ДНК, форма и ренатурация

Свертывание белковой цепи. Для познания принципов структурной организации белковых молекул чрезвычайный интерес представляет явление денатурации (ренатурации). Переход нативной конформации белка в развернутую неструктурированную форму и обратный переход флуктуирующего статистического клубка в исходную компактную трехмерную структуру есть не что иное, как процессы разрушения и формирования именно тех самых связей, которые и обусловливают структурную организацию белковой молекулы. Анализ работ, посвященных экспериментальным и теоретическим исследованиям денатурации белков, был начат в предшествующем томе [2. Ч. III]. Перед тем как продолжить эту тему, кратко напомним основные итоги уже проведенного обсуждения. [c.81]

Эти опыты показывают, что программа самосборки белка закодирована в его первичной структуре. По всей вероятности, важное значение при ренатурации белка имеет образование ядер , т. е. небольших участков упорядоченной вторичной структуры (стадия нуклеации). За этим сравнительно медленным процессом следует быстрое сворачивание цепи в нативную структуру. На первых этапах ренатурации белков, в поддержании нативной конформации которых участвуют дисульфидные мостики, образуются промежуточные производные с правильными и неправильными дисульфидными связями. В ряде случаев удавалось останавливать процесс ренатурации на определенных стадиях и выделять такие частично свернутые формы. Поскольку в целом сборка белка является достаточно быстрым процессом, можно сделать вывод о том, что природа не перебирает все возможные комбинации в очередности замыкания дисульфидных мостиков (при 4 S—S-связях их 105, а при 5 — уже 945), а сворачивание полипептидной цепи идет по ограниченному числу направлений и приводит к конформации, характеризующейся минимальной свободной энергией. [c.105]

Фиг. 53. Ренатурация белка ВТМ и образование палочек. Изображены самопроизвольное восстановление специфической формы белковой молекулы из хаотического клубка (т. е. из денатурированного состояния) и агрегация таких молекул в тримеры с последующим обр [c.218]

Эксперименты по ренатурации белков показывают, что ненаправленная реконструкция дисульфидных мостиков восстановленных белков приводит в большинстве случаев к образованию структур, полностью идентичных структурам тех же белков в той форме, в которой их выделяют из природных источников. Поскольку ненаправленное восстановление третичной структуры должно, по-видимому, давать термодинамически наиболее стабильную конформацию, мы вправе, очевидно, сделать из этих опытов вывод, что нативная конформация есть конформация термодинамически наиболее стабильная. [c.114]

Физические свойства растворов ДНК в этиловом и метиловом спиртах (полученных градиентным диализом) были детально изучены [288]. При этом макромолекулярные и оптические критерии (повышенная скорость седиментации, пониженная вязкость, уменьшенный радиус враш,ения, высокое оптическое поглощение) указывают на денатурацию. И хотя разрушение вторичной структуры, судя по макромолекулярным и оптическим критериям, протекает, по-видимому, полностью, денатурация в метанольном растворе происходит быстро, а при добавлении воды легко происходит ренатурация. При нагревании растворов с высоким содержанием метилового спирта также наблюдаются необратимые структурные переходы, но и в этом случае при добавлении воды происходит ренатурация. Таким образом, оказалось, что в метанольном растворе могут быть получены две формы денатурированной ДНК, причем обе они отличаются от ДНК, денатурированной в водном растворе [284]. Если денатурация ДНК многими органическими растворителями (включая диметилформамид) легко обратима при добавлении водных растворов электролитов, то денатурация в диметилсульфоксиде протекает необратимо [402]. [c.597]

Денатурация н ренатурация белков. До настоящего времени в белкоаой химии сохранился термин неупорядоченная структура или неупорядоченный (статистический) клубок . Так называют любые пространственные формы полипептидной цепи, которые не охватываются каноническими конформациями. Принято говорить о переходах а-спираль — клубок, р-структура -> клубок и т. п. Такого рода рассмотрение постепенно утрачивает свое значение, ибо неупорядоченная структура, если она входит в состав биологически активного белка, должна описываться в точных терминах (углы Ч, 11. X координаты атомов). Однако не канонические формы труднее поддаются характеристике с помощью физико-химических методов, что, по-видимому, и обусловило появление не очень точного термина неупорядоченная структура . [c.103]

В следующей главе будет подробно рассмотрено явление трансформации бактерий — перенос определенных, передаваемых потомству признаков, например устойчивости к определенному яду, с помощью ДНК, выделенной из устойчивого к яду штамма бактерий. Трансформирующая активность присуща только нативной форме ДНК. Измеряя ее, можно пользоваться этим показателем для количественной характеристики глубины денатурации и ренатурации ДНК. При изучении кинетики ренатурации ДНК выяснилось, что глубина процесса ренатурации, а также его скорость растут с концентрацией ДНК в растворе (рис. 85). [c.269]

При кратковременном действии денатурирующих факторов конформационные изменения незначительны, и поэтому возможен переход белка снова в нативную форму и восстановление его биологических свойств (ренатурация). [c.12]

Механизм формирования нативных молекул из денатурированных можно исследовать при помощи белков с восстановленными дисульфидными связями. Реокисление таких белков сопровождается их ренатурацией, и на стадиях, соответствующих частичному окислению, могут быть обнаружены промежуточные формы. Для этого останавливают реакцию в соответствующий момент времени, когда успевает образоваться какая-то часть дисульфидных связей, и обрабатывают белок одной или несколькими протеазами, с тем чтобы выделить фрагменты, содержащие S—S-связи. Полученные пептиды можно сравнить с пептидами, выделенными подобным же образом из нативного белка. [c.234]

Мы остановимся здесь на кинетике переходов между одно- и двухцепочечными формами в простых модельных олигонуклеотидных комплексах, а затем покажем, как использовать эту информацию при анализе кинетики денатурации и ренатурации ДНК. Этот анализ послужит основой для выяснения количественных закономерностей гибридизации нуклеиновых кислот, одной из наиболее часто используемых методик в современной молекулярной биологии эукариот. [c.332]

Найденные низкоэнергетические структуры двух шейпов тетрадекапептида представляют интерес потому, что в случае шейпа 62/465/2 форма основной цепи полностью совпадает с конформацией фрагмента Arg - ys в кристаллической структуре БПТИ. Более того, у самой выгодной конформации этого типа рассчитанные значения двугранных углов ф, V, со и X совпадают с экспериментальными. Вторая группа низко-энергетических конформаций шейпа 62/462/62/2 может реализоваться при свертывании белковой цепи в условиях in vitro в процессе ренатурации восстановленной молекулы БПТИ. Т. Крейтон [7] при исследовании промежуточных состояний, образующихся при свертывании денатурированной белковой цепи, обнаружил продукт с дисульфидной связью между ys и ys , которая отсутствует в нативной структуре БПТИ. В свете полученных результатов образование такой связи весьма вероятно. Расчет показал, что в самых предпочтительных по энергии конформациях 62/462/62/2 свободного тетрадекапептида Arg - ys остатки ys и ys оказываются сближенными (см. рис. IV.9). Таким образом, из найденных теоретически низкоэнергетических конформаций двух форм основной цепи [c.438]

Вернемся теперь к ренатурации молекулы БПТИ. Обнаруженная Крейтоном [7] в самом начале этого процесса статистическая смесь моно-85-продуктов может быть смело отнесена к добифуркационному этапу сборки, когда еще не сложились автономные конформационно жесткие структуры и состояние белковой цепи почти полностью определялось обратимыми флуктуациями. Через короткое время селекция беспорядочных конформационных отклонений привела к возникновению на участках Лг -Рго (см. рис. 1У.7), РНе 2-01п (см. табл. 1У.7) и А1а" -01у стабильных пространственных форм, а на промежуточных участках последовательности БПТИ к немногочисленным наборам структурных вариантов. После уменьшения конформационной свободы продукты с одной дисульфидной связью в денатурированной цепи уже не могут оставаться равновероятными. Существовавшая ранее статистическая смесь 15 моно-58-продуктов автоматически дифференцируется по энергии. В результате, как показывает опыт, наиболее предпочтительными оказываются два продукта. Один из них содержит связь Су5 °-Су5 , а другой-Су5 —Су5 °, отсутствующую в нативной конформации белка (рис. IV. 17). Интересно то обстоятельство, что остатки Су5 , Суз и Суз , образующие дисульфидные связи в самых предпочтительных моно-55-про-изводных, входят в конформационно жесткие фрагменты 1-9,22-31 и [c.475]

Другим примером является инсулин, который не удается ренату- рировать, если его нативные дисульфидные связи были разрушены тиолами или если их структура менялась при ферментативных воздействиях [101]. Этот факт стимулировал поиски предшественни->ка, который был действительно обнаружен в форме проинсулина 442]. Проинсулин стабилен к действию фермента дисульфидизомеразы (рис. 4.3) в опытах по денатурации — ренатурации он самопроизвольно повторно свертывается [443]. Протеолитическое расщепление проинсулина in vivo приводит к инсулину, стабильность которо-го обеспечивается энтропийным вкладом его нативной системы связей "S—S (разд. 8.3). Лабильность структуры инсулина имеет, по-види- мо.му, физиологическое значение [444], поскольку скорость инактивации является фактором, контролирующим степень и продолжительность действия гормона. [c.183]

Свертывание пируваткиназы обеспечивается L-валином. Влияние аминокислоты ь-валина на ренатурацию пируваткиназы [466f дрожжей и треониндезаминазы Е. oli [468] иллюстрирует две различные функции, которые могут выполнять лиганды в процессе образования активных олигомерных белков. Пируваткиназа [467] — эго тетрамерный фермент, построенный из четырех идентичных субъединиц, каждая из которых содержит одну молекулу невалентно связанного L-валина. Субъединицы диссоциируют и развертываются при действии 6 М гидрохлорида гуанидина. При выдерживании в ренатурирующей среде L-валин служит специфичным инициатором процесса повторного свертывания. Он индуцирует ренатурацию с константой скорости псевдопервого порядка по отношению к мономеру, а это означает, что L-валин влияет на свертывание мономерной формы в ее нативную конформацию и что завершающим процессом является спонтанное образование тетрамерного фермента. ь-Валин остается составной частью всей структуры молекулы Нативного белка [466]. [c.191]

Так, например, если цепи ДНК разделить денатурированием, то ни одна из разошедшихся цепей инфекционностью обладать не будет (в системе с фагом-помощником). После ренатурации, однако, инфекционность восстанавливается 1951. Во время литической реакции ДНК фага находится преимущественно в суперспирализованной кольцевой форме, которая соответствует репликативной промежуточной форме ДНК этого фага. Кольцо разрывается только ко времени созревания вируса 1574]. [c.253]

Реассоциацию ДНК обычно изображают в виде кривой gi, где значениям log t соответствует процентное содержание в смеси фракции реассоциировавшей ДНК (1 - С/Со). На рис. 17.2 приведены кривые t для нескольких геномов. Форма кривых одинакова, ренатурация осуществляется в диапазоне изменения значений gi [c.224]

Рис. 9.4. Сравнение кинетики реассоциации фрагментов ДНК Е. соИ и фрагментов ДНК теленка. Форма графика для ДНК Е. oli очень близка к теоретической кривой, представленной на рис. 9.2, что указывает на то, что ренатурация ДНК происходит при единственном неизменном значении константы скорости реакции f j- Напротив, график кине-

На рис. 9.4 сравниваются кривые ренатурации бактериальной ДНК и ДНК эукариотических организмов. По форме кривой видно, что ренатурация бактериальной ДНК происходит при неизменном значении константы скорости реакции второго порядка, т. е. в соответствии с уравнением (2). Напротив, кривая ренатурации ДНК эукариотического организма свидетельствует о том, что в процессе ренатурации величина 2 должна изменяться. Для того, чтобы интерпретиро- [c.266]

Сильным ионным детергентом типа ДСН можно солюбилизировать даже самые гидрофобные белки мембран. Это позволяет анализировать такие белки методом электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем ДСН. Разработка данной методики произвела настоящую революцию в изучении мембранных белков. Детергенты такого типа разворачивают (денатурируют) полипептидиую цепь белка, внедряясь в его внутреннее гидрофобное ядро (см. рис. 3-22). Обычно при этом белки утрачивают активность и становятся непригодными для исследования их функции. Тем не менее белки могут быть легко очищены в денатурироваппой под действием ДСН форме. В некоторых случаях удаление детергента приводит к ренатурации и восстановлению функциональной активности. [c.362]

Полипептиды в растворе сохраняют способность к агрегации, поскольку у них имеются внутримолекулярные ковалентные связи, такие, как дисульфидные мостики. Если необходимо полностью разрушить эти связи, к солюбилизирующему агенту добавляют восстановители тиоловых групп — дитиотрейтол (ДТТ) или 2-меркаптоэтанол (2-МЭ). Другой метод, который может быть использован для разрушения внутримолекулярных дисульфидных связей, — получение производных в форме 5-сульфона-тов. Такой подход был использован в случае А- и В-цепей инсулина [11] (табл. 4.15). Есть ли необходимость в полном разрушении таких связей, можно определить, только исследуя процесс ренатурации белка и восстановления его активности. Не всегда необходимо полностью разрушать дисульфидные связи между отдельными цепями молекулы при ренатурации белковой молекулы можно создать условия, обеспечивающие тиол-дисульфидный обмен с образованием мономерных молекул, соединенных дисульфидными связями (разд. 4.3.5). [c.118]

Полипептиды небольших размеров, синтезируемые в клетках В. соИ в виде нерастворимых гибридных белков, также приходится переводить в растворимую форму, но тш,ательное определение условий их ренатурации не обязательно. Типичный пример — -эндорфин [10] этот полипептид, по-видимому, спонтанно ренатурирует либо в процессе его выделения из гибридного белка (табл. 4.9), либо в ходе очистки при экстракции стеклянным порошком. Кальцитонин человека — полипептид, который состоит из 32 аминокислот и включает два остатка цистеина, образующие в биологически активной молекуле дисульфндную связь. При разделении гибридного белка (табл. 4.8) отделенный от бактериального полипептида кальцитонин находится в двух формах восстановленной и окисленной, которые можно обна- [c.122]

В серии работ П. Льюиса и Г. Шераги [74, 75] рассмотрен механизм свертывания полипептидных цепей в белках при учете только ближних взаимодействий. Предполагалось, что в процессе ренатурации или сразу же после биосинтеза самосборка белковой цепи в нативную конформацию начинается с образования а-спиралей, которые в дальнейшем и определяют направление свертывания окончательной структуры. Следовательно, в этих работах постулировалось, что регулярные конформации являются самыми стабильными формами в гетерогенной последовательности, составляют жесткую основу глобулы и играют ключевую роль в процессе самосборки белковой цепи. Сближенность спиралей и образование контактов между ними осуществляются так называемыми -изгибами. С. Венкатачалам ранее показал, что поворот цепи на 180° может происходить на участке из четырех остатков с определенными комбинациями форм их основных цепей [76]. Позднее Е.М. Поповым и сотрудниками была получена энергетическая оценка всех возможных конформационных состояний двух центральных остатков тетрапептида, обеспечивающих такой поворот цепи [77], П. Льюис и Г. Шерага рассмотрели аминокислотный состав тетрапептидов в трех белках известной структуры и отметили повышенную тенденцию находиться в -изгибах у остатков Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Pro, Trp и Tyr [74]. Поворотные сегменты являются менее гидрофобными, чем белок в целом. Вначале авторы полагали, что в образовании изгибов, как и в случае регулярных структур, важное значение имеют лишь ближние взаимодействия. Это послужило основой определения вероятности локализации каждого остатка в одном из четырех мест -изгиба независимо от соседей. Вероятность появления изгиба определялась как произведение индивидуальных вероятностей четырех остатков, найденных с помощью статистического анализа. В дальнейшем при рассмотрении аминокислотного состава 135 -изгибов в структурах восьми белков к остаткам, имеющим наибольшую склонность образовывать повороты цепи, Льюис и Шерага отнесли Ser, Thr, Asp и Asn [78]. На основе расчета трех тетрапептидов в различных конформационных состояниях, имеющих изгибы, они пришли к заключению, что в местах поворота цепи остатки не ведут себя независимо. Их конформации взаимообусловлены и, кроме того, подвержены влиянию [c.249]

Положение о том, что информация о сборке белка заключена в строении самой белковой молекулы, до недавнего времени являлось общепринятым и воспринималось буквально. Менее очевидными представлялись (и все еще остаются таковыми) побудительные мотивы и механизм спонтанного свертывания белковой цепи. Их трактовка обычно исходила из предположения о появлении на ранней стадии ренатурации вторичных структур, сгатающихся самыми стабильными из всех возможных форм полипептидной цепи, гидрофобном схлопыва-нии и возникновении так называемой расплавленной глобулы, содержащей многие элементы конечной структуры, и образовании стабилизирующих нативную конформацию ковалентных и ионных взаимодействий, подобных дисульфидным связям и ионным парам (см. гл. 7 и 12 и обзоры последних лет [18, 108, 171—175]). Однако эти объяснения в значительной мере имели гипотетический характер. Ни одно из них в течение десятилетий не смогло привести к разработке [c.410]

Возникает вопрос откуда берутся в денатурированной форме элементы упорядоченных структур Скорее всего такие элементы а-спиралей и /3-слоев образуются в разупоряло-ченной цепи флуктуационно. В этой связи представляют интерес эксперименты по ультразвуковой релаксации (G. Hammes, Р. Roberts, 1969) для выяснения динамики перехода спираль — клубок в поли-Ь-орнитине. Измерения показали, что время релаксации перехода составляет примерно 10 с. Это означает, что скорость формирования и разрушения спирали на несколько порядков выше, чем наблюдаемая скорость процесса сворачивания — разворачивания белков в целом. Таким образом, денатурированные молекулы могут находиться в состоянии динамического равновесия с набором молекул, среди которых есть такие, которые содержат спиральные участки. Эти участки в свою очередь могут служить центрами нуклеации при ренатурации белка. [c.235]

Степень ренатурации, которая наблюдается на опыте, зависит от экспериментальных условий и от природы ДНК. Если резко понизить температуру раствора от значения, лежащего значительно выше 7" , до значения, лежащего намного ниже вероятность того, что разошедшиеся комплементарные цепи найдут друг друга, будет очень мала. Внут-рицепочечная вторичная структура, сформировавшаяся при охлаждении, будет очень стабильна, и восстановление нативной структуры окажется полностью блокированным. Такую ДНК обычно называют денатурированной, хотя считать ее одноцепочечной, как это часто делают, нельзя. В ней имеются двухцепочечные области, которые препятствуют ренатурации. Если вместо быстрого охлаждения производить медленный отжиг ДНК, постепенно понижая температуру раствора или в течение длительного времени поддерживая ее на одном уровне вблизи Т , то, хотя внутрицепочечные шпильки и будут образовываться, они будут не очень стабильны. Со временем сформируются правильные зародыши двухцепочечной формы, и по мере дальнейшего понижения температуры будет происходить их разрастание вплоть до образования нативной структуры. [c.343]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология