Связывание белков с ДНК

Каким образом фермент узнает один сайт, а разрезает другой, достаточно удаленный Важно отметить, что белок никогда не отделяется от молекулы ДНК, с которой он первоначально связался. Если фермент инкубировать со смесью модифицированной и немодифицированной ДНК, он предпочтительно разрезает немодифицирован-ную ДНК. Следовательно, узнавая сайт связывания, белок не отделяется от неметилированной ДНК для того чтобы найти сайт разрезания. Существуют две альтернативные модели, объясняющие взаимосвязь между сайтами узнавания и разрезания в соответствии с одной из них движется фермент, согласно другой модели, перемещается ДНК. Предполагаемые схемы этих процессов представлены на рис. 34.4. Если движется фермент, то его перемещение вдоль ДНК будет продолжаться до тех пор, пока он не сделает выбор сайта разрезания. Если же движется ДНК, то фермент остается прикрепленным в сайте узнавания, а ДНК протаскивается через второй сайт связывания на ферменте, и это продолжается до тех пор, пока фермент не достигает области разрезания (пока не- [c.434]

В самом широком смысле фермент — это белок, обладающий каталитической активностью. Более точно его можно определить как полипептидную цепь или совокупность полипептидных цепей, обладающих в нативной форме каталитической активностью. Это сложный сополимер, состоящий из мономеров — аминокислот, находящихся в одинаковой конфигурации. Катализ происходит в специфической области фермента, которую называют каталитическим центром или каталитической щелью. Активный центр состоит из остатков аминокислот, которые участвуют в узнавании и связывании субстрата, а в каталитический центр входят только остатки аминокислот, прямо участвующих в процессе катализа. Согласно существующему представлению об активном центре, лишь некоторые группы в составе ферментов вызывают его высокую каталитическую активность, очень часто комплементарным [c.201]

Многие репликоны используют, по-видимому, совершенно иную стратегию регуляции собственного синтеза. Для инициации репликации этих репликонов необходим белок-инициатор (например, белок Е в случае плазмиды F). от белок специфически связывается с определенной последовательностью ДНК, многократно повторенной на данном репликоне. Связывание белка-инициатора с одной или несколькими такими последовательностями, находящимися в ориджине, необходимо для инициации. Одна из последовательностей находится в начале гена бел ка-инициатор а, так что связывание с ней белка подавляет его собственный синтез. Считается, что регуляция репликации осуществляется благодаря сложной конкуренции за белок-инициатор между участком ДНК, необходимым для собственной репрессии, участком (или участками), необходимым для инициации синтеза ДНК, и другими участками связывания. Хотя подобные репликоны пока еще недостаточно изучены и детальная картина регуляции репликации не ясна, очевидно, что наличие множественных мест связывания ключевого белка инициации репликации позволяет регуляторной системе очень чутко отзываться на изменение копийности репликона. Например, если плазмида содержит 10 повторенных мест связывания белка-инициатора, то появление за счет репликации од ой дополнительной копии плазмиды увеличит число участков связывания на 10. В определенном смысле многократно повторенные участки связывания белка-инициатора, суммарное количество которых пропорционально копийности репликона, аналогичны ранее рассмотренной ингибиторной РНК, концентрация которой также пропорциональна копийности. [c.67]

Если многоточечные контакты белков с обменником и удается разорвать при значительном увеличении концентрации соли, эта ситуация все равно оказывается неблагоприятной для хроматографического фракционирования. При повышении солевой концентрации среднее число связей, удерживающих белок на обменнике, постепенно уменьшается, но до тех пор, пока сохраняется (в среднем) хотя бы одна связь, белок остается неподвижным. Затем незначительного увеличения концентрации соли оказывается достаточно для того, чтобы белок снялся с обменника. При этом условия для нового связывания белка могут оказаться столь неблагоприятными, что он, вместо того чтобы, покинув исходную зону, сорбироваться ниже по длине колонки (как это должно быть в истинно хроматографическом процессе), будет двигаться вместе с элюентом и быстро покинет колонку. Процесс сорбции—десорбции окажется зависящим от малого изменения большой величины (концентрации соли), а это, как известно, очень невыгодно для любого регулируемого процесса. [c.261]

Связывание одного лиганда. При заданных значениях Ео и Ао в пробе одновременно присутствуют комплексы белка с лигандом с различной степенью насыщения (т. е. ЕА ЕАг, ЕАз и ЕА4), а также свободный белок в равновесной концентрации Е. Определение их концентрации и является целью дальнейшего анализа. [c.345]

Участки связывания характеризуются одинаковыми величинами микроскопической константы ассоциации комплекса белок — лиганд. Таким образом, для первой молекулы лиганда существует равная вероятность взаимодействия с любым из центров связывания (на рис. 45 макромолекула схематически изображена в виде квадрата с четырьмя [c.345]

Промотор — это участок ДНК, в котором происходит в самом начале присоединение РНК-полимеразы к ДНК значения констант связывания, характеризующих присоединение РНК-полимеразы к промоторам, очень велики. Сильное влияние на скорость ассоциации и инициации могут оказывать специальные регуляторные белки. Один из них — сАМР-рецепторный белок ( AP)—имеет важное значение для Ia -оперона. Он также связывается в промоторном участке (рис. 15-3). [c.202]

Для повышения эффективности связывания белок рекомендуется предвари-тельно обогатить меркаптогруппами с помощью иммунотиола. Ценная особенность этого метода состоит в том, что носитель можно регенерировать связанный белок легко отмывается раствором цистеина. [c.237]

При взаимодействии белка с адсорбентом редко возникает какое-то одно соединение, подобное тому, которое образуется при связывании фермента с его субстратом. На носителе имеется множество центров связывания различной конфигурации для белков, которые сами могут иметь олигомерную четвертичную спруктуру и потому способны связываться с носителем в нескольких местах на его поверхности. На рис, 4.1 представлено плоскостное изображение того, каким образом молекулы белка могут распределяться в адсорбенте с беспорядочным расположением центров связывания. Белок может взаимодействовать с двумя, тремя или большим числом центров, что приводит к полидисперсности сил взаимодействия. Знаки + на рисунке означают, что это анионообменник. Однако на диаграмме можно представить и многие другие типы адсорбентов. Поэтому [c.93]

В общем случае значение а — это характеристика сорбционной способности активного центра данного фермента. Если а <С 1 (как, например, в рассмотренном катализе (3-галактозидазой), то субстратная группа К, по-видимому, либо погружаетгя (переносится из воды) в органическую среду белка не полностью, либо связывание ее требует термодинамически невыгодных затрат на конформационное изменение структуры того или другого реагента. Гидрофобное ферментсубстрат-ное взаимодействие может быть термодинамически более выгодным, чем это предполагает простая экстракционная модель (где а= 1). В этом случае активный центр должен содержать локальный участок с относительно невыгодной поверхностной энергией пограничного слоя белок — растворитель например, с гидрофобными боковыми группами [c.44]

Путем химических исследований экстрактов сетчатки было показано, что зрительные пигменты представляют собой соединения, у которых хромофор каротиноидной природы прикреплен к белку. Типичный пигмент родопсин (зрительный пурпур) содержит 11-чис-ретиналь в качестве каротиноидного хромофора и белок опсин. Рис. 8.11 показывает родство между рети-налем, ретинолом (витамином А) и -каротином. Животные синтезируют ретинол из каротиноидов растительного происхождения, а ретиналь получается в сетчатке при ферментативном окислении ретинола, Опсин является окрашенным белком, найденным исключительно в палочках фотопсин обнаружен в колбочках при связывании с ретиналем образует иодопсин). Опси- [c.238]

Удаление РНК-затра-вок, застройка брешей Сшивание фрагментов Оказаки Связывание однонитевой ДНК Гистоноподобный белок [c.56]

ИЗ цепей ДНК дефектна (например, содержит тиминовый димер или АР-сайт), а комплементарная цепь не могла быть синтезирована из-за дефекта в матрице и поэтому напротив поврежденного участка остается незастроенная брешь (см. рис. 47). Единственный способ безошибочной репарации такого повреждения — это использовать в качестве эталона второй полученный при репликации дуплекс ДНК. т. е. использовать рекомбинацию для репарации повреждения. У Е.соН эту задачу способен выполнить Re A-белок вместе с ферментами репарации. Для НесА-белка одноцепочечный участок двуспиральной молекулы ДНК, содержащий повреждение, является излюбленным участком связывания. Связавшись с таким местом, Re A-6e-лок вовлекает его в рекомбинационное взаимодействие с гомологичным неповрежденным дуплексом, причем как разорванная, так и поврежденная цепи ДНК оказываются спаренными с неповрежденными комплементарными цепями, что позволяет их репарацию описанными в предыдущей главе репарационными системами (рис. 62). Таким путем осуществляется пострепликативная, или рекомбинационная, репарация. Аналогичным образом за счет рекомбинации происходит репарация двуцепочечных разрывов ДНК. [c.94]

Простейший механизм репрессии заключается в стерическом блокировании репрессором присоединения РНК-полимеразы к промотору. Такой механизм имеет место в тех промоторах, в которых участок связывания репрессора перекрывается с участком связывания РНК-полимеразы. Простейший механизм активации заключается в том, что белок-активатор присоединяется к про.мотору рядом с РНК-полнмеразой и за счет непосредственного контакта с ней облегчает образование открытого промоторного комплекса. Дискуссионными являются механизмы действия тех белков-регуляторов, которые присоединяются к ДНК на значительном расстоянии от РНК поли-меразы. Ниже рассмотрено несколько наиболее хорошо изученных примеров, иллюстрирующих различные принципы регуляции промоторов. [c.144]

Последствия связывания с батее сложные. Этот участок частично перекрывается с участком связывания РНК-патн.меразы с промотором PR, поэтому связывание репрессора с подавляет транскрипцию с Рн. Степень перекрывания Ов с участком связывания РНК-патимеразы с промотором Ркч очень мала в нем имеется только одна фосфатная группа ДНК, с которой контактируют и РНК-пати.мераза, и репрессор. Поэтому. южно думать, что связывание репрессора с Од, не мешает связыванию РНК-поли.меразы с Ркм. Более того, показано, что репрессор, связываясь с Од, , значительно стимулирует (до десяти раз) транскрипцию с Ррч. Предполагается. что активирующее действие репрессора обусловлено тем, что в районе общего фосфата. между РНК-патимеразой и репрессором возникает белок-белковый контакт, помогающий РНК-полимеразе начать транскрипцию с промотора Рдм (рис. 88). [c.146]

Стартовые точки транскрипции промоторов Рс и Рва о находятся на расстоянии 147 п. н. Репрессируя Рс, белок АгаС связывается оператором araOi, перекрывающимся с участком связывания РНК-полимеразы. Находясь в состоянии активатора, АгаС-белок связывается с участком ara , непосредственно примыкающим к участку связывания РНК-поли.меразы с промотором. Можно думать, что активация происходит за счет контакта с РНК-полимеразой. [c.152]

Особая а-субъединица участвует в транскрипции ряда генов, ответственных за метаболизм азота. К ним относятся ген, кодирующий глутаминсинтетазу, и гены, контролирующие фиксацию атмосферного азота. Про.моторы этих генов не содержат обычных для других промоторов последовательностей —10 и —35 . Вместо них имеются участки гомологии, центры которых расположены в поло- кениях —11 и —21 . Поэтому неудивительно, что эти промоторы ле используются РНК-полимеразой, содержащей главную сигма-субъединицу, а . Транскрипцию этих промоторов обеспечивает одна из минорных а субъединиц, о ", кодируемая геном rpoN. Однако для функционирования промотора гена глутаминсинтетазы белка а недостаточно. Необходим еще ДНК-связывающийся белок, называемый NRi. Перед промотором имеется пять участков его связывания наибольшее сродство NR, проявляет к двум отдаленным участка.м. Эти последовательности необходимы для активации промотора при низких концентрациях NRi и не обязательны при высоких. Если эти последовательности отодвинуть на тысячу пар нуклеотидов от промотора, они продолжают обеспечивать активность промотора. Предполагается, что белок NR взаимодействует с РНК-поли.меразой, расположенной на промоторе. Посадка NRi на ДНК облегчает это взаимодействие, сопровождаемое, по-видимому, образованием петли ДНК- [c.153]

Благодаря использованию большого набора мутаций по промоторам и генам активирующих белков дрожжей удалось выяснить некоторые особенности взаимодействия белков-активаторов с АП, а также характерные свойства этих белков. Белок GAL4 активирует гены, необходимые для катаболизма галактозы. GAL4 связывается с АП, представленной повторяющимися элементами по 17 п. н-Степень активирующего действия пропорциональна числу этих элементов в промоторе. Функция связывания ДНК и активации транскрипции принадлежит разным участкам белка GAL4, который содержит 881 аминокислоту. 73 остатка с N-конца молекулы белка достаточны для обеспечения специфического связывания с ДНК. Эгот участок связывает ионы цинка и содержит характерную структуру — цинковые пальцы , обнаруженные в целом ряде белков, активирующих транскрипцию (см. раздел 4 этой главы). Два других дискретных участка белка, включающих аминокислоты 149—196 и 768—881, достаточны для обеспечения активации транскрипции. Эти участки содержат кислые аминокислотные остатки. По-видимому, в разных активаторных белках эти районы обладают [c.196]

Молекулярные механизмы, с помощью которых описанные элементы промотора регулируют транскрипцию, еще не выяснены, но несомненно, что активность промоторных элементов обусловлена связыванием с определенными белковыми факторами, обеспечивающими точную и эффективную транскрипцию генов РНК-полимеразой П. Выделены разные белки, взаимодействующие с разными участками промотора, содержащими ТАТА, ССААТ или G -мотивг. По-видимому, существует несколько белков, способных связываться с мотивом ССААТ , среди них — гетеродимер, состоящий из разных субъединиц. Белок, узнающий G -мотив , связывается с участком ДНК, включающим 18—20 п. н., в центре которого находится G -элемент. Эффективность промотора, по крайней мере частично, определяется эффективностью отдельного элемента ( мотива ) в составе промотора, числом этих элементов и их взаимным расположением. Эти элементы, вероятно, функционируют в зависимости от ближайшего нуклеотидного окружения. Замены близлежащих нуклеотидов могут сильно сказываться на эффективности действия элемента. Так, например, замены выделенных жирным шрифтом нуклеотидов в окружении G -мотива (GGGG GGGG ) могут снижать активность промотора, тогда как замена первого G на Т вполне допустима. Если область промотора содержит как G , так и СААТ-элементы, то разные белковые факторы транскрипции, взаимодействующие с ними, могут согласованно активировать транскрипцию. [c.199]

Кроме гистонов в хроматине присутствует большое количество различных негистоновых белков, характер взаимодействия которых с нуклеосомной ДНК пока не ясен. Наиболее богато представлены негистоновые белки HMG 14 и 17, функция которых остается все еще не изученной. H.MG 14 и 17 —это близкие по структуре белки, несущие большое количество заряженных групп. Они состоят соответственно из 68 и 74 аминокислотных остатков. Две молекулы этих белков способны к кооперативному связыванию с нуклеосомой, причем каждый белок взаимодействует с концевым участком ДНК и вторым сегментом, расположенным на расстоянии примерно 20 п. о. от ее конца. Эти две области нуклеосомной ДНК в основном свободны от гистонов (см. рис. 125). HMG 14 и 17 связываются с обращенной внутрь нуклеосо.мы стороной двойной спирали ДНК и не меняют существенным образом общую форму нуклеосомы. Создается впечатление, что этн два белка занимают свободную внутреннюю область ДН К нуклеосомы. [c.242]

Еще одна регуляторная система, механизм которой проясняется,—это гены, стимулируемые стероидными гормонами. Белок-регулятор, связываясь с гормоном, приобретает способность садиться на регуляторные участки и активировать соответствующие гены. Описан также белок, который связывается с регуляторной областью геиов теплового шока дрозофилы и включает эти гены (см. с. 199). Тепловой шок вызывает переход этого белка из цитоплазмы в ядро и его связывание с последовательностью ДНК, обеспечивающей включение генов теплового шока. Предполагается, что, связываясь с ДНК вблизи промотора, он активирует РНК-полимеразу П. [c.250]

Регуляторные ДНК-связывающие белки прокариот вызывают заметные изменения конформации ДНК. При рентгеноструктурном исследовании комплекса регуляторного белка TFIHA со своим участком ДНК оказалось, что двойная спираль находится в А-форме. Другие изменения (изгибы и изломы двойной спирали) можно обнаружить с помощью электронной микроскопии, электрофореза ДНК-белковых комплексов, а также при действии нуклеаз. Связанный белок защищает от расщепления 15—30 п. о. в месте связывания и порождает два участка повышенной чувствительности к нуклеазам с обеих сторон от места связывания. Тонкий анализ мест гиперчувствительности в хроматине эукариот показал, что они имеют точно такую же структуру — две гипер-чувствительные точки, разделенные защищенны.м участком. [c.257]

При выработке иммунного ответа клеточные рецепторы реагируют на углеводные детерминанты макромолекулы антигена. Обратным примером может служить взаимодействие клеток с макромолекулами холерного токсина. Последний представляет собой белок, в состав которого входят две высокомолекулярные пептидные субъединицы. Одна из них ответственна за первичное взаимодействие с клетками организма-хозяина, а другая — за токсический эффект. Было установлено, что рецептором на поверхности клеток, осуществляющим узнавание молекулы токсина и связывание с ним, является гликолиПид — ган-глиозид Gmi, в молекуле которого к липидной части присоединен олигосахаридный фрагмент, содержащий остаток сиаловой кислоты. После присоединения токсина к ган-глиозиду от первого отщепляется токсическая субъединица, под дейстием чего происходит ряд изменений в активности ферментов клетки, в первую очередь активация адени-лат-циклазы, а это в конечном итоге приводит к крупным нарушениям клеточного метаболизма и гибели клетки. [c.158]

Использование белков-антигенов в качестве лигандов для очистки специфических антител на иммуносорбентах было описано в предыдущей книге этой серии [Остерман, 1983]. Там же была рассмотрена возможность связывания любых антител на матрице, несущей белок А из Staphylo o us aureus. Обе эти системы с полным правол можно включить в перечень аффинных хроматографических систем. Естественно, что иммуносорбенты используются и в обратном варианте, когда с помощью лигандов-антител производится очистка антигенов белковой природы пли гаптенов. [c.362]

Приемы, используемые в аффинной хроматографии, в основном те же, что и в других рассмотренных выше методах, поэтому достаточно будет остановиться лишь на некоторых отличительных особенностях. Уже упомина.лось, что в большинстве случаев решается задача аффинной очистки одного вещества, сила связывания которого на сорбенте намного превосходит силы неспецифической сорбции других компонентов исходной смеси. Это позволяет эффективно использовать аффинную хроматографию и на ранних стадиях очистки вещества. Нередко на этой стадии в препарате могут содержаться выпавшие в осадок белки или липопротеиды, способные забивать колонку. В таком случае следует элюцию вести в свободном объеме, промывая сорбент на фильтре (с периодическим перемешиванием). Заметим, что промывку сорбента в объеме выгоднее вести несколько раз небольшими пори иями элюента, чем сразу большим его объемом. Аффинная хроматография в свободном объеме удобнее, чем колоночная, и в том случае, когда нужный белок очень мало представлен в неочищенном экстракте, но хорошо связывается сорбентом. Хроматография в объеме позволяет использовать такую концентрацию суммарного белка в экстракте, с которой из-за вязкости было бы трудно работать на колонке. Аффинная сорбция в объеме широко ис1ю.1гьзуется в радио-иммунных методах исследования. [c.409]

Аденилатциклаза (КФ 4.6.1.1) эукариот является ферментом плазматических мембран. Она катализирует реакцию образования цАМФ из АТФ. Фермент состоит из трех компонентов рецептора к гормону, ГТФ-связывающего белка (Ы-белка) и каталитической су единицы. Гормональная активация аденилатциклазы осуществляется в результате следующих взаимодействий компонентов. Гормон, связываясь с рецептором, индуцирует образование тройного комплекса гормон — рецептор — Ы-белок. Связывание ГТФ с К-белком вызывает диссоциацию тройного комплекса с образованием активированного N-бeлкa. Активированный N-бeлoк, содержащий ГТФ, взаимодействует с каталитической субъединицей фермента, увеличивая ее активность. Гидролиз ГТФ до ГДФ и неорганического фосфата ГТФазой Ы-белка приводит к диссоциации комплекса Ы-белка с каталитической субъединицей и выключению фермента [c.368]

РИС. 15-13. Две проекции 708-рибосомы Е. oli. Цифрами обозначены места связывания специфических антител к определенным рибосомным бел-хам (нумерация такая же, как в табл. 15-5). Буквы S и L не указаны, так как из рисунка и так ясно, в какой из субъединиц находится белок. В тех случаях, когда для какого-то одного антитела обнаруживается более чем одно место связывания, эти места обозначены буквами А, В, С и D. В других проекциях можно было бы увидеть много других идентифицированных мест связывания [97]. [c.230]

Миллер, Лу и их сотрудники [145а, Ь] с успехом использовали супрессорные мутации и получили с их помощью около 300 мутантных типов Za -репрессорного белка Е. соИ. На первом этапе вводили атЬег-мутации приблизительно в 80 положений гена. Далее с целью клонирования мутантные гены переносили в эписомы (см. следующий раздел). Затем эти вирусоподобные эписомы использовали для заражения пяти штаммов бактерий, несущих супрессорные мутации, благодаря которым считывание кодона UAG (терминирующего) приводило к включению в белок различных аминокислот. Из этих инфицированных бактерий выделяли большие количества мутантных форм 1ас-репрессора. Оказалось, что многие мутации, локализованные вблизи от N-конца, влияют на связывание репрессора с ДНК, тогда как мутации, локализованные в центральной части, влияют на связывание с индуктором. [c.256]

Смотреть страницы где упоминается термин Связывание белков с ДНК: [c.552] [c.188] [c.143] [c.363] [c.651] [c.61] [c.80] [c.149] [c.152] [c.200] [c.250] [c.227] [c.415] [c.442] [c.447] [c.334] [c.367] [c.128] [c.203] [c.231] [c.234] [c.244] [c.307]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология