Моноклональные антитела гибридом

Создание мышей, которые синтезировали бы только человеческие антитела, - это примечательный пример трансгеноза с помощью YA . Как отмечалось в гл. 10, моноклональные антитела можно использовать для лечения некоторых заболеваний человека. Однако получить человеческие моноклональные антитела практически невозможно. К сожалению, и моноклональные антитела грызунов иммуногенны для человека. Чтобы очеловечить существующие моноклональные антитела грызунов, были разработаны сложные стратегии с использованием рекомбинантных ДНК. В результате этих трудоемких процедур удалось получить Fv- и Fab-фрагмен-ты, зачастую обладающие каким-то сродством к специфическому антигену. Возможно, технологического прорыва удастся достичь, если использовать для получения полноразмерных человеческих антител более доступный метод с использованием гибридом. [c.429]

Клонирование гибридом для получения моноклональных антител [c.371]

Современный уровень развития биотехнологии обусловлен общим прогрессом науки и техники, особенно — в течение последних 50 лет Достаточно отметить лишь такие события, как установление структуры и функций нуклеиновых кислот, обнаружение ферментов рестрикции ДНК и выявление их значения в жизни клеток с последующим использованием в генно-инженерных работах, создание гибридом и получение моноклональных антител, внедрение ЭВМ и компьютерной техники в биотехнологические процессы и т д [c.9]

Клеточные линии гибридом служат источником моноклональных антител [34] [c.226]

В клетке можно пометить любые молекулы для этого е них вводят один или несколько радиоактивных атомов. Нестабильные радиоактивные атомы распадаются, испуская излучение, что позволяет прослеживать судьбу исследуемых молекул. Применение радиоизотопов в клеточной биологии ограничено двумя видами экспериментов анализ метаболических путей по методу вытеснения метки и локализацией меченых молекул в клетке с помощью радиоавтографии. Антитела представляют собой очень удобный и чувствительный инструмент для локализации специфических биологических макромолекул В организме позвоночных животных продуцируются миллионы различных антител, в каждом из которых имеются участки связывания, опознающие специфические группы молекул. Метод гибридом позволяет получать моноклональные антитела с одинаковой специфичностью практически в неограниченных количествах. В принципе можно получать моноклональные антитела против любых макромолекул в клетке и затем использовать эти антитела для локализации или очистки определенных макромолекул, а в некоторых случаях и для анализа внутриклеточных свойств этих молекул. [c.228]

Рис. 43. Основные этапы получения гибридом, синтезирующих моноклональные антитела

Моноклональные антитела находят очень широкое применение, в том числе для диагностики и терапии различных заболеваний человека. Например, антитела против опухолевых антигенов, сшитые с токсинами (иммунотоксины), могут быть применены для селективного убивания опухолевых клеток в организме человека. Такие антитела несложно получить, используя для иммунизации мышей или крыс и последующее конструирование гибридом. Однако употребление этих антител очень ограничено, так как при их введении в организм человека (особенно повторном) возникают реакции на гетерологичный белок. Поэтому крайне желательно получать моноклональные антитела человека. [c.119]

Хотя сам процесс получения гибридом достаточно трудоемок и дорог, тем не менее, после того как гибридома получена, крупномасштабное производство моноклональных антител стоит довольно дешево и все затраты на получение гибридом себя оправдывают. В качестве недостатка моноклональных антител часто указывают на нестабильность гибридом и возможную потерю ими продукции. Однако большинство гибридом достаточно стабильно, если их ре-клонировать 1—2 раза в год. [c.169]

Отбор моноклональных антител по специфичности взаимодействия с антигеном. Для того чтобы оценить возможности моноклональных антител в иммуноанализе, необходимо в первую очередь выявить их способность перекрестно реагировать с другими соединениями. Поскольку процесс получения гибридом длителен и трудоемок, определение специфичности взаимодействия моноклональных антител с антигеном желательно проводить на как можно более ранних этапах после их получения. [c.172]

Наиболее простым способом оценки специфичности моноклональных антител в процессе клонирования гибридом является метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с применением Т8Р-планшетов. ТЗР-планшеты представляют собой полисти-рольные стерильные крышки к 96-луночным культуральным платам, имеющие выступы, опускающиеся в лунки. Поверхность выступов ТЗР-планшетов может быть покрыта в стерильных условиях антигеном. Планшетом накрывают плату, в которой выращивают гибридомы таким образом, чтобы покрытые антигеном выступы опустились в среду культивирования гибридом. Выдерживают 1 ч и заменяют на новый планшет, выступы которого покрыты перекрестно реагирующим антигеном. Дальнейшую обработку ТЗР-крышек проводят в соответствии со стандартной методикой для непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Используя этот метод, можно в течение одного дня провести оценку способности моноклональных антител взаимодействовать с перекрестно реагирующими антигенами. Это дает возможность уже через 12—15 дней отобрать и клонировать только те гибридомы, которые обладают нужной исследователю специфичностью. [c.172]

Полуколичественная оценка /50 на ранних стадиях культивирования гибридом может быть осуществлена методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. В лунки платы для миКро-титрования, покрытые антигеном, использованным для получения моноклональных антител, помещают по 25 мкл растворенного в фосфатно-солевом буфере с тритоном перекрестно реагирующего антитела, концентрацию которого варьируют от 1 10 до 1 10 М. Затем в каждую лунку добавляют 25 мкл среды культивирования гибридом, разведенной в 2 раза буфером, содержащей моноклональные антитела. Аналогичным образом параллельно титруют исходный антиген, к которому были получены моноклональные антитела. В качестве контроля титрование сходного и перекрестно реагирующего антигенов осуществляют в присутствии 25 мкл разведенной в 2 раза среды культивирования гибридом, не содержащей моноклональных антител. Контрольные и опытные образцы инкубируют 1 ч при 37°С, а затем обрабатывают планшеты по методике для проведения непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. [c.173]

Третий метод состоит в приготовлении моноклональных антител, меченных ферментом или радиоизотопом, и определении возможности меченых и немеченых моноклональных антител конкурировать за одни и те же центры связывания на антигене. Этот метод обладает высокой точностью, однако требует введения метки в каждый вид антител и оценки конкуренции для каждой пары. Этот метод не применяется, если необходимо проанализировать моноклональные антитела большого количества гибридом. Необходимо иметь в виду, что на ранних стадиях получения гибридом количество имеющихся в наличии моноклональных антител ограничено. Это делает невозможным их отбор рассматриваемым методом. [c.174]

Рис. 11.4. Схема получения моноклональных антител на основе гибридом (по

Одна из наиболее трудных проблем при цитометрии связана с неспецифическим окрашиванием. Клеточный сортер с чрезвычайно высокой чувствительностью детектирует флуоресцирующие молекулы — обычно с большей, чем глаз. Поэтому реагенты, используемые при работе с сортером, должны быть более высокой степени очистки, чем для других методов анализа. Как правило, гетерологичные сыворотки должны подвергаться очистке на аффинных сорбентах даже в тех случаях, когда они достаточно специфичны для непосредственного использования при флуоресцентной микроскопии. Моноклональные антитела не всегда требуют очистки. Мы с успехом использовали супернатанты многих продуцирующих моноклональные антитела гибридом, которые культивировали в средах с добавлением и без добавления сыворотки, а также асцитные жидкости (конечно, в соответствующем разведении). В случае непрямых методов флуоресцентного окрашивания влияние контаминирую-щих молекул в культуральных жидкостях сводится к минимуму. Если конъюгированные с флуорохромом антитела строго специфичны по отношению к иммуноглобулинам, то даже при связывании клетками молекул, не относящихся к иммуноглобулинам, эти молекулы не будут детектироваться (по флуоресценции). В случае применения асцитных жидкостей активность моноклональных антител обычно настолько высока, что эффекты контаминирующих иммуноглобулинов и других компонентов чаще всего не выявляются. Однако при прямом конъ-югировании препаратов антител с флуорохромом наличие в них белковых примесей неиммуноглобулиновой природы может стать причиной высокого уровня неспецифического окрашивания. Следовательно, любой конъюгат используемый при сортинге клеток, должен быть тщательно очищен. [c.332]

На иммунизацию организм отвечает синтезом очень неоднородной популяции антител, молекулы к-рых могут сильно отличаться друг от друга по сродству к антигену. Такая неоднородность объясняется участием в иммунном ответе очень большой популяции В-лимфоцитов, каждый из к-рых синтезирует лишь одну разновидность молекул антител. С помощью техники гибридом (гибридные клетки, получаемые слиянием злокачественных и нормальных анти-телобразующих клеток лимфоцитов) удается получить в больших кол-вах однородные моноклональные антитела, к-рые широко используют в качестве высокоспецифич. реагентов для обнаружения, локализации и выделения разл. в-в, а также для диагностики и лечения нек-рых заболеваний. Гомог. И. накапливаются в больших кол-вах в крови и моче больных при ряде злокачеств. поражений лимфоцитов (т. наз. миеломные И.). [c.217]

На регуляцию морфогенеза существенно влияет качество света. Показано (Л. Коппель, 1992), что морфогенный каллус образуется чаще на синем свету, чем на белом или красном. Изменения на уровне индивидуальных белков во время реализации морфогенетической программы в культуре тканей позволили говоррггь о существовании белков развития. Однако отсутствие специфических тестов на эти белки не позволяет их выяврггь. Вместе с тем при использовании гибридов, продуцирующих моноклональные антитела на мембранные белки соматических зародышей, удалось выявить полипептид с молекулярной массой 45 кДа, который встречается в ядре нескольких видов растений и возможно участвует в регуляции клеточного деления (Г. Смит и др., 1988). В настоящее время большое внимание уделяется генетическому аспекту морфогенеза, изучению соматического эмбриогенеза как генетически наследуемого признака. Роль основного двигателя процесса развития отводится дифференциальной активности генов. Предполагается, что гены, контролирующие соматический эмбриогенез, начинают экспрессироваться в критические периоды развития эмбриоидов (H.A.Моисеева, 1991). [c.176]

Моноклональные антитела (Mono lonal antibodies) Однотипные антитела, строго специфичные в отношении одного эпитопа (антигенной детерминанты). Синтезируются гибридомами - клеточными гибридами, полученными при слиянии нормальных антителообразующих клеток с миеломной опухолевой клеткой, способной к неограниченному росту. Некоторые мие- [c.553]

Одним из перспективных методов получения целевых продуктов из животных клеток является их гибридизация. Примером может служить образование гибридом путем слияния нормальных и трансформированных злокачественных клеток. Г. Мильстейн и соавторы разработали метод получения моноклональных антител (мкАТ) в результате слияния клеток селезенки и миеломы. Образовавшиеся гибридомы от селезенки унаследовали способность к синтезу и секреции антител, а от миеломы — неограниченный рост и деление. [c.494]

Весьма эффективным методом уточнения топографии мембранных белков, прежде всего точной локализации внемембранных участков, является использование моноклональных антител. Для получения гибридом использовались фрагменты бактериородопсина, полученные путем его расщепления протеолитическими ферментами. Наиболее ценными в этом случае оказались синтетические фрагменты коррелируя величину синтетического пептида и эффективность связывания соответствующего антитела, можно с высокой степенью достоверности зондировать выступающие из мембраны полипептидные петли. Ниже показана локализация различных антигенных детерминант молекулы бaктepиopoдoпtинa в пурпурной мембране (Г. Корана, И. Г. Абдулаев). [c.609]

К Келер и Ц Мильштейн в 1975 г смогли впервые получить соматические гибриды клеток млекопитающих — гибридо-м ы, продуцирующие так называемые моноклональные антитела В иммунном организме антитела образуются плазматическими клетками, возникающими в результате дифференциации В-лимфоцитов в ответ на антигенную стимуляцию В-лимфоциты — высоко специализированные клетки, их в организме порядка Ю клонов и каждый клон синтезирует антитела [c.182]

Потенциальная контаминация названных выше продуктов возможна из рааллчных источников от лиц, чьи клетки используются в биотехнологических процессах, от миеломных клеток, применяемых для получения гибридов, из питательных сред для культивирования клеток млекопитающих, из реагентов, используемых для очистки белковых продуктов, например, моноклональные антитела, наконец, несоблюдение требований GMP [c.256]

В противоположность суспензионным культурам клеток на микроносителях разработаны способы инкапсулирования их в полимерные сферы (полилизиновые, агарозные, из полимерных смол), когда клетки, по-существу, не испытывают того механического напряжения, которое они должны проявлять в свободном виде. Эти способы оказались выгодными для культивирования гибридом в целях получения моноклональных антител. Диаметр микрокапсул, размер пор в них и их толщина могут быть независимо проконтролированы в процессе изготовления и оптимизированы для конкретного типа гибридом. Например, согласно данным фирмы Damon Biote h (Германия) гибридомные клетки человека или животных вначале суспендируют в биосовместимом растворе [c.541]

Получение моноклональных антител (МкАТ). Вводимый или попадающий в организм антиген признается и перерабатывается макрофагами, затем антигенная информация представляется лимфоцитам, содержащим рецепторы. Так, в частности, стимулируется формирование клонов плазматических клеток, продуцирующих специфичные антитела. Качество и количество антител зависят от качества и дозы антигена, способа его введения в организм, от вида животного — реципиента. Однако при традиционной технологии удается получать преимущественно гетерогенные антитела. В то же время "жизнь диктовала" необходимость получения моноклональных антител — продуктов единого клона клеток. Важным шагом к этому было открытие Портера в 1972 г., связанное с установлением "антительной природы" парапротеинов в сыворотке крови людей и животных с опухолевым поражением лимфатической системы (миелома). Миеломные клетки представляют собой трансформантов плазматической клетки, продуцирующих моноклональные антитела. К сожалению, антиген при этом до сих пор остается неустановленным. Тем не менее, факт образования моноклональных антител миеломными клетками был решающим в создании гибридом, с помощью которых сделан огромный скачок в иммунобиотехнологии. Выдающийся вклад в это внесли Г. Келер и К. Милстейн (1975), разработавшие метод получения МкАТ желаемой специфичности и в большом количестве. [c.570]

Рис. 163. Схема получения моноклональных антител с помощью габридом-ной техники АС — агент слияния клеток, 1 —В-клетки из селезенки иммунной мыши, 2 — культура миеломных клеток мыши, 3 — гибридизация, 4 — гибридомы, 5 — селекция и клонирование гибридом, 6 — гибридомы, образующие моноклональные антитела, 7 —- введение гибридом, образующих моноклональные антитела, в организм сингенной мыши, 8 — клетки гибридомы, образующие моноклональные антитела, культивируемые в виде культуры ткани, 9 — выращивание гибридомных клеток, образующих моноклональные антитела, в ферментаторе, 1дкж — иммуноглобулины в культуральной жидкости, 1дас — иммуноглобулины в асцитической жидкости, 10 — высаливание 1д-ов аммония сульфатом, 11 — стандартизация 1д-ов, 12 — лиофили-зация 1д-ов.

Большинство антигенов вызывает в организме образование целого набора антител, но каждый отдельно взятый лимфоцит продуцирует лишь одно из них. Миеломы — это злокачественные новообразования иммунной системы они развиваются в результате неконтролируемой пролиферации одной линии лимфоцитов. При этом в больших количествах синтезируется один тип белков-антител. Иными словами, миеломы являются природными продуцентами моноклональных антител. По методу Миль-штейна проводят слияние нормальных (неопухолевых) лимфоцитов и клеток миеломы. Вначале полученные гибриды синтезируют смесь антител, включающую два типа антител родительских клеток, а также гибридные их формы, образующиеся путем ассоциации тяжелых и легких цепей антител двух родительских форм. Впоследств ии в результате элиминации хромосом образуются клетки, способные к синтезу антител лишь одного типа. Это могут быть либо антитела, закодированные в геноме лимфоцита, либо антитела, характерные для клеток миеломы. Скрининг и обнаружение клона, синтезирующего искомое антитело, ведут при помощи биохимических и иммунохими-ческих методов. Схема этого метода дана на рис. 7.5. [c.313]

Им удалось ковалентно пришить мышиное моноклональное антитело против лейкоцитарного интерферона человека к твердому носителю — сефарозе. С помощью полученного таким образом специфического иммуноадсорбента удалось за один цикл очистить в 5000 раз лимфобластоидный интерферон. Важное преимущество этого способа заключается в том, что для. производства антител требуется очень немного частично очищенного антигена, поскольку разработаны методы отбора ш г о жрования искомого гибрида. [c.334]

Принципиально новый шаг в решении этой проблемы был сделан после того, как был предложен способ получения моноклональных антител (Г. Кёлер, К. Мильштейн, 1975) (рис. 17). В ответ на введение антигена в организме мыши активируются продуцирующие антитела В-клетки. Эти клетки могут жить только в организме хозяина и при их переводе в искусственную культуральную среду быстро гибнут. Однако если слить иммунную клетку с опухолевой (миеломные лимфоциты, которые способны неограниченно долго жить в искусственной среде), то в результате образуются гибридные клетки, унаследовавшие свойства своих предшественников, так как они способны долго жить в искусственных условиях и одновременно синтезировать антитела. Такие клетки получили название гибридом . С помощью специальных методов на особых ростовых средах можно отобрать отдельные клетки, синтезирующие только один тип антител. Такие клетки помещают в культуральную жидкость, в которой они размножаются и образуют много родственных ( клон ), синтезирующих большое количество антител, получивших название моноклональных. Моноклональные антитела — это антитела, однородные по своей структуре и специфичности, которые можно производить в неограниченных количествах. [c.105]

Предпосылками для возникновения метода получения гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, были разработки двух методических подходов 1) получение миелом, адаптация их к условиям культивирования вне организма и 2) метод соматической гибридизации клеток. [c.91]

В нормальных условиях слипание и слияние клеток происходит сравнительно редко (в зависимости от функционального состояния клеток). В связи с практическими проблемами соматической гибридизации клеток, реконструкции клеток (слияние кариопласта с цитопластом), получения гибридом из лимфоцитов и клеток миеломы для выработки моноклональных антител необходимо создание универсальных методов слияния клеток и органелл in vitro. Используемые индукторы слияния на фоне Са + (1—10 мМ) клеток животных — вирус Сендай (в оболочке которого присутствует нейраминидаза), клеток растительных протопластов — полиэтиленгликоль — приводят к низкому выходу гибридных клеток. В 1979 г. был разработан универсальный метод слияния любых клеток (в суспензии) —метод электрического пробоя. Этот метод основан на резко.м увеличении проводимости и проницаемости мембран в сильном электрическом поле (40 мкс, 4—6 кВ/см). При этом среди способов приведения клеток в контакт перед электростимуляцией используют диэлектрофорез — перемещение клеток в неоднородном переменном электрическом поле в растворе диэлектрика в сторону увеличения напряженности (в этом случае формируется большое число контактирующих друг с другом параллельных цепочек клеток). Увеличение образования гибридных клеток (химер) или гигантских клеток описанным способом достигается ферментативной обработкой клеток до слипания и слияния, главным образом направленной на удаление гликокаликса. [c.90]

Первые опыты по переносу генетического материала осуществляли с помощью слияния целых клеток [1]. Такая техника нашла применение при изучении процессов дифференци-ровки и канцерогенеза, однако наиболее успешно ее использовали при картировании генов человека [2] и получении моноклональных антител [3]. Известно, что сформировавшийся при слиянии клеток грызуна и человека межвидовой гибрид спонтанно теряет человеческие хромосомы [4]. Как правило, утрата хромосом происходит случайным образом, и это позволяет конструировать гибридные линии клеток, в которых содержатся разные хромосомы человека. Корреляция между присутствием конкретной хромосомы человека и экспрессией генетического маркера является основой для отнесения соответствующего гена к определенной группе сцепления. Из 1300 генов человека, картированных на сегодняшний день, примерно треть локализована на конкретных хромосомах с помощью методов генетики соматических клеток [5]. Процесс утраты хромосом у внутривидовых гибридов происходит не так быстро, как у гибридов межвидовых [6]. При слиянии клеток мышиной мие-ломы с клетками селезенки формируются стабильные линии гибридных клеток. Их характеризует иммортальность (способность к неограниченному делению), унаследованная от миелом- [c.8]

Первой стадией при создании гибридных моноклональных антител является получение обычной гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела желаемой специфичности к одному из двух антигенов. Затем гибридому адаптируют к росту в присутствии 8-азогуанина и отбирают те клетки, которые способны размножаться на НАТ-среде. Эти первичные гибридомы, выступающие в роли миеломного партнера, подвергают слиянию с иммунными лимфоцитами мышей, иммунизированных вторым антигеном. В результате слияния и отбора получают дочерние (вторичные) гибридомы, способные синтезировать антитела двойной специфичности. Таким способом были получены гибридные моноклональные антитела, которые одновременно связывались с кислой фосфатазой простаты человека и поверхностным антигеном гепатита В. Гибридные антитела оказались стабильными в процессе хранения, не изменяли своей двойственной специфичности и обладали достаточно высокими константами связывания по отношению к обоим антигенам. Гибридные антитела, взаимодействующие с пероксидазой и соматотропи-ном, были успешно использованы для изучения локализации сома-тотропина в клетке. [c.166]

Высокая специфичность моноклональных антител позволяет создать иммуноферментные диагностику мы для определения антигенов, которые имеются в ограниченных количествах или же недоступны в очищенном состоянии. В таких случаях для иммунизации животных и получения гибридом может быть использован препарат, содержащий около 1 % антигена. Высокоочищенный антиген необходим на стадии тестирования гибридом однако при наличии высокочувствительного метода определения нужные количества антигена исчисляются несколькими микрограммами. После получения гибридомы антиген может быть выделен методом аффинной хроматографии на моноклональных антителах. Полученный в вы-сокоочищенном состоянии в значительных количествах антиген в дальнейшем может быть использован в составе иммуноферментных диагностикумов. [c.170]

Отбор моноклональных антител по константам связывания с антигеном. Для количественного определения антигенов, содержащихся в биологических жидкостях в низких концентрациях, необходимо иметь моноклональные антитела с высокими константами аффинности. При этом для отбора соответствующих гибридом на сравнительно ранних стадиях их получения важно, чтобы применяемые методы определения констант не зависели от больших количеств антител. Достаточно удобным для этих целей является ранее описанный выше метод Фрикста. [c.175]

В 1975 г. Колер и Милстейн опубликовали сообщение о разработке гибридомно14 технологии для получения моноклональных антител, способных распознавать специфические, специально выбранные антигены. В первоначальном варианте для получения гибридом осуществляли слияние клеток селезенки иммунизированных мышей с линие11 миеломных клеток того же вида, используя вирус Сендай [1]. Потом в качестве агента, обеспечивающего слияние клеток, стали применять полиэтиленгликоль (ПЭГ) [2 ]. Далее было показано, что клетки селезенки могут быть иммунизированы in vitro за несколько дней до слияния, что позволяет преодолеть ряд потенциальных проблем, связанных с иммунной толерантностью и биологическим разрушением иммуногена [3]. Технические аспекты наиболее часто используемых методик детально описаны в работах [4-7 ]. [c.37]

Последние достижения в этой области включают получение антиидиотипических антител [8 ] и моноклональных антител овцы [9 ] межвидовым слиянием клеток. Кроме того, получены моноклональные антитела человека как из гибридом, образованных с помощью внутри- или межвидового слияния клеток, так и из культуры В-лим цитов, трансформированных вирусом Эпштейна - Барра (ВЭБ) [10]. Другими большими достижениями, важными для практики, являются получение биспецифических антител (т.е. специфических к определяемому веществу и метке) из гибридных гибридом [11-13] и создание химерных антител (в целях преодоления сверхчувствительности к ксеногенному материалу) с по- [c.37]

Методы получения моноклональных антител in vitro. Методы выращивания гибридом in vitro (т.е. технология культивирования клеток) имеют ряд преимуществ по сравнению с методами получения антител in vivo [c.38]

Для дальнейшего совершенствования процесюв получения и очистки моноклональных антител необходимо провести исследования в нескольких направлениях. Используемые в настоящее время процессы ферментации очень эффективны. Однако более глубокое понимание физиологии гибридом и линий клеток человека должно позволить увеличить выход продукта. Например, очень перспективным представляется улучшение линий клеток путем повторного [c.49]

СЛИЯНИЯ гибридом с родительскими миеломами, имеющими особенно благоприятные характеристики. Кроме того, большое поле деятельности открывается в области инженерии моноклональных антител. Эта технология позволит создавать новые типы моноклональных антител с заранее заданными свойствами и получать их в больших количествах. Необходимо также развивать методы скрининга для поиска клонов, секретирующих антитела при культивировании на бессывороточных средах. [c.50]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология