Карбоксипептидаза остатки Туг

С-концевой остаток фенилаланина в субстрате карбоксипептидазы [c.82]

Наиболее успешным методом определения С-концевых остатков является не химический метод, а ферментативный. Селективное удаление С-концевого звена осуществляется при помощи фермента карбоксипептидазы (из поджелудочной железы), которая расщепляет лишь ту пептидную связь,которая расположена в а-положении к свободной а-карбоксильной группе в полипептид-ной цепи. Анализ можно повторить на укороченном пептиде с тем, чтобы идентифицировать новый С-концевой остаток и т. д. [c.1049]

Рис. 62. Схема активного центра карбоксипептидазы А (остаток Туг 198 на схеме не изображен) фермента, катализирующего гидролитическое отщепление С-концевого аминокислотного фрагмента от полипептидов. Фермент абсолютно специфичен к Ь-конфи-гурации отщепляемого аминокислотного остатка и резко преимущественно катализирует отщепление остатков гидрофобных аминокислот. Гидролиз в этом случае протекает по механизму электрофильного катализа и требует участия иона цинка — в белке какие-либо группы, способные выступать в роли электрофиль-ных катализаторов, отсутствуют. Ион цинка фиксирован в активном центре фермента путем координации тремя аминокислотными остатками — двумя остатками гистидина 1118-69 и Н18-196 и одним глутамат-ионом С1и-72. Четвертая координата (для ионов цинка характерна тетраэдрическая зр -конфигурация координационных связей) направлена в комплексе фермент — субстрат на карбонильную группу гидролизуемой пептидной связи. Фиксация С-концевой части гидролизуемого пептида в активном центре обеспечивается в первую очередь взаимодействием с двумя остатками аргинина — Aгg-145 и Arg-127 и кластером гидрофобных

С-Концевой анализ можно провести с помощью фермента карбоксипептидазы, который специфически отщепляет С-конце-вой остаток от белка. Эту аминокислоту затем можно идентифицировать. Далее процесс повторяют на оставшемся белке и определяют следующий остаток и т. д. до определения всей последовательности. [c.268]

Распределение остатков внутри и снаружи молекулы согласуется с данными для других глобулярных белков. Гидрофобные остатки предпочтительнее располагаются внутри молекулы, а заряженные группы — снаружи [52]. Поскольку участок в р-форме находится главным образом внутри глобулы, в нем обнаружено много гидрофобных аминокислот, в том числе лейцина и фенилаланина. Всего в контакте с водой не принимают участия 78 остатков. Из них 22 могут образовывать водородную связь с атомами пептидной связи или близлежащих остатков, и, по-видимому, эта возможность почти во всех случаях реализуется [3, 52]. Два остатка триптофана (63 и 147) и один остаток тирозина (238) спрятаны внутри молекулы КПА. Остальные остатки этих аминокислот находятся в частичном контакте с растворителем. Существование водородной связи между ОН-группой Туг-238 и карбонильной группой Glu-270, вероятно, имеет некоторое значение для конформационного изменения с участием Glu-270 при связывании субстрата, как описано ниже. Четыре из десяти остатков пролина расположены у N-концов спиральных участков, а три —у концов наиболее длинных цепей в слое с р-структурой. Во внутренней части молекулы находятся три карбоксильные группы, принадлежащие остаткам 104, 108 и 292. Конечно, справедливость этого утверждения зависит от того, насколько правильно установлен тот факт, что они являются свободными и не участвуют в образовании амидных связей. Карбоксильная группа Glu-292 образует солевой мостик с Arg-272, так что ее заряд локально нейтрализован. Детальное изучение карт электронной плотности обнаружило неизвестный ранее факт внедрения в молекулу карбоксипептидазы десяти молекул воды [52]. [c.514]

Наконец, карбоксипептидаза поджелудочной железы может специфически отщеплять С-концевой остаток. Будучи простым и удобным, этот ферментативный метод мог быть применен к пептидам и белкам. Однако его ограничения совершенно очевидны. Сродство карбоксипептидазы к С-концевым связям зависит от химической природы С-концевого остатка и, возможно, также от природы второго соседнего остатка. Таким образом, должны быть сделаны следующие заключения а) карбоксипептидаза может не отщепить аминокислоту, даже если в молекуле пептида действительно имеется С-концевой остаток б) возможно почти одновременно отщепление первой и второй аминокислоты в) в случае белков, содержащих более чем одну полипептидную цепь, вторая аминокислота первой цепи может выделиться прежде, чем первая аминокислота прочих цепей. [c.160]

Вызывали недоумение низкие выходы аминокислот после отщепления третьего, пятого, шестого, седьмого остатков, что говорило о плохом отщеплении His (или об отсутствии его) в третьем положении. Более высокие, чем для остальных аминокислот, выходы Ser (4-й остаток) позволяли предположить, что в изучаемой области содержится более одного остатка Ser, хотя установить точное местоположение второго Ser было невозможно. В литературе [3] указывалось, что с помощью карбоксипептидаз редко удается надежно определить последовательность более трех-четырех остатков, хотя и существует большой соблазн сделать выводы, выходящие за рамки надежной интерпретации результатов. [c.510]

Карбоксипептидаза А гидролизует белки с С-конца полипептидной цепи. Она специфична в отношении гидрофобных боковых цепей фенилаланина, тирозина и триптофана. Карбоксипептидаза В специфична в отношении положительно заряженных боковых цепей лизина и аргинина. Между этими ферментами существует такая же связь, как между химотрипсином и трипсином. Их аминокислотные последовательности идентичны на 49%. Что касается различий в третичной структуре, то они имеются лишь в участках молекул, расположенных на поверхности. Основное отличие состоит в том, что остаток Пе-255, находящийся в кармане карбоксипептидазы А, в карбоксипептидазе В заменен на Азр-255, необходимый для связывания положительно заряженных боковых цепей основных субстратов. [c.33]

ПРОНАЗА КОМПЛЕКС, частично очищенная от балластных белков смесь протеолитических ферментов, продуцируемых штаммом Streptomy es griseus К-1 содержит эндопептидазы, аминопептидазы и карбоксипептидазы. Осн. компоненты П.к.-сериновые протеиназы А-Е (содержат в активном центре остаток серина). Ферменты П. к. стабилизируются добавлением Са " . Мол, массы компонентов П.к. 16-27 тыс. для протеиназ А, В, D, Е установлена первичная структура, а для А и В-пространств, строение. [c.101]

Пролин и оксипролин полностью устойчивы к действию фермента.- Цистеин в продуктах расщепления не был обнаружен. Полуцистин, если он присутствует в продуктах расщепления, мог образоваться за счет разрыва пептидной связи при этом связь с полипептидной цепью дисульфидным мостиком сохраняется. Окисление остатков цистина в цистеиновую кислоту не должно давать способную отщепляться под действием карбоксипептидазы группу, так как она содержит заряженную боковую цепь, но восстановление и алкилирование до --S H2 ONH2-rpynn приводят к образованию нейтрального остатка. Такой остаток был недавно обнаружен [198] в гидроЛизатах, полученных при действии карбоксипептидазы на восстановленный и алкилированный пролактин, что свидетельствует о присутствия С-концевого полуцисти нового остатка. [c.233]

Расщепление карбоксипептидазой. pH 0,5 %-ного раствора исследуемого белка доводят до 8 в автотитраторе 0,01 и. NaOH под струей азота. Затем добавляют V30 часть ДИПФФ-обработанной карбоксипептидазы. Гидролиз длится 2—16 ч с отбором проб через каждые 60 мин. Пробы, содержащие по 0,2—0,3 мкмоля субстрата, депротеинизируют 1 объемом 10%-ной трихлоруксусной кислоты, осадок удаляют фильтрованием и фильтрат пропускают через колонку амберлита IR-4B в ацетатной ( юрме (0,5 х 5 см) для удаления трихлоруксусной кислоты. После этого раствор упаривают в вакууме, остаток растворяют в нескольких каплях дистиллированной воды и хроматографируют в системе бутанол — вода или исследуют на аминокислотном анализаторе. [c.292]

Карбоксипептидазы А и В образуются при гидролизе трипсином соответствующих прокарбоксипептидазных предшественников, синтезируемых в поджелудочной железе [187J. Из этих двух ферментов более подробно изучена карбоксипептидаза А, и проведено ее детальное исследование методом рентгеноструктурного анализа [29, 188, 189]. Карбоксипептидаза А быка (КПА) представляет собой фермент, содержащий 307 аминокислот в единственной полипептидной цепи, которая прочно связывает 1 г-ион Zn(II) на 1 моль фермента. Необходимость Zn(ll) для ферментативной активности была впервые продемонстрирована тем, что КПА, свободная от иона металла, неактивна, но активность восстанавливается при добавлении Zn(II) [190, 191]. По-видимому, фермент, не содержащий металла, в основном сохраняет структурные свойства активной КПА [191]. Позже на основе данных рентгеноструктурного анализа [29] было четко установлено, что роль иона Zn(ll) при гидролизе пептидов заключается в связывании субстрата. При протеолизе фермент проявляет стереохимическую специфичность, отщепляя С-конце-вую аминокислоту от пептидной цепи только в том случае, если С-концевая карбоксильная группа свободна и если аминокислота имеет L-конфигурацию [192, 193]. Обычно наблюдается более высокая активность, если остаток С-концевой аминокислоты содержит ароматическую группу или разветвленную цепь [194]. [c.76]

Трипсин количественно гидролизовал связь Аг -УаР, а химотрипсин — связь Туг -Уа1 . Карбоксипептидаза отщепила только С-концевой остаток фенилаланина, а лейцинаминопептидаза (свободная от пролидазы) — первые пять аминокислот. В пользу ь-конфигурации пролина говорил как общий план синтеза, так и легкое расщепление связи Рго-РЬе. Конфигурация остатка гистидина в положении 6 установлена путем гидролиза химотрипсином, разделения образовавшейся смеси противоточным распределением, выделения С-концевого тетрапептида Н-Уа1-Н15-Рго-Р11е-ОН и его кислотного гидролиза. Пространственные препятствия, обусловленные наличием остатка валина (ср. [2253]), являлись причиной того, что гидролиз проходил до конца лишь в жестких условиях (64 час, 105° или 24 час, 115°К вследствие чего свободные аминокислоты подвергались частичной рацемизации. Степень рацемизации определена сравнением со смесью эквимолярного количества аминокислот, составляющих данный пептид. Как оказалось, присутствующий в смеси гистидин в условиях гидролиза рацемизуется на 8—10%. Путем разложения оксидазой ь-аминокислот установлено, что с учетом этого количества рацемата весь гистидин присутствует в ь-фор-ме. Таким образом, доказано, что синтетический пептид является а11-ь-соединением. [c.404]

При интерпретации полученных результатов трудности возникают в том случае, когда неизвестно точно, состоит ли белок из одной или из нескольких иолипептидных цепей. Всегда также нужно-учитывать возможность, что С-концевая последовательность представлена двумя идентичными остатками (как, например, -Фен-Фен-в бычьем гормоне роста) [10]. Известен ряд белков, которые не-атакуются карбоксипептидазой С-концевой остаток в таких слу- [c.189]

Точно так же следует отказаться от разделения протеолитических ферментов из эндо- и экзопептидазы. До последнего времени предполагалось, что экзопептидазы действуют только на пептиды, имеющие, свободную аминную или карбоксильную группу, в связи с чем они подразделялись еще на аминопепти-дазы и карбоксипептидазы. Недавно, однако, было показано, что лейцинаминопептидаза способна гидролизовать глициллей-цинамид, хотя остаток лейцина в этом субстрате не имеет свободной аминогруппы [26]. [c.279]

Нонапептиды, полученные двумя различными путями, не отличались друг от друга ни по аналитическим данным, ни до биологической активности. Кроме того, поведение синтетических соединений по 5тношению к протеолитнческим ферментам не отличалось от поведения природного брадикинина (ср. [667]). При инкубировании с химотрипсином легко происходило отщепление 1 моля аргинина, а последующий разрыв пептидной связи Phe -Ser , приводящий к образованию H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-OH и H-Ser-Pro-Phe-OH, протекал значительно медленнее. Карбоксипептидаза отщепляла только С-концевой остаток фенилаланина (Phe ) у октапептида, образовавшегося при инкубировании с химотрипсином. [c.122]

Карбоксипептидаза отщепляет аминокислоту со стороны свободной карбоксильной группы. Разрыв происходит по месту первой пептидной связи от этого конца цепи, особенно если остаток связанной пептидной связью аминокислоты будет радикалом тирозина или фенилаланина. Необходимым условием действия этого фермента является наличие хотя бы одного незамещенного водорода при углероде, связанном непосредственно с карбоксильной группой (так называемый пептидный водород). Присутствие свободной аминной группы мешает действию фермента. [c.344]

Однако на примере ряда ферментов, и рибонуклеазы в частности, было показано, что не бся молекула, а лишь некоторая ее часть (активный участок) ответственна за каталитическую активность. Так, Ричардс, используя фермент субтилнэи /, расщепил молекулу рибонуклеазы по связи между звеньями 20 и 21 (пептидная связь Ala — Ser), и при этом вторичная и третичная структуры удержали молекулу как целое. Сохранились и ферментативные свойства. Но при хроматографии на кислом ионообменнике короткий пептид из 20 аминокислотных остатков отделился от остальной части. Обе части молекулы были лишены ферментативной активности, однако прн сменгении их активность вновь возникала. У отделенной больпк й части белковой молекулы еще сохранилась способность связывать обычный для рибонуклеазы субстрат ферментативной реакции, но не расщеплять его. П])и гидролизе рибонуклеазы карбоксипептидазой и отщеплении с С-коица трех аминокислот — валина, серина и аланина активность рибонуклеазы не страдает. При гидролизе пепсином разрывается четвертая связь с С-конца и отщепляется кроме валина, серина и аланина еще н аспарагиновая кислота. Тогда остаток рибонуклеазы полностью теряет активность. Подобным же образом устанавливается существенность двух остатков His в положениях 12 и 119. Сказанное имеет целью дать понятие об исследовании структуры белка как фермента. [c.703]

Как отмечалось выше, первая углевод-пептидная связь, природа которой была твердо установлена,— это углевод-пептидная связь в яичном альбумине. В результате параллельных исследований ученых СССР, Японии, США и Англии было показано, что связующее звено представляет собой 2-ацетамидо-1-(ь-р-аспартамидо)-1,2-дидезокси-р-в-глюкозу (том 2, рис. 1). В ряде ранних работ [7, 33—36] по составу гликопентидов, получаемых при ферментативном гидролизе яичного альбумина, было показано, что аминокислотой, непосредственно связанной с углеводным фрагментом этого гликопротеина, является аспарагиновая кислота. Однако все эти препараты давали при дальнейшем гидролизе переменные количества лейцина, треонина и серина, которые обычно присутствуют в меньших количествах, чем аспарагиновая кислота. Позднее Богданов и сотр. [2] показали, что устойчивость гликопептида к действию карбоксипептидазы можно уменьшить, предварительно защитив свободную аминогруппу остатка аспарагиновой кислоты. Это позволило получить гликопептид, содержащий лишь следы других аминокислот [24, 37]. Количество аспарагиновой кислоты ясно указывало, что моль гликопептида содержит один аминокислотный остаток. Ранние исследования действия щелочи на гликопептид показали, что послед- [c.280]

С-Концевой аминокислотный остаток был тоже идентифицирован, правда, с некоторыми трудностями. По-видимому, это пролин, хотя более ранние исследователи считали, что это аланин. Штейнберг [98, 106] нашел, что карбоксипептидаза отщепляла приблизительно один остаток аланина, но если фермент предварительно обработать диизонропилфторофосфонатом [c.16]

Насколько геометрические параметры реальных конформационных состояний полипептидной цепи отличаются от параметров так называемых вторичных структур, можно судить по рис. П.З, на котором показано распределение на конформационных картах ф—ф остатков некоторых сегментов цепей а-химотрипсина, карбоксипептидазы А и лизоцима [61]. Во всех исследованиях, посвященных поиску эмпирических корреляций, эти сегменты отнесены к а-спиральным или -структурным. Из рис. П.З видно, что в экспериментально наблюдаемых конформационных состояниях остатков, включенных при статистической обработке во вторичные структуры, значения двухгранных углов ф, ф не только не выражаются в точки ( фц, фц) и ( фр, фр), что должно иметь место при строгой регулярности структур, а обнаруживают существенный разброс в пределах а- и -областей. Более того, в ряде случаев значения ф, ф остатков а- и -сегментов вообще находятся в совершенно других местах конформационной карты. Если ограничить отклонения а-спиральных углов ф, ф от стандартных значений, например 15°, то в трех приведенных примерах в а-спиральных сегментах окажется не 41 остаток, а лишь 18 что же касается -структуры, то при таком ограничении углов ф, ф в нее не попадет больше двух остатков. Если же исключить из структур, считающихся вторичными, по три остатка с их N- и С-концов, которые, как правило, имеют большие отклонения по углам ф, ф или отвечают другим конформационным состояниям, то содержание в глобулярных белках участков, действительно близких к регулярным, уменьшится по сравнению с принятыми в литературе в 2—3 раза. При введении количественного критерия регулярности нельзя уже будет считать вторичными структурами большинство коротких а-спиралей и -структур, в том числе и большинство спиралей из 4—9 остатков, которые являются самыми распространенными в белках. В связи с тем, что в реальных белках вторичные структуры не обладают правильными регулярными формами, их идентификация субъективна и существенно отличается у разных авторов. Например, в лизоциме Чоу и Фасман [99] к а-спиралям и -структурам относят соответственно 54 и 21 остаток, а Бэржес и соавт. [101] — 46 и 4 в субтилизине BPN (отнесения [101] даны в скобках) — 86 (69) и 27 (44), в папаине — 54 (50) и 30 (21). Подобных примеров можно привести очень много. [c.269]

Еще один пример корреляции структуры субстратов и их реакционноспособ-ности - это гидролиз пептидов карбоксипептидазой А. Для серий субстратов гХ-РЬе и гС1у-Х, где X - варьируемый аминокислотный остаток, была обнаружена [1738] линейная зависимость от гидрофобности боковой цепи остатка X (рис. 59,а). Однако каталитическая 1сонстанта (й . ) для этих веществ практически не зависит от гидрофобной боковой цепи (рис.59,6). [c.180]

Наконец, следует упомянуть весьма неожиданный результат замены остатка Туг248 в карбоксипептидазе А на остаток фенилаланина [21351. Такая мутация не изменила fe. и лишь несколько увеличила значение К. Поскольку феноль- [c.199]

Ферментативный метод заключается в использовании нанкреатиче их карбоксипептидаз. Карбоксипептидаза А отщепляет от белка или пептида только тот остаток, который несет свободную а-карбоксильную группу. По аналогии с методом, в основу которого положено расщепление белка аминопепти-дазой (разд. 6.1.2.1), информацию, касающуюся СООН-концевой последовательности, можно получить с помощью измерения скорости отщепления каждого следующего остатка например, в белке с последовательностью-NH2—A-B- -D. .. W-X-Y-Z—СООН при заданном времени гидролиза количество отщепленного Z всегда больше, чем У, и т. д. Карбоксипептидаза А малоактивна или неактивна вовсе к СООН-концевым остаткам пролина, аргинина или лизина. Карбоксипептидаза В в отличие от карбоксипептидазы А отщепляет СООН-концевые остатки лизина и аргинина (табл. 6.3). [c.177]

Смотреть страницы где упоминается термин Карбоксипептидаза остатки Туг: [c.352] [c.412] [c.369] [c.31] [c.403] [c.403] [c.99] [c.110] [c.229] [c.342] [c.506] [c.539] [c.337] [c.487] [c.74] [c.29] [c.260] [c.92] [c.300] [c.301] [c.485] [c.511] [c.183] [c.377] [c.378]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология