателя преломления на поверхности, не могут различить специфические или неспецифические взаимодействия. При иммобилизэл ции поверхности с плотной упаковкой неспецифическое связывание не происходит, тем не менее, иммобилизация часто бывает неэффективной для о а-зования комплекса антитело-антиген из-за стерических препятствий. Наоборот, упаковка с большими промежутками обычно допускает неспецифические взаимоде твия с расположенной ниже поверхностью, и, таким образом, можио з егистрировать значительные ошибочные сигналы. [c.525]

Как показали эксперименты in vitro, присоединение соответствующего стероидного гормона приводит к аллостерическому изменению рецептора (его активации), значительно повышающему сродство рецепторного белка к ДНК из любого источника. Поскольку рецепторы стероидов, по-видимому, непрерывно диффундируют из цитоплазмы в ядро и обратно, счетается, что накопление активированных рецепторов в ядре вызывается именно таким усилением их неспецифического связывания с ДНК. Полагают также, что активированный гормоном рецептор приобретает повьшгенное сродство к нескольким специфическим участкам хроматина, ответственным за регуляцию активности генов, хотя это прямо наблюдать не удается. [c.258]

Меченое антитело АЬ2 должно быть способно специфически соединяться с поверхностью связанного антигена. В идеальном случае сандвичевого анализа в отсутствие меченого антитела нет никакого сигнала. На практике всегда есть некоторый сигнал, возникающий за счет неспецифического связывания АЬ2 с АЫ, так что даже в отсутствие общего сигнала [c.572]

ФАП, действующие внутри клеток. К этой группе принадлежит большинство ФАП. Все они проникают внутрь клеток через клеточную мембрану, поэтому должны связываться с ней. Неспецифическое связывание происходит за счет зарядовых эффектов, специфическое — в результате разнообразных биоспецифическнх взаимодействий. Антибактериальные вещества и противоопухолевые агенты могут разрушать мембраны соответствующих клеток, в остальных случаях это нежелательно. Механизмы проникновения в клетку низкомолекулярных веществ и полимеров существенно различны. В то время как в первом случае имеет [c.39]

Противоионы могут связываться заряженными группами полиэлектролита специфически — такое связывание зависит от химической природы и макроиона, и малого иона. Следует отличать это специфическое связывание, сводящееся к образованию солевых связей в фиксированных точках макромолекулы, от неспецифического связывания — образования ионной атмосферы. В солевой связи противоион находится на значительно меньшем расстоянии от заряженной группы полииона, чем расстояние между этой группой и подвижными противоиоиами. Специфическое связывание противоионов определяет ионообменные свойства полиэлектролитов, имеющие важные практические применения. Сшитые поперечными связями нерастворимые полиэлектролиты, набухающие в воде или в других жидких средах, применяются в качестве ионообменных смол или ионитов. Иониты способны сорбировать определенные ионы из растворов, что находит применение при [c.85]

Здесь могут быть использованы методы, известные из энзимологии и белковой химии равновесный диализ, ультрацентрифугирование, гель-хроматография и ультрафильтрация. Основной проблемой является здесь выяснение различий между специфическим и неспецифическим связыванием, в особенности при изучении связывания, проводимом на препаратах мембран и на частично очищенных белковых фракциях. В центральной нервной системе концентрации рецептора могут составлять несколько пикомолей на 1 г ткани, а нейромедиаторы благодаря своим полярным свойствам легко взаимодействуют, хотя и слабо, с полярными мембранными компонентами, расположенными вне рецепторной области. Если даже такое неспецифическое связывание имеет сродство на несколько порядков ниже, чем специфическое связывание с рецептором (т. е. более высокую Ко), оно все же оказывается важным фактором, который следует принимать во внимание из-за большого числа присутствующих неспецифических связывающих центров. Таким образом, обнаружение рецептора в центральной нервной системе посредством изучения связывания возможно, если имеется лиганд с очень высоким сродством и с очень высокой удельной радиоактивностью (>185-10 ° раоп./(с-ммоль). [c.249]

Один из экспериментов по связыванию представлен на рис. 9.3. Кривая 1 дает общее количество связанного лиганда, как функцию его концентрации она отражает как специфическое, так и неспецифическое связывание. Для доказательства этого факта получена кривая 2, показывающая связывание радиоактивного лиганда в присутствии 100- кратного избытка холодного , т. е. немеченого лиганда. Последний вытесняет горячий лиганд из его специфически насыщаемого рецептора (с. 242, критерий 3) линейность кривой 2 свидетельствует о ненасыщаемом характере остаточного неспецифического связывания. Разность кривых 1 п 2 дает гиперболу 3, т. е. кривую насыщения, которая характеризует специфическое связывание лиганда и рецептора. Кривая 3 преобразована в график обратных величин 4), из которого и определяются/Со и максимальное связывание. Константы диссоциации и число центров связывания рассчитываются из диаграммы Скетчарда, в которой на оси координат откладывается отношение концентраций овязаннога [c.249]

Рис. 131. Кривые процесса связывания Н-нзитоксоиа препаратами мембран коры больших полушарий головного мозга крыс. Связывание определялось с использованием стеклянных фильтров Whatman GF/B. 1, 2, 3 — соответственно кривые об щего, специфического и неспецифического связывания (последнее определялось при добавлении ЮцМ немеченого налоксона). Условия -налоксон с удельной активностью 50 Ки/ ммоль, мембраны в концентрации 1,6 мг белка/мл, 37°С (экспериментальные результаты Зайцева, Курочкина, Породен-ко)

Рис. 136. Комплексообразование одновалентного лиганда с одним (а) и двумя (б) независимыми типами специфических центров связывания прн наличии в системе процесса неспецифического связывания лнганда. Анализ процесса в координатах Скэтчарда. Кривые 1 на рис. а и б соответствуют общему связыванию, кривые 2 — процессу специфического комплексообразования

Изучение процессов комплексообразования лигандов с центрами связывания существенно осложняется наличием в системе процесса неспецифического связывания. Поэтому целесообразно рассмотреть, каким образом из экспериментальных данных по изучению связывания лигандов в системе могут быть получены параметры, соответствующие только процессу специфического комплексообразования. Вопрос этот в общем случае наиболее подробно разобран в работе (Blondeau, Robel, 1975). [c.295]

Определение равновесных констант связывания. Для иахож-дения равновесных констант процесса специфического комплексообразования лигандов с центрами связывания при наличии в системе связывания неопецифического можно воспользоваться двумя подходами. Во-первых, методами, описанными выше, можно определить концентрацию специфически связанного лиганда и далее воопользоваться обычными методами определения равновесных констант связывания, рассмотренными выше. Во-вторых, для определения равновесных констант комплексообразования можно воспользоваться методом разложения кривой связывания на асимптоты, учитывая, что асимптота, отвечающая неспецифическому связыванию, определяется как JimR (см. выще и рис. 136). [c.298]

Глобулины — белки с большей, чем у альбуминов, молекулярной массой (свыше 100 ООО). В отличие от альбуминов они нерастворимы в чистой воде, а растворимы только в разбавленных солевых растворах. Глобулины — слабокислые или нейтральные белки (р/лежит в интервале от 6,0 до 7,3) содержат меньше, чем альбумины, остатков кислых аминокислот. Эти белки плохо гидратируются, поэтому они легко осаждаются из растворов с низкой концентрацией (NH4)2SU4. Некоторые из глобулинов обладают способностью к специфическому связыванию веществ (специфические переносчики), другие, как и альбумины, — к неспецифическому связыванию жирорастворимых веществ. [c.87]

Представление о том, что связывание гормон-рецепторного комплекса со специфическими участками хроматина регулирует транскрипцию определенных генов, получило всеобщее признание, однако прямо идентифицировать эти специфические участки невероятно трудно. Главный источник затруднений-неспецифическое связывание рецепторов с ДНК. Далее, для регуляции 50 генов может быть достаточно связьгаания лишь малой доли тех 10000 гормон-рецепторных комплексов, которые содержатся в клетке. А между тем даже 10000 рецепторов составляют по весу всего только 1/50000 часть общего клеточного белка поэтому в высокоочищенном виде рецепторный белок удалось получить лишь в очень малом количестве. В связи со всем этим трудно было выяснить, чем определяется специфичность действия рецепторов для стероидов-узнаванием определенных последовательностей ДНК, особых хромосомных белков или и тем и другим одновременно. Однако недавно с помощью методов генной инженерии удалось клонировать один ген, регулируемый кортизолом, и таким образом получить в большом количестве соответствующую ДНК. Было показано, что очищенный рецептор кор- [c.258]

После иммобилизации антител (антигена) часть центров сорбции носителя экранируется связанным белком и становится недоступным для взаимодействия с компонентами анализируемой пробы и ферментным конъюгатом. В связи с этим наиболее ценную для анализа информацию дает сравнение эффективности сорбции меченного пероксидазой инсулина на двух иммуносорбентах, один из которых содержит иммобилизованные специфические антитела, а другой — антитела неиммунизированного животного (рис. 26). Подобный эксперимент позволяет учесть суммарное неспецифическое связывание с носителем и иммобилизованными иммуноглобулинами, но не дает возможность различить эти два эффекта. [c.215]

Отношение сигнал/шум. Джексон и Экинс [16] теоретически оценили предел чувствительности иммуноанализа. Они показали, что чувствительность неконкурентного иммуноанализа зависит от уровня неспецифического связывания (т.е. фонового сигнала) и удельной активности меченого компонента. Другими словами, чем вышё специфический сигнал и ниже фон, тем больше теоретическая чувствительность данного метода. Следовательно, применение радиоактивных изотопов налагает определенные ограничения на чувствительность, так как удельная активность [c.155]

Негативный контроль должен характеризовать уровень флуоресценции исследуемой пробы в отсутствие специфического взаимодействия реагента с клетками. Такая неспецифическая флуоресценция может возникать как из-за аутофлуоресценции , т. е. флуоресценции самих компонентов клетки, так и вследствие неспецифического связывания реагента. Идеальной контрольной пробой является проба, обработанная таким же способом, как и в опыте, но с использованием реагента, которому каким-то образом придана негативная специфичность. При примененип метода прямого окрашивания хорошим контролем является проба, в которой клетки обрабатывали реагентом, приготовленным на основе антител того же изотипа и содержащим то же количество конъюгированного флуорохрома, что и реагент, используемый в опыте, но обладающим другой специфичностью. Для контроля специфичности окрашивания исследуемых клеток реагентом против одного аллеля маркерного антигена можно обработать этим же реагентом клеточную популяцию мыши, конгенную по другому аллелю этого же антигенного маркера (если такая конгенная линия существует). При использовании непрямого метода к постановке идеальных контро- лей предъявляются такие же требования плюс дополнительный контроль второго (меченного флуорохромом) реагента. [c.352]

Влияние концентрации антигена на неспецифическое связывание. На первом этапе компоненты образца и компоненты системы определения могут связываться непосредственно с полистиролом даже в присутствии 0,05% твина-20 (неопубликованные данные). Непосредственное связывание компонентов образца может приводить к дополнительному артефактному обнаружению иммуноглобулинов, не обладающих специфичностью к данному антигену, а адсорбция на пластике самих компонентов системы определения вызывает фоновое связывание, которое может существенно искажать кривые титрования. Оба названных процесса протекают не очень интенсивно и, вероятно, оказывают лишь незначительное влияние на точность определения в системах ELISA с относительно низкой чувствительностью. Однако в случае систем, предназначенных для тестирования специфических антител в низких концентрациях, эти же процессы могут очень значительно искажать результаты анализа. [c.220]

Приведенные вычисления не учитывают тот факт, что белки, которые прочно связываются со специфическими операторными участками, обладают также низким, но все же не пренебрежимо малым сродством к неоператорным участкам ДНК. Такое связывание с неспецифическими последовательностями ДНК может приводить к заметному снижению концентрации свободного репрессора и, следовательно, доли связанных операторов. Далее мы всюду будем считать, что репрессор обладает одинаково низким сродством к любому неоператорному участку ДНК. В действительности может оказаться, что в неспецифическом связывании участвуют главным образом последовательности, которые отчасти напоминают оператор, но это не повлияет на наши основные выводы. [c.135]

Иммуноанализ антител. 1. Антиген в солевом растворе инкубируют на пластиковой подложке или в пробирках, в результате чего небольшое его количество адсорбируется на поверхности пластика. 2. Свободный антиген удаляют путем отмывания. (Подложку затем можно обработать избытком постороннего белка, чтобы предотвратить последующее неспецифическое связывание белков.) 3. Добавляют исследуемые антитела, которые связываются с антигеном. 4. Несвя-завшиеся белки удаляют отмыванием. 5. Антитела определяют при помощи меченого лиганда. Лигандом может служить, например, стафилококковый белок А, который связывается с F -областью IgG чаще используют другие антитела, специфичные по отношению к исследуемым антителам. Применяя лиганд, который связывается с антителами определенного класса или подкласса, можно дифференцировать изотипы антител. 6. Несвязанные антитела удаляют отмыванием. 7. Определяют связавшуюся метку. Типичная кривая титрования представлена внизу. С повышением количества антител интенсивность сигнала возрастает линейно от фонового значения до уровня плато. Титр антител можно определить правильно лишь в линейной области. Уровень плато, как правило, в 20-100 раз выше фонового. Чувствительность метода обычно составляет приблизительно 1-50 нг специфических антител в 1 мл. Специфичность метода можно проверить, добавив свободный тест-антиген в повышающихся концентрациях к исследуемым антителам на зтапе (3). Антиген связывается с антителами и блокирует их соединение с антигеном, фиксированным на подложке. Добавление возрастающих количеств свободного антигена снижает интенсивность сигнала. [c.534]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология