Акриламид также Электрофорез

Для выделения, очистки и проверки гомогенности отдельных классов липопротеидов плазмы используют также электрофорез на различных носителях (бумага, ацетат целлюлозы, агар-агар, акриламид и т. д.). Разделение липопротеидов плазмы на классы и очистка возможны и с помощью методов осаждения [298, р. 15]. Наиболее распространенный вариант их основан на способности липопротеидов образовывать нерастворимые комплексы с различными полимерами поликатионами (поли-винилпирролидон и др.), полианионами (сульфаты полисахаридов) и [c.369]

Второй метод состоит в измерении пути, пройденного белком при электрофорезе в полиакриламидном геле здесь тоже существует зависимость между молекулярной массой белка и длиной пробега. Еще более отчетливо она выявляется при сопоставлении торможения пробега белка при переходе от электрофореза его в геле с меньшим содержанием акриламида к электрофорезу в геле с большим содержанием акриламида. В этом случае также строят калибровочные графики по маркерным белкам и по ним находят молекулярную массу неизвестного белка. [c.37]

Сильный подъем в применении КЭ, особенно КГЭ, а также появление в продаже промышленных приборов связаны с американским проектом "Геном человека". С помощью метода КГЭ практически полностью были разделены молекулы ДНК в реакции определения последовательности нуклеотидов ДНК или остаточных фрагментов. Из применяемых типов гелей в классическом планарном гелевом электрофорезе в капиллярах в качестве матриц применяют в основном акриламид, агарозу и целлюлозу. Эти гели очень сильно различаются по своим физическим свойствам, таким как вязкость, стабильность в электрическом поле, пористая структура и размер пор. [c.96]

Электрофорез проводят обычным способом, а затем на электрофореграмму осторожно, следя за тем, чтобы обе поверхности полностью соприкасались, накладывают индикаторный гель, содержащий субстрат, соответствующий буфер и кофакторы. Этот сэндвич инкубируют во влажной камере. После инкубации индикаторный гель (а в некоторых случаях исходную электрофореграмму) окрашивают для обнаружения продукта ферментативной реакции. Таким образом, этот метод дает контактный отпечаток зон, содержащих ферменты. Иногда индикаторный гель заменяют полоской фильтровальной бумаги. Обычно индикаторные гели готовят из агара или крахмала и значительно реже — из акриламида. Следует отметить, что данный метод позволяет также обнаруживать ферменты, имеющие низкомолекулярные субстраты. [c.281]

Фракционирование рибосомных белков очень часто проводят также и методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Первое успешное применение этого метода описано Уорнером [1375]. Рибосомы, белки которых были помечены радиоактивными изотопами, растворяли в 0,1 М фосфатном буфере, содержавшем 0,5% ДСН и 0,5 М мочевину, и наносили на поверхность разделяющего геля. В состав этого геля входили 10%-ный акриламид и буфер, применявшийся для растворения рибосом. После электрофореза гели разрезали и по радиоактивности определяли положение белков. [c.311]

Простой электрофорез можно также проводить в крахмальном геле. Крахмал по своим свойствам и поведению при геле-образовании отличается меньшим постоянством по сравнению с акриламидом. Однако до того, как полиакриламидные системы получили широкое распространение, крахмальный гель был очень популярен. Его и теперь охотно применяют для определения ферментативной активности после электрофореза пластину крахмального геля легко разрезать пополам по толщине одну половину окрасить на белки, а другую использовать для определения ферментативной активности (см. рнс. 9.6). Из-за того что крахмальные гели мутные, зоны окрашенных белков видны лишь на поверхности, поэтому для надежного детектирования количество разделяемых белков должно быть больше. [c.319]

Это четвертый электрофоретический метод, который также широко используется в настоящее время. Он сходен с гель-электрофорезом в присутствии ДСН в том отношении, что белки в данном случае также разделяются только в соответствии с их размерами, а не по величине зарядов 182]. Концентрация акриламида изменяется по длине пластинки от самого высокого значения (обычно около 30%) в нижней ее части до всего лишь 3% в верхней. Буфер выбирается с высоким значением pH, так что в большинстве своем белки мигрируют в геле к аноду (вниз). Электрофорез длится до тех пор, пока каждый белок не достигнет такого участка в геле, где из-за слишком малых размеров пор он уже не сможет двигаться дальше. Например, небольшие белки могут дойти до участка, содержащего 25% акриламида, а крупные останутся вблизи старта (верхняя часть геля). Как и в системе с ДСН, при электрофорезе в градиентном геле можно определить размеры молекул, если прокалибровать гель с помощью смеси стандартных белков. Однако в данном случае эти размеры будут относиться к нативным белкам, а не к их субъединицам. Система электрофореза в градиентном геле сходна со следующим, пятым методом — изоэлектрическим фокусированием процесс продолжается до тех пор, пока не прекратится перемещение всех белков и пока не завершится фокусирование , или концентрирование, диффузных белковых зон, в результате чего будет достигнута очень высокая степень разрешения. [c.323]

Состав буферов, используемых для электрофореза белков и нуклеиновых кислот, не влияет на процесс полимеризации акриламида. Природа, концентрация и pH буфера определяются особенностями самого процесса электрофореза, которые будут рассмотрены ниже. Полимеризации ПААГ не мешает также присутствие мочевины (даже в высоких концентрациях), гуанидин-хлорида, формамида, сахарозы или таких детергентов, как до- [c.11]

Поперечносшитые полиакрилимидные гели оказались прекрасными носителями и разделительными матрицами для электрофоретического разделения белков в способах, основанных на плоском слоевом электрофорезе, таких как ДИСК-электрофорез, ДДСН-ПААГ-электрофорез или ИЭФ. Это указывает на гидрофильный характер таких гелей, которые проявляют только слабые взаимодействия с биомолекулами. В КЭ возможно также покрытие кварцевой поверхности акриламидом. [c.75]

Электрофорез на крахмальном геле использовали также для разделения и идентификации гемоглобинов [195—197]. Раймонд и сотр. [198—200] считают целесообразным проводить электрофорез на геле акриламида. Как и на крахмальном геле, при этом на акрпламиде можно добиться лучшего разделения, чем на агаровом студне. Эти авторы исследовали разделение проб сыворотки на 3—25 %-ных гелях. Эти же авторы описали методику двумерного электрофореза. Согласно этой методике, электрофорез проводят в одном направлении при данной концентрации геля, затем полосу геля, содержащую разделенные белки, внедряют в слой геля другой концентрации и повторяют электрофорез в другом направлении. Эспиноза [201] использовал такой же принцип и проводил в одном направлении разделение на агаровом геле, а в другом — на крахмальном геле. [c.517]

Не меньшей популярностью пользуется в настоящее время и метод электрофореза в полиакриламидном геле. Добавляя к раствору акриламида, налитому в стеклянные трубки, различные количества мономеров (например, метиленбисакриламид, этилендиакрилат), образующих в процессе полимеризации поперечные сшивки, можно получить гели с различной степенью связанности [137, 404]. Устойчивость к денатурирующим растворителям, например к 8 М раствору мочевины или 1 %-ному раствору додецилсульфата натрия, составляет еще одно важное преимущество этих гелей. При наложении разности потенциалов белки, пептиды, нуклеиновые кислоты и вирусы передвигаются в этих гелях на характерные расстояния, которые зависят главным образом от их молекулярного веса (или веса частицы), а также от степени связанности сшивок геля. Разделившиеся вещества образуют характерные полосы, которые можно выявить либо с помощью методов окрашивания или локального осаждения, либо (в случае разделения радиоактивных веществ) с помощью метода радиоавтографии (см. гл. XI, разд. Б). Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле такова, что с помощью этого метода можно обнаружить и идентифицировать приблизительно 37 видов рибосомных белков [508]. То, что разделение белка на многочисленные полосы происходит в силу действительного различия между белками, а не в результате каких-то артефактов, теперь уже не вызывает солшений. Однако известно, что разделяться на отдельные полосы могут не обязательно совершенно различные вещества, но и такие близкие между собой вещества, как, например, один и тот же белок, у которого часть молекул содержит одну лишнюю амидную (— СО — NH2 С00 ) группу, а другая часть — ацетильную (—NH+— NH — СОСН3) группу [136]. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле [c.61]

Электрофоретическое разделение исследуемых веществ можно также осуществлять на пластинах полиакриламидного геля размерами ЮОХЮО мм при толщине слоя геля от 1 до 3,5 мм. Пластины с углублениями для внесения образцов приготавливают на особых подставках. Для проведения электрофореза требуется специальное оборудование. Конструкция прибора позволяет устанавливать пластины в вертикальное положение при этом канавки для образцов должны быть расположены у верхнего края пластины и контактировать с верхним буфером, тогда как противоположный край пластины должен находиться в контакте с нижним буфером. Необходимо обеспечить циркуляцию охлаждающей жидкости по поверхности пластины с обеих ее сторон. Основное достоинство этой системы заключается в том, что она позволяет проводить одновременное разделение нескольких образцов в одинаковых условиях, благодаря чему их легко можно сравнивать между собой. Считается, что пластины легче анализировать с помощью денситометра, однако для этого необходимо иметь специальный прибор. Кроме того, пластинки можно без особого труда разрезать на полоски и проанализировать их на наличие различных компонентов путем окрашивания или определения радиоактивности. Полоски можно также высушивать и хранить. Однако для приготовления пластин требуется больше акриламида, особенно если анализируется немного образцов. Как и в случае электрофореза в трубках, для данного метода разработан целый ряд однородных и неоднородных ( прерывистых ) буферных систем. Здесь применяются те же способы приготовления гелей, методики разделения и анализа, что и при электрофорезе в трубках. [c.265]

Побочные продукты полимеризации, непрореагировавшие мономеры [230], а также персульфат могут взаимодействовать с исследуемыми веществами и приводить к искажению картины электрофореза. Особенно часто причиной артефактов служит персульфат [168, 678, 877]. Для удаления этих веществ пз геля рекомендуется либо проводить предварительный электрофорез (преэлектрофорез) до нанесения пробы [569, 799, 962, 1000], либо промывать гель буферным раствором [777, 778]. Бремер [168] попытался использовать для полимеризации разделяющего геля рибофлавин вместо персульфата, однако это привело к ухудшению разделения веществ и воспроизводимости результатов, причем полосы белка стали менее четкими [678]. Для защиты компонентов пробы от окисления персульфатом можно воспользоваться антиоксидантами (дитиотреитолом или 2-мер-каптоэтанолом), но необходимо учитывать, что эти вещества снижают скорость полимеризации акриламида, а при высоких концентрациях и вовсе препятствуют ей. Для преодоления этого нежелательного явления следует проводить полимеризацию при 37 °С, а не при комнатной температуре [798]. Нужно отметить, что персульфат, обладающий высоким удельным зарядом, движется в анионной системе впереди любого белка и, если применяется концентрирующий гель, никогда непосредственно не соприкасается с белками. Поэтому было высказано пред- [c.98]

Выход материала, полученного после электрофореза, определяется многими причинами. Потеря белков может произойти вследствие их сорбции на геле, стенках прибора или элементах элюционной камеры [658]. Сорбция белков полиакриламидным гелем зависит от количества нанесенного материала, а также от pH и концентрации геля. Ее нельзя предотвратить добавлением формамида, тиогликолата, сахарозы или полиаспараги-новой кислоты. Однако если заранее ввести в гель (желательно при полимеризации) посторонние белки, то белоксвязываю-щая способность акриламида оказывается насыщенной, и тогда удается частично или полностью избежать адсорбции исследуемых белков. Для этой цели особенно пригодны белки с высокой подвижностью (глюкагон, бацитрацин, В-цепь инсулина). [c.116]

Если б с-акриламид заменить М.ы -диаллилтартардиамидом) в той же молярной концентрации, то образовавшийся полиакриламидный гель будет легко растворяться в 2%-ной йодной кислоте при комнатной температуре (20—30 мин) или при 37 °С (10 мин) [40]. После проведения в таком геле электрофореза( с применением щелочного буфера его сначала нейтрализуют уксусной кислотой и лишь после этого погружают в йодную кислоту. Его радиоактивность лучше всего определять в 0,37о-ном растворе ДФО в ксилоле, содержащем 25% (объем/объем) тритона Х-114 [38]. При желании в него можно также добавить. ДФОБ до конечной концентрации 0,2 г/л. Приведенная методи ка обеспечивает получение эффективности счета, равной 47%,, для Ш и 93% для С. [c.211]

Во многих методиках вспомогательные ферменты просто добавляют к инкубационной среде. Можно также использовать индикаторный гель , содержащий вспомогательный фермент (или ферменты). Еще один способ применения вспомогательного фермента описал Харрисон [518]. Для обнаружения после электрофореза в полиакриламидном геле гексокиназы, глюкозо- фосфатизомеразы и фосфоглюкомутазы к гелеобразующему раствору перед полимеризацией акриламида добавляют глюкозо-б-фосфат— дегидрогеназу. В результате вспомогательный фермент оказывается равномерно распределенным в геле и иммобилизованным благодаря возникновению ковалентных связей с матриксом. При этом он сохраняет способность катализировать превращение глюкозо-6-фосфата, образующегося под действием указанных выше ферментов. Таким образом, при инкубации геля в среде, содержащей NADP, ФМС и соль тетразолия, в местах локализации разделенных ферментов появляется формазан. [c.286]

Для лоХализации амилазы был также использован метод включения субстрата в гель перед полимеризацией акриламида к нему добавляли растворимый крахмал [406, 1465]. После электрофореза гели инкубировали 5 мин при 37°С в 0,1 М ацетатном буфере (pH 6,0) и окрашивали 0,1%-ным раствором иода в иодистом калии, содержавшим 1 н. уксусную кислоту. В тех местах, где находилась такаамилаза, появлялись бесцветные полосы на фиолетовом фоне [1465]. [c.298]

Соответствующее количество смешанной с водой агарозы кипятят с обратным холодильником, интенсивно перемешивая, при 100 °С в течение 15 мин. Затем раствор охлаждают до 40 °С водой с температурой 30 °С (для предотвращения локального переохлаждения). Исходные растворы буфера, катализатора и акриламида смешивают в соответствующих пропорциях, смесь подогревают до 35°С и к ней добавляют расплавленную агарозу до конечной концентрации 0,5%. После добавления персульфата смесь быстро наливают в форму и охлаждают до 20 °С. Затем в соответствующее место вставляют охлажденную на льду гребенку для формирования лунок и раствор оставляют примерно на 1 ч для полимеризации. Перед нанесением образца рекомендуется провести предварительный электрофорез для удаления остатков персульфата. Пикок и Дингман [984] использовали раствор мономеров, содержавший акриламид и быс-акриламид в соотношении 19 1, а также ДМАПН в качестве катализатора (конечная концентрация 0,4%) и персульфат аммония (0,05%). Последний обеспечивал образование геля с нужными свойствами и медленную полимеризацию акриламида. [c.381]

Сам гелевый матрикс тоже не остался без изменения. Был предложен раствор геля HydroLink, имеющий целый ряд преимуществ перед стандартным полиакриламидным гелем, и мономеры которого к тому же менее токсичны по сравнению с акриламидом [Gelfi et al., 1990]. Этот гель характеризуется более высокой механической прочностью и химической стабильностью, позволяющей применять буферы с высоким pH. По существу, щелочные условия проведения секвенирующего гель-электрофореза, исключающие формирование у одноцепочечных фрагментов ДНК вторичной структуры без использования мочевины, позволили сократить время обращения с таким гелем перед этапом радиоавтографии за счет исключения необходимого ранее этапа ее удаления. Отсутствие мочевины в геле имеет также еще одно небольшое преимущество, заключающееся в более удобном нанесении препаратов ДНК в ячейки геля, чему обычно препятствует диффундирующая в буфер мочевина. Результатом применения такого геля стало большее количество (свыше 600) и более высокое качество читаемых полос ДНК с радиоавтографа геля. [c.173]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология