Антитела введение метки

Наибольшее распространение получили методы введения ферментной метки, основанные на образовании ковалентной связи между молекулами антитела и фермента. Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов окислением углеводного компонента фермента перйодатом натрия. В случае использования щелочной фосфатазы в качестве фермента-маркера применяют глутаровый альдегид, взаимодействующий с е-аминогруп-пами белковых молекул. [c.317]

Наиболее простым и чувствительным способом выявления антител, способных одновременно связываться с антигеном, является тест на аддитивность связывания. Предварительная очистка и введение метки в моноклональные тела в этом случае не нужны. В основе метода лежит оцеНка числа антигенных центров, одновременно доступных для пары антител. Определение осуществляется методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Основным условием при этом является полное насыщение антигена обоими типами антител. Поэтому на первой стадии Эксперимента необходимо получить кривые насыщения антигена аСцитиой или культуральной жидкостью, содержащей анализируемые антитела, и затем определить максимальную оптическую плотность в иммуноферментном тесте, достигаемую при насыщении. [c.174]

Гель-электрофорез. Электрофорез на геле и крахмале применяют для аналитических целей. Наиболее важным применением гель-электрофореза является иммуноэлектрофорез. Для этого вида анализа используют макропористые гели, в частности гели агара и агарозы. Метод иммуноэлектрофореза основан на том, что после разделения электрофорезом происходит диффузия разделенных веществ — антигенов — в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. Навстречу этим соединениям диффундируют антитела. При соединении антигенов и антител образуются характерные дуги осаждения. Метод иммуноэлектрофореза очень чувствителен при обнаружении антигенов, специфических для данных антител. В настоящее время применяют метод введения радиоактивной метки в антигены, благодаря чему радиоиммуноэлектрофорез является одним из самых чувствительных методов анализа биополимеров. [c.364]

Так же как и в случае гетерогенных методов, разнообразие гомогенных вариантов анализа обусловлено возможностью введения метки как в молекулу антигена, так и в молекулу антитела. Кро- [c.114]

Введение метки в молекулу антигена является одним из наиболее распространенных подходов в гомогенных методах ИФА. Эти методы относятся к конкурентным и основаны на одновременном взаимодействии с антителами анализируемого и меченого антигенов. После образования в растворе соответствующего иммунохимического комплекса проводят измерение ферментативной активности, которая пропорциональна концентрации свободного или связанного меченого лиганда. [c.115]

Третий метод состоит в приготовлении моноклональных антител, меченных ферментом или радиоизотопом, и определении возможности меченых и немеченых моноклональных антител конкурировать за одни и те же центры связывания на антигене. Этот метод обладает высокой точностью, однако требует введения метки в каждый вид антител и оценки конкуренции для каждой пары. Этот метод не применяется, если необходимо проанализировать моноклональные антитела большого количества гибридом. Необходимо иметь в виду, что на ранних стадиях получения гибридом количество имеющихся в наличии моноклональных антител ограничено. Это делает невозможным их отбор рассматриваемым методом. [c.174]

Процессы введения метки в молекулы антител в химическом отношении ничем не отличаются от мечения любых других белков. Используемые методики оптимизируются эмпирически и, как правило, с трудом поддаются контролю и воспроизведению. Ввиду того что моноклональные антитела доступны практически в неограниченных количествах, введение метки можно проводить сразу с очень большой партией антител, что было бы невозможно при использовании поликлональных антител, доступных лишь в виде партий ограниченного размера. Еще одним преимуществом моноклональных антител, также связанным с их доступностью в неограниченном количестве, является возможность работать в условиях их максимально высокой концентрации в реакционной смеси. [c.386]

Введение радиоактивной метки в антитела. Готовят на Na-фос-фатном буфере 0,05 М следующие растворы хлорамин Т — 2 мг/мл, антитела — 1 мг/мл, тиосульфат Na — 2 мг/мл. [c.324]

Существуют три основных методических подхода для решения этой задачи. Первый способ — избирательное окрашивание нейронов, выделяющих определенный нейромедиатор, может осуществляться с помощью преобразования естественного медиатора в его флуоресцирующее производное. В этом случае флуоресценция определенных групп клеток поможет выявить специфические связи в структурах мозга. Второй экспериментальный подход связан с введением молекул медиатора, предварительно меченного радиоактивным изотопом. Нейронные окончания, содержащие исследуемый медиатор, способны избирательно захватывать метку. Затем их легко выявить методом авторадиографии. Третий способ обнаружения специфических связей в нервной системе состоит в использовании высоко специфичной способности узнавать либо антигенные детерминанты медиатора, либо определенные ферментные белки, участвующие в метаболизме нейромедиаторов, либо нейрорецептор-ные компоненты на мембране клетки. Последние считаются наиболее убедительным свидетельством в пользу существования конкретных нейрохимических взаимодействий межцу клетками и зонами мозга. Обычно для иммунохимической идентификации используют флуоресцентный краситель или изотоп, который маркирует антитела. В последние годы широко распространились методы, использующие антитела, меченные частицами тяжелых металлов, например коллоидного золота, железа и др. [c.224]

Особую значимость для широкого внедрения твердофазного ИФА в практику имела разработка в качестве носителей для сорбционной иммобилизации антител и антигенов специальных полисти-рольных плат, содержащих 96 лунок. Факт сорбции антител на поверхности полистирола был установлен в середине 60-х годов и использован первоначально в методах РИА. Введение в практику ИФА полистирольных плат позволило значительно увеличить число-проводимых анализов и упростить методическую процедуру его выполнения. Были сконструированы специальные приборы, позволяющие автоматизировать стадии добавления реагентов, промывки и осуществлять одновременную регистрацию каталитической активности фермента-метки в каждой из лунок платы. [c.7]

Метод является усложненным вариантом обычного двухцентрового или сэндвич -анализа, в котором образование комплекса детектируется не непосредственно введением в него меченного ферментом антитела, а с помощью содержащих ферментативную метку антивидовых антител. В качестве антивидовых (или вторичных) используют антитела, специфичные к глобулинам тех видов животных или птиц, которых иммунизировали антигеном для получения антисыворотки. Примером наиболее распространенных антивидовых конъюгатов являются меченные ферментом антитела кролика против иммуноглобулинов человека, меченые антитела козы (осла, барана и т. д.) против иммуноглобулинов кролика и т. д. [c.89]

Основной проблемой, стоящей особенно остро при введении ферментной метки в низкомолекулярные соединения, является доступность антигенных детерминант в образовавшемся конъюгате для взаимодействия с антителами. При использовании меченых гаптенов необходимо, чтобы связь маркера с ним осуществлялась через ту же функциональную группу, которая модифицировалась для синтеза конъюгата белок — гаптен для целей иммунизации и получения антител. Это накладывает дополнительные требования на выбор фермента-маркера. Кроме того, разделение конъюгата гаптен — фермент от несвязавшегося фермента, примесь которого может оказывать негативное влияние на результаты анализа, крайне затруднительно. Другим существенным условием получения меченых гаптенов является доступность очищенного антигена в значи-гельном количестве, что осуществимо далеко не всегда. [c.100]

Еще один метод нековалентного введения ферментной метки основан на применении конъюгатов антител с лектинами — растительными белками, способными специфически связываться с углеводными остатками, входящими в состав биомолекул. В связи с этим лектины применяются для очистки и выделения гликопротеидов. [c.107]

В зависимости от структуры и молекулярной массы антигена при введении ферментной метки его константа связывания с антителами может увеличиваться, уменьшаться или оставаться неизменной. Увеличение эффективного значения константы связывания может быть обусловлено образованием в результате химической модификации олигомеров меченого антигена, формирующих при взаимодействии с антителами сложные по составу комплексы. Уменьшение сродства молсет наблюдаться при экранировании ферментом части антигенных детерминант либо в результате кон-формационных изменений, возникающих из-за образования ковалентных связей. [c.230]

Для определения концентрации веществ в большинстве иммунохимических методов к анализируемому раствору, содержащему определяемое соединение и его меченый аналог, добавляют реагент в количестве, намного меньшем необходимого по уравнению (7.12). Как немеченые, так и меченые соединения взаимодействуют с реагентом практически одана-ково, поэтому отношение их концентраций будет одним и тем же в растворе и в связанном состоянии. При этом возможность применения метода во многом определяется доступностью меченого антигена и соответствующих антител. Для введения метки используют различные реагенты радионуклиды, ферменты, красящие вещества, флуоресцентные и хеми-люминесцентные зонды, ионы металлов. До последнего времени в качестве маркеров антител применяли радиоактивные изотопы этот метод назьшается радиоиммунохимическим анализом (РИА). При этом степень [c.298]

Как следует из названия, в иммунохемилюминометрическом анализе сочетаются использование меченых антител и система об-на жения, основанная на подсчете числа фотонов. Значимость лк й системы иммуноанализа висит от того, насколько близко к оптимуму функционирует каждый компонент системы. Представляющиеся сейчас очевидными преимущества неизотопных меток были реализованы на практике только недавно. Их применение одерживали необходимость совершенствования иммунохимических редкций, а также разработки новых методик введения метки и новых приборов. [c.178]

Меченые антитела с высокой специфической активностью удобно и просто получать с помощью активированного N-гидpo-, ксисукцинимидного эфира акридиния [6]. Это производное быстро реагирует с первичными и вторичными алифатическими аминами в водных средах при pH 8,0, давая устойчивые конъюгаты, которые легко очистить гель-фильтрацией. Полученные таким способом меченые антитела использовались более двух лет без какой-либо заметной потери их свойств. Простота введения метки, а также доступность реагентов (очищенных моноклональных антител) и стабильность конъюгатов помогают успешно преодолеть один из основных недостатков всех методов иммуноанализа - отсутствие надежного метода получения устойчивых меченых реагентов. [c.180]

Если гибридомная линия, синтезирующая необходимые моноклональные антитела, отсутствует, то приходится использовать один из перечисленных выше методов мечения антител. Однако и в этом случае можно в дальнейшем предусмотреть биосинтетическое введение метки в антииммуноглобулиновые моноклональные антитела, поскольку их можно использовать вместо иодированных реагентов. [c.218]

Хорошей меткой могут служить ионы уранила, обеспечивающие контрастирование антител на месте их истинной локализации. Успмшюе введение метки, осуществляемое в три этапа, зависит от присутствия соответствующего антигена, предотвращающего нежелат ное воздействие на места связывания антител. [c.302]

Для получения линейных калибровочных кривых система иммунодиагностирования должна удовлетворять трем критериям. Первый из них, как было отмечено выше, связан с необходимостью использования реагентов в значительном избытке. Второй критерий, также рассмотренный выше, заключается в химической одцородности реагентов. И третий сводится к условию линейного перевода параметра, характеризующего глубину протекания химической реакции, в интенсивность собственно измеряемого сигнала. Для этого обычно используют введение в состав антител ферментной метки, поскольку при работе с необходимыми избыточными количествами антител, использование радиоизотопов часто не позволяет достичь включения, соответствующего достаточно высокой удельной активности в препарате. [c.390]

Отсюда, при фиксированной концентрации антитела, равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена количественно связано с общей концентрацией лиганда. Это соотношение лежит в основе любого иммуноанализа. Таким образом, если ввести в анализируемую систему фиксированное количество меченого антигена, то можно определить и неизвестную концентрацию антигена. Неизвестную концентрацию антитела определяют при помощи меченых антител. Для введения метки в антитело или антиген можно использовать различные метящие агенты, такие, как радионуклиды, ферменты, красные кровяные клетки, флуоресцентные и хемилюминесцентные зонды или металлы. В радиоиммуноанализе (РИА) и иммуно-ферментном анализе (ИФА) метят антиген, а в иммунорадиометрическом (ИРМА) и иммуноферментометрическом (ИФМА) анализе - антитело. В большинстве методик иммунного анализа требуется порознь определять связанный и свободный меченый антиген или антитело. Поэтому эти методики довольно громоздки и длительны. [c.57]

Другой метод, не связанный с присутствием в белке остатков триптофана, тирозина и фенилаланина, состоит во введении в белок флуоресцирующей метки, например, с помощью флуо-ресцеинизотиоцианата или 5-диметиламинонафталинсульфохло-рида (ДНС-хлорида). Метод применялся для введения флуоресцентной метки в антитела [81, 82], которые затем использовали для обнаружения антигенов. [c.459]

Вторичная реакция организма на введение антигена есть более сильное и интенсивное развитие процессов, происходивших при первичной реакции. Тут растормаживапие специфических клеток оказывается столь сильным, что рост соответствующих клеточных колоний в пределах лимфатического узла удается видеть в микроскоп (с помощью техники флуоресцентной метки). Организм реализует все свои потенции в синтезе данного вида у-глобулина, и в крови поддерживается высокая концентрация антител. [c.508]

В иммуноферментном анализе введение ферментной метки осуществляют путем ковалентного связывания молекулы фермента с молекулой антигена или антитела, При этом оно должно проводиться таким образом, чтобы модификация фермента не вызывала его инактивации. В водном растворе молекулы белков обладают структурой, при которой в поверхностном слое располагаются преимущественно гидрофильные боковые цепи отдельных аминокислотных остатков, часть из которых находится в ионизированном состоянии. Среди этих функциональных групп наиболее удобными для связывания являются е-аминогруппы лизина, карбоксильные группы аспарагинового или глутаминового остатков, 8Н-группа цистеинового остатка. Очевидно, что такая модифика ция ие должна затрагивать функдиональных групп активного [c.57]

Возможность применения ферментов в качестве метки в иммуно анализе обусловлена, прежде всего, их высокой каталитическо активностью, позволяющей с применением соответствующих суб стратных систем регистрировать ферменты в растворе на уррвн( 10-15 д ниже. Благодаря широкому развитию методов энзимоло ГИИ принципиально решена проблема введения ферментной метки I молекулы антигенов и антител, что позволяет в настоящий момент легко осуществить связывание молекул ферментов с другими соеди нениями с целью получения соответствующих конъюгатов. [c.78]

Многообразие методов гетерогенного анализа, относящихся к типам I и II, обусловлено возможностью введения ферментной метки как в молекулу антигена, так и в молекулу антитела. Кроме того, для конкретной схемы анализа определяющим является, какой из реагентов—антитело или антиген, использован в иммобилизованном виде для разделения иммунохимических комплексов от несвязавщихся компонентов. Поэтому принцип разделения гетерогенных методов может быть представлен схемой 4.3. [c.83]

Введение ферментной метки через комплекс со специфическими антителами против фермента наиболее часто применяется при использовании в качестве метки пероксидазы хрена. Этот анализ встречается в литературе под названием ПАП-метода (ПАП—пероксидаза—антипероксидаза). [c.103]

Следующий метод нековалентного введения ферментной метки в гетерогенном ИФА антигенов и антигел основан на использовании авидина (основной гликопротеид, Л4г = 66000, компонент яичного белка) и биотина (витамин, Мг=22Ъ), образующих между собой комплекс, характеризующийся константой связывания 1015 цто в десятки тысяч раз превышает характеристики связи антиген — антитело. Один из вариантов ИФА антител с использованием этой техники может быть проведен по схеме (см. с. 106). [c.105]

В реальных системах, в которых имеются центры специфического и неспедифического связывания, снижение константы связывания меченого антигена может приводить к возрастанию вклада неспецифических вазимодействий, проявляющегося в изменении положения калибровочного графика (рис. 32). Поэтому уменьшение способности антигена к связыванию с антителами вследствие введения ферментной метки крайне нежелательно. [c.231]

Если весь процесс иммуноферментного анализа условно разделить на три основные стадии - формирование специфического комплекса антиген — антитело (иммунохимический процесс), введение в него метки и ее визуализация тем или иным физическим способом, то можно заметить, что основное внимание в данной книге фокусируется на второй и третьей стадиях, представляющих преимущественно энзимологический аспект проблемы. В книге рассмотрены практически все известные способы регуляции активности ферментов, как химические (с помощью активаторов, ингибиторов, субстратов, простетических групп), так и физические (путем изменения активности ферментов при образовании комплекса антиген — антитело, с помощью ультразвука, конформационных и диффузионных ограничений). Главное достоинство монографии состоит в том, что в ней, по-видимому, впервые комплексно рассмотрены возможности регуляции активности ферментов, которые могут быть использованы для создания методов иммуноферментного анализа. В этом смысле оправдано английское название книги Enzyme-mediated immunoassay , которое буквально переводится, как Иммунный анализ, опосредованный через ферменты . [c.5]

Смотреть страницы где упоминается термин Антитела введение метки: [c.567] [c.258] [c.68] [c.68] [c.183] [c.194] [c.202] [c.207] [c.75] [c.392] [c.109] [c.503] [c.257] [c.260] [c.57] [c.275] [c.299] [c.178] [c.196] [c.214] [c.269]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология