Электрофорез в полиакриламидном как система

Простой электрофорез можно также проводить в крахмальном геле. Крахмал по своим свойствам и поведению при геле-образовании отличается меньшим постоянством по сравнению с акриламидом. Однако до того, как полиакриламидные системы получили широкое распространение, крахмальный гель был очень популярен. Его и теперь охотно применяют для определения ферментативной активности после электрофореза пластину крахмального геля легко разрезать пополам по толщине одну половину окрасить на белки, а другую использовать для определения ферментативной активности (см. рнс. 9.6). Из-за того что крахмальные гели мутные, зоны окрашенных белков видны лишь на поверхности, поэтому для надежного детектирования количество разделяемых белков должно быть больше. [c.319]

Рис. 1.11. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в полулогарифмической системе координат).

Выбранные системы и состав гелей и буферных растворов для дискретного электрофореза в полиакриламидном геле в соответствии с молекулярной массой и зарядом образца [c.303]

Приготовление пробы. Обычно препаративный электрофорез в полиакриламидном геле не используют в качестве одного из начальных этапов в очистке белков и нуклеиновых кислот. Для предварительного грубого фракционирования компонентов омесей применяют методы хроматографии, высаливания или осаждения. Чтобы провести электрофоретическое разделение, пробу необходимо сконцентрировать до 5 мл для однородной системы и до 10—20 мл для неоднородной. От избытка солей можно избавиться при помощи диализа или гель-фильтрации. Концентрация солей в исследуемом растворе должна быть такой же, как в буфере концентрирующего геля. Если же этот гель не попользуется, то пробу диализуют против буфера разделяющего геля, разведенного в 5 раз. Медленное вхождение пробы в гель во время электрофореза свидетельствует о слишком высокой концентрации солей. Любой осадок, присутствующий в пробе, следует удалять центрифугированием или фильтрованием через миллипоровый фильтр, так как он может закупорить разделяющий гель. [c.117]

Белки, меченные флуоресцентными маркерами, изучают обычно методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН, так как в этой системе подвижности меченых и немеченых белков практически одинаковы. [c.184]

На том же принципе основана методика окрашивания полипептидов кишечной стенки после их разделения путем электрофореза в полиакриламидном геле с применением кислой буферной системы [10], После нанесения пробы электрофорез проводили в течение 25 мин, затем в катодный сосуд добавляли [c.187]

Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН можно проводить как в однородных, так и неоднородных буферных системах [325, 756, 1171, 1379], в которых концентрирование белков происходит в результате изотахофореза [732, 922]. [c.225]

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот применяют также неоднородные буферные системы [387, 1087]. При электрофорезе в комбинированном полиакриламидно-агарозном геле применяли трис-боратный буфер [983]. Электрофоретические свойства нуклеиновых кислот, а значит, и их разрешение при электрофорезе в какой-то степени зависят от используемой буферной системы [778, 1004, 1070]. По нашему мнению, в каждом конкретном случае наиболее подходящий буфер [c.372]

Использование метода электрофореза в полиакриламидном геле для анализа и разделения сложных смесей белков и нуклеиновых кислот значительно расширило наши знания о многих клеточных и вирусных системах. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет ряд преимуществ перед другими аналитическими методами он отличается простотой в исполнении, хорошей воспроизводимостью результатов и не требует сложного оборудования. В комбинации с двумерным разделением и изоэлектрофокусированием он может быть использован не только для аналитических, но и для препаративных целей. [c.118]

Рис. 9.1. Система диск-электрофореза в геле. Каждый белковый компонент отделяется в виде диска в трубке с полиакриламидным гелем.

Полное аналитическое разрешение всех рибосомных белков достигается с помощью двумерного гель-электрофореза в денатурирующих условиях. Удобная система разделения была предложена Э. Кальт-шмидтом и Г. Виттманном они использовали 8%-ный полиакриламидный гель при pH 8,6 для электрофореза в первом направлении и 18%-ный гель при pH 4,6 во втором направлении. В этих условиях разделялись все белки 30S субчастицы и все белки 50S субчастицы Е. oli. Пример такого разделения белков обеих рибосомных частиц в слегка модифицированной системе дан на рис. 53 и 54. Первое направление электрофореза в рыхлом геле при нейтральном или слегка щелочном pH обеспечивает движение кислых и нейтральных белков влево, к аноду, в то время как основные белки мигрируют вправо, к катоду, разделяясь в основном по заряду. Второе направление электрофореза в плотно сшитом геле при кислом pH обеспечивает движение всех белков в одну сторону —к катоду (вниз), и в их разделение большой вклад вносит размер разделяемых компонентов (чем меньше, тем подвижнее). [c.91]

Длины фрагментов определяют с помощью высокоразрешаю щего электрофореза в тонком слое полиакриламидного геля. Электрофорез проводится при повышенной температуре в буферной системе, содержащей 7 М мочевину, что способствует разрушению вторичной структуры фрагментов детекция зон фрагментов на электрофореграмме зависит от способа мечения его конца (если это [c.16]

Противоточным распределением в системе н-амиловый спирт—изоамиловый спирт — цитратно-фосфатный буфер pH 5 установлено (Шенин и др., 1967, 1968), что нистатин состоит из двух компонентов нестабильного Ai (основной) и стабильного As. Стабильность образцов нистатина зависит от компонентного состава. Методом дискового электрофореза на полиакриламидном геле показано (Голубева и др., 1978), что нистатиновый комплекс представляет собой смесь четырех компонентов — Аь Аа, Аз и В. [c.16]

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот среднего размера обычно применяют агарозные гели. Агароза — это особо чистая фракция, получаемая из агара или непосредственно из агарообразующих морских водорослей. В 1,0% агарозном геле можно разделять молекулы ДНК размером от 600 до 20 ООО п. н. Для фракционирования более крупных молекул ДНК (миллионы пар оснований), денатурированной ДНК и РНК приходится использовать специальные системы электрофореза. Иногда для решения специальных задач для разделения ДНК применяют полиакриламидные гели. Так, в 20% полиакриламидном геле можно разделить фрагменты ДНК, состоящие всего из шести оснований и различающиеся лишь одним нуклеотидом. [c.54]

Этот первый рецептор нейромедиатора, выделенный из центральной нервной системы, имеет следующие биохимические характеристики он является гликапротеином, состоящим из нескольких полипептидных цепей (по данным электрофореза в ДСН- полиакриламидН Ом геле М 48 000, 59 000 и 92 000) центр связывания стрихнина, по-видимому, локализован на самой короткой полипептидной цепи, и функции других цепей в настоящее время неизвестны рецепторный белок содержит единственный тип независимых связывающих участков для стрихнина. [c.295]

Полиакриламидный гель наименее химически активен. Его> слабое сродство к красителям позволяет осуществлять быстрое обнаружение биополимеров, главным образом белков, нуклеиновых кислот и продуктов их деградации, с помощью окрашивания. Прозрачный полиакриламидный гель обладает хорошими механическими свойствами, допускающими изменение концентрации полиакриламида в самых широких пределах. Электроос-мотические эффекты в этом геле очень малы. Условия аналитических и препаративных разделений на полиакриламидном геле путем зонного электрофореза в гомогенных и дискретных системах буферных растворов [48, 77], а также изотахофореза и изо-электрического фракционирования хорошо изучены. [c.299]

Гель-электрофорез в дискретной системе буферов был впервые использован Пуликом [77], а теория метода (применительно к полиакриламидному гелю) была разработана Дэвисом [c.300]

Для разделения канамицинов были использованы методы бумажной хроматографии [39, 52—55], ТСХ [39, 54], электрофореза [56], ГЖХ [57] и ВЭЖХ [58]. Производные канамицина и его биосинтетические продукты были разделены с помощью бумажной хроматографии [59, 60] и ТСХ [60—63]. Для разделения компонентов неомицина и его N-ацетилпроизводных были применены разнообразные системы бумажной хроматографии. [39, 60, 64—75]. Для этой же цели пригодны тонкослойные пластинки с силикагелем [75—79], углем [80], оксидом алюминия [81, 82], целлюлозой MN-300 [76, 83] и с кизельгуром [76]. Электрофоретическое разделение неомицинов осуществлено на ацетате целлюлозы [84, 85], на бумаге ватяан № 3 ММ [46] и в полиакриламидном геле [86]. Описан также газохроматографический анализ неомицинов [87, 88]. [c.147]

Электрофоретическое разделение исследуемых веществ можно также осуществлять на пластинах полиакриламидного геля размерами ЮОХЮО мм при толщине слоя геля от 1 до 3,5 мм. Пластины с углублениями для внесения образцов приготавливают на особых подставках. Для проведения электрофореза требуется специальное оборудование. Конструкция прибора позволяет устанавливать пластины в вертикальное положение при этом канавки для образцов должны быть расположены у верхнего края пластины и контактировать с верхним буфером, тогда как противоположный край пластины должен находиться в контакте с нижним буфером. Необходимо обеспечить циркуляцию охлаждающей жидкости по поверхности пластины с обеих ее сторон. Основное достоинство этой системы заключается в том, что она позволяет проводить одновременное разделение нескольких образцов в одинаковых условиях, благодаря чему их легко можно сравнивать между собой. Считается, что пластины легче анализировать с помощью денситометра, однако для этого необходимо иметь специальный прибор. Кроме того, пластинки можно без особого труда разрезать на полоски и проанализировать их на наличие различных компонентов путем окрашивания или определения радиоактивности. Полоски можно также высушивать и хранить. Однако для приготовления пластин требуется больше акриламида, особенно если анализируется немного образцов. Как и в случае электрофореза в трубках, для данного метода разработан целый ряд однородных и неоднородных ( прерывистых ) буферных систем. Здесь применяются те же способы приготовления гелей, методики разделения и анализа, что и при электрофорезе в трубках. [c.265]

Самый простой способ обеспечения стабильности электрофоретических зон заключается в том, что в среду для электрофореза вводят вещества, образующие капиллярную структуру. Ан-тиконвекционные свойства такой системы весьма высоки, если площадь поперечного сечения капилляров достаточно мала, так как в канале круглого сечения скорость потока снижается пропорционально четвертой степени радиуса. В качестве поддерживающей среды чаще всего используются фильтровальная бумага, пленки из ацетата целлюлозы, колонки или блоки целлюлозного порошка, гранулированный крахмал или гранулы поливиниловых полимеров, а также агаровый, агарозный, крахмальный или полиакриламидный гели. Зональный электрофорез в поддерживающей среде имеет ряд важных преимуществ. При его проведении можно использовать какой-либо простой и сравнительно недорогой прибор и анализировать одновременно несколько различных препаратов. Процедуры визуализации зон и выделения фракций осуществляются довольно легко. Вещества, обладающие биологической активностью, можно выявить непосредственно на электрофореграммах. Метод легко приспособить как для крупномасштабного разделения веществ, так и для микроразделения. Удается достигнуть очень высокой разрешающей силы, особенно в среде, характеризующейся одновременно антикон векционными свойствами и эффектом молекулярного сита. [c.34]

Буфер, используемый при электрофорезе, должен иметь как можно более низкую ионную силу (0,005—0,02), что позволяет применять высокие градиенты напряжения вдоль геля при минимальном образовании тепла. Желательно, чтобы у элюирующего буфера иошая сила была выше, чем у буфера в геле, так как это помогает до некоторой степени уменьшить разведение выходящих из геля фракций. Буферные системы для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле подробно изучены рядом авторов [322, 648]. [c.114]

Для изотахофореза белков желательно испольэовать узкие трубки и проводить его в полиакриламидных гелях, не проявляющих по отношению к исследуемым веществам свойства молекулярного сита. Изотахофорез обладает почти таким же хорошим разрешением, как и диск-электрофорез или изоэлектрическое фокусирование. Изо-тахофореграммы белковых смесей очень похожи на картины изоэлектрофокусирования [1116], так как компоненты таких смесей в кислотной системе разделяются главным образом в результате различий в значениях их ИЭТ [501]. Преимущество же изо тахофореза заключается в том, что в отличие от изо- [c.175]

На практике чаще всего работают либо при постоянном напряжении, либо при ста-билизированном токе. В самом деле, если напряжение остается неиз меиным и сопротивление в кювете падает, то ток должен возрастать. Если же сохраняется на одном уровне ток, то уменьшение сопротивления неизбежно приведет к снижению напряжения. Аналогичные простые выводы на основе закона Ома можно легко сделать в каждом конкретном случае. Решение вопроса о том, удастся ли получить лучшие результаты при поддержании неизменным тока пли напряжения, зависит от выбранного метода электрофореза. Например, электрофорез на бумаге обычно проводят при постоянном напряжении, а диск-электрофорез в полиакриламидном геле —при постоянном токе. Очень простой руководящий принцип, хотя и не всегда верный, заключается в том, что в случае неоднородной буферной системы более высокого разрешения можно достигнуть при стабилизации тока. Вместо с тем если электрическое сопротивление в разделительной камере существенно возрастает во время опыта (как, скажем, при ИЭФ), то лучше прибегнуть к стабилизации напряжения. [c.179]

В данном методе используют эффект молекулярного сита, свойственный полиакриламидным гелям различной концентрации. Чтобы улучшить разрешение, рекомендуется на первом этапе проводить электрофорез в геле с низкой концентрацией полиакриламида, а на втором — электрофорез в градиенте концентрации полиакриламида. Такие системы были применены при разделении белков сыворотки крови [821, 1452]. Марголис и Кенрик 821] для электрофореза в первом направлении использовали 2,7%-ный гель, а Райт [1452]—4,75%-ный. Электрофорез во втором направлении проводили в градиенте концентрации 4—20%-ного 1[821] или 2—30%-ного [1452] полиакриламида. Применение в первом направлении 2,7%-ного полиакриламидного геля [821] улучшало разделение белков с большой молекулярной массой, тогда как при электрофорезе во втором направлении разделение было лучше при использовании более крутого градиента [1452]. Об эффективности указанных методов свидетельствует то, что при разделении с их помощью белков сыворотки человека на электрофореграмме было обнаружено более ста зон [1452]. [c.229]

Хорошим примером, показывающим, какое высокое разрешение может быть достигнуто при комбинации ИЭФ с электрофорезом в ДСН-полиакриламидном геле, служит разделение суммарной смеси белков Е. oli на 1100 фракций 1[935]. При изоэлектрофокусировании было получено 70 зон. Если же белки фракционировали только с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН, то на электрофорепрам>ме обнаруживали 100 зон. Таким образом, в результате комбинации этих методов в двухмерной системе можно было бы разделить около 7000 компонентов. Но эта величина превышает максимально возможное число белков Е. oli (4000), рассчитанное на основании средней мол. массы белков и числа кодонов в ДНК данного организма. [c.232]

Для окрашивания белков часто применяют кислотно-основный индикатор бромфеноловый синий. Так как в условиях электрофореза этот краситель непрочно связывается с белками, его часто используют в качестве окрашенного маркера при электрофорезе в полиакриламидном геле в щелочных системах. Кун-кель и Тнзелиус [728] применяли для окрашивания белков после электрофореза на бумаге водный раствор, содержавший 1% хлористой ртути, 0,05% бромфенолового синего и 2% уксусной кислоты. [c.271]

Амилазную активность после электрофореза в полиакриламидном геле иногда выявляют с помощью метода индикатор ного геля. Гели помещают на пластину крахмала, приготовлен ную из 4%-ного гидролизованного крахмала в буферном раС творе, состоящем из 0,02 М борной кислоты и 0,01 М NaOH [668]. Затем гели инкубируют при 37 °С 15—30 мин (если для разделения панкреатических ферментов используют катионную систему) или 0,5—5 мин (в случае анионной системы). После инкубации крахмальную пластинку фиксируют и обрабатывают йодной кислотой и реактивом Шиффа. [c.297]

При электрофорезе гистонов в полиакриламидном геле используют как однородные, так и неоднородные системы. Джонс [636] применял в качестве буферной системы 0,01 М уксусную кислоту, а Паниим и Чолкли [962, 963] предложили следующую систему 15,1% Т, 0,66% С, 2,5 М мочевина и 0,9 М уксусная кислота. Длина геля составляла 25 см. Гели перед нанесением [c.306]

Стегинк и др. [1231] разработали еще одну электрофоретическую методику для разделения цепей глобина. Эти авторы модифицировали предложенный ранее [963] метод электрофореза в полиакриламидном геле в системе мочевина — уксусная кислота. [c.327]

Пастевка и др. [974] определяли подвижность компонентов трех основных типов гаптоглобина с помощью дпск-электрофо-реза в полиакриламидном геле, используя в качестве стандарта трансферрин С. Эти авторы пытались идентифицировать фенотип Нр в анализируемых сыворотках по характеру расположения белковых зон на электрофореграмме после их окрашивания амидовым черным. Феррис и др, [378] анализировали комплексы гаптоглобин — гемоглобин методом вертикального электрофореза в пластине 7%-ного полиакриламидного геля с буферной системой трис-борат-ЭДТА (pH 8,3—8,4). Шеридан и др. [1178] для разделения комплексов гемоглобин — гаптоглобин применяли электрофорез в непрерывном вогнутом градиенте концентрации геля. Такая методика лучше, чем другие, обеспечивает разделение полимерных форм, особенно в зоне высокополимерных комплексов. [c.342]

Энгл ер и др. [341] подвергали сыворотки электрофорезу в полиакриламидном геле в системе Орнштейна — Дэвиса [281, 942]. Затем столбики геля помещали на 18 ч в свежеприготовленный 12,5 мкМ раствор гемоглобина лошади. Избыток гемоглобина удаляли промыванием в солевом растворе, а комплексы гантоглобин-гемоглобин окрашивали раствором бензидин-НгОг. [c.343]

Наиболее часто для определения фенотипа трансферрина используют электрофорез в крахмальном геле. Разделение проводят в боратном буфере Смитиса [1199] или в неоднородной трис-цитратной системе Паулика [1028]. Для установления фенотипа трансферринов животных применяют и другие буферные системы, в частности систему Аштона и Брейдена [65]. Спунер и Бакстер [1221] использовали буфер трис-какодиловая кислота (pH 7,45). Кроме того, с этой целью проводят электрофорез в полиакриламидном геле в трис-глициновом буфере при pH 8,8 [960] или при pH 9,3 [1275]. Наличие в сыворотке человека того или иного вариантного трансферрина обнаруживают также с помощью электрофореза в агаровом геле [630], а для подтверждения полученных результатов осуществляют во втором направлении иммуноэлектрофорез [424]. Однако в этом случае картина оказывается менее четкой, чем при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле. В последнее время стали применять другой подход вначале сыворотку подвергают изоэлектрофокусированию в геле из специальной марки агарозы (лишенной электроэндосмоса), а затем проводят электрофорез в геле, содержащем антитела [492, 631]. [c.346]

Двухмерная система электрофореза была применена также для разделения транспортных РНК [1232]. Первый этап осуществляли в 15%-ном полиакриламидном геле, содержавшем МЕ5-буфер (pH 5,8) и мочевину. В этой системе транспортные РНК, выделенные из клеток Е. соН, разделялись на 15 зон. Разделение во втором натграв-лении проводили в 16%-ном полиакриламидном геле, содержавшем трис, борную кислоту и ЭДТА [984]. Результаты двухмерного электрофореза такого типа приведены на рис. 122. Следует отметить, что после электрофореза при pH 5,8 транспортные РНК можно пометить прямо в геле радиоактив ными аминокислотами, что помогает идентифицировать разделенные зоны. [c.380]

Для электрофоретического разделения гликозаминогликанов разработано несколько систем, в которых в качестве поддерживающей среды используются фильтровальная бумага, ацетат целлюлозы, агарозный или полиакриламидный гель. В 1953 г. Риниц [1090] описал электрофоретическое разделение гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфатов на фильтровальной бумаге в натрий-фосфатном буфере (pH 6,7). Харуки и Кирк [521] отделили хондроитинсульфат В от хондроинтинсульфа-тов А и с путем электрофореза на бумаге в растворах сульфата или ацетата цинка. В настоящее время наилучщее разделение гликозаминогликанов дает электрофорез на полосках ацетата целлюлозы в следующих системах растворителей [c.395]

Наконец, был изучен белковый состав частиц. Эти опыты вначале велись работавшим в нашей лаборатории научным сотрудником из Венгрии Я. Молнером. В первых экспериментах была использована система электрофореза в полиакриламидном геле в ацетатном буфере pH 4,5, содержащем мочевину. При этом происходило разделение [c.201]

Вестерн-блоттинг—это метод иммунологического выявления электрофоретически разделенных антигенов, связанных с твердой подложкой. В качестве подложки используют нитроцеллюлозный фильтр [8]. Разделение обычно проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Такая система позволяет разделить белки по их мол. массе, что повышает ценность метода, поскольку можно получить данные [c.357]

Если необходимо получить меченые вирусоспецифические РНК из зараженных клеток (а не из вирионов), заражение клеток и внесение метки осуществляют, как описано выше, и затем на нужном сроке инфекции из зараженных клеток выделяют РНК. Для разделения сегментов РНК вируса гриппа удобно использовать 6%-ный полиакриламидный гель с 6 М мочевиной, приготовленный на буфере ТВЕ [30]. В этой системе 3 больших сегмента генома (1—3) комигрируют (см. рис. 6.7). Для их разделения используют систему электрофореза в геле с низкой концентрацией акриламида, описанную Ленингом [31]. [c.195]

Трансляцию денатурированной днРНК в бесклеточной системе проводят точно так же, как и описанную выше трансляцию мРНК. Продукты трансляции индивидуальных фрагментов РНК с помощью электрофореза в полиакриламидном геле сравнивают с вирионными белками и белками из зараженных клеток, чтобы установить, какой белок кодируется каждым фрагментом вирусной РНК. [c.218]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология