Рибонуклеиновые кислоты, разделение

Белки рибосом характеризуются относительно низким молекулярным весом и обладают щелочными свойствами. При изучении нуклеиновых кислот было установлено, что в каждой рибосоме содержатся только две молекулы рибонуклеиновой кислоты с молекулярным весом 500 000—1000 000. При разделении рибосомы на две субъединицы каждая содержит только одну молекулу рибонуклеиновой кислоты, связанную с несколькими белковыми молекулами. [c.36]

Нуклеозиды могут быть получены как ферментативным, так и химическим путем из любого встречающегося в природе нуклеотидного материала. Однако главным источником получения этих гли-козидов служат нуклеиновые кислоты, выделяемые из различных тканей и организмов. Расщепление рибонуклеиновой кислоты до смеси входящих в ее состав нуклеозидов может быть достигнуто различными способами, среди которых следует упомянуть гидролиз разбавленным раствором аммиака при повышенной температуре [2], кипячение в течение нескольких дней с водным пиридином [31 и гидролиз, катализируемый ионами различных металлов [4]. Предложенный недавно метод [51 основан на кипячении рибонуклеиновой кислоты (или мононуклеотида) с водным раствором форм-амида в течение нескольких часов при pH 4. Разделение и выделение нуклеозидов было в значительной степени улучшено благодаря использованию ионообменных методов [6]. [c.12]

С признанием по крайней мере некоторых биологических функций рибонуклеиновых кислот возникло представление о том, что порядок расположения различных нуклеотидных звеньев имеет особое значение, как и в случае белков и полипептидов. Экспериментальное определение этой последовательности представляет собой главную проблему сегодняшнего дня пока же наибольший фрагмент из природной рибонуклеиновой кислоты, структура которого установлена с определенностью, имеет длину меньше десяти нуклеотидов . Вследствие относительно небольшого числа разновидностей мономеров, участвующих в образовании молекулы нуклеиновой кислоты, методы, включающие частичную деградацию рибонуклеиновых кислот до малых полинуклеотидов с последующим разделением, анализом последовательности и реконструкцией исходной цепи посредством специфического наложения, подвержены довольно строгим ограничениям. Присутствие в нуклеиновой кислоте небольших количеств минорных нуклеотидов и щелочеустойчивых межнуклеотидных связей должно до некоторой степени содействовать этому при таком подходе. Ступенчатая деградация самой рибонуклеиновой кислоты, может быть, и осуществима, если говорить о нуклеиновой кислоте, содержащей 50—100 нуклеотидов но анализ последовательности немногих известных гомогенных препаратов [c.386]

В течение многих лет результаты трудоемких и весьма грубых анализов нуклеиновой кислоты, проведенных первыми исследователями, указывали, как полагали, на эквимолекулярные отношения двух пуриновых (аденин и гуанин) и двух пиримидиновых (урацил и цитозин) оснований. Позже применение хроматографии на бумаге [222] и, в меньшей степени, ионообменной техники дало быстрые и относительно точные методы количественного определения компонентов рибонуклеиновых кислот. При гидролизе нуклеиновой кислоты щелочью образуются мононуклеотиды, которые могут быть затем разделены либо как таковые, либо в виде нуклеозидов, после дефосфорилирования. Кислотный гидролиз, напротив, дает пуриновые основания и пиримидиновые мононуклеотиды. Спектрофотометрическое определение подвергнутых разделению компонентов после элюирования их с бумаги (с применением электрофореза [223] или хроматографии) или с ионообменной смолы позволяет получать молярные соотношения оснований. [c.404]

Применение ионообменной хроматографии и хроматографии на бумаге в дополнение к имевшимся методам быстрого анализа привело к разделению ряда минорных нуклеотидных компонентов в рибонуклеиновых кислотах. Многие из них в настоящее время идентифицированы, и выяснено, что они присутствуют в весьма малых количествах, составляющих 0,05—4% от общего числа звеньев урацила. Основания, входящие в состав таких, присутствую- [c.408]

Однако разделение ВТМ на РНК и белок сопровождается заметным уменьшением оптического поглощения, что указывает на то, что структуры в изолированной РНК, поддерживаемые внутренними водородными связями между основаниями, исчезают под влиянием особой упаковки белковых субъединиц в интактном вирусе, что, в частности, видно из рентгенограмм [368]. В отсутствие соли оптическое поглощение (при 260 жц) разрушенного вируса практически то же, что и у интактного вируса. Добавление солей вызывает немедленное уменьшение оптической плотности, обусловленное образованием связанной водородными связями (беспорядочными или какими-то иными) вторичной структуры у рибонуклеиновой кислоты. Нагревание этого раствора вызывает увеличение (на 25%) оптического поглощения РНК в интактном вирусе. Для сферического вируса кустистой карликовости характерна промежуточная стадия, когда при разрушении вируса на РНК и белок происходит небольшое уменьшение оптической плотности, а при нагревании оптическая плотность возрастает до значений, которые на 23% выше величины оптического поглощения интактных частиц. Более того, при щелочном гидролизе целого вируса [341] оптическая плотность возрастает на 47%, и поэтому РНК внутри вируса, по-видимому, обладает довольно упорядоченной вторичной структурой. Уровень упорядоченности структуры РНК внутри вируса повышен благодаря тому, что определенным образом упакованные [c.630]

Дезоксирибонуклеозид-5 -фосфаты и щелочные гидролизаты рибонуклеиновой кислоты из дрожжей анализировали методом двумерной хроматографии [58]. Чтобы удалить примеси из адсорбента, слои РЕ1-целлюлозы элюировали на расстояние 5 см 10 %-ным раствором хлорида натрия. Сейчас же вслед за этим помещали слои в растворитель — воду и элюировали дважды до самого верха. После сушки при комнатной температуре слои готовы для хроматографирования. Многостадийное хроматографирование предусматривает элюирование водой вплоть до начальной линии, затем 1 н. муравьиной кислотой (без промежуточной сушки) на расстояние 10 см и, наконец, элюирование 60 % -ным насыщенным раствором сульфата аммония во втором направлении на расстояние 8 см. Перед элюированием разделенных соединений со слоя адсорбента пластинку вымачивали в метаноле 15 мин, чтобы удалить избыточные соли, затем сушили и элюировали с нее разделенные соединения 60 %-ным насыщенным раствором сульфата аммония. [c.127]

Последние годы ознаменовались огромными успехами в изучении строения и функций важнейших биологически активных полимеров. Благодаря развитию новых методов разделения н очистки веществ (различные методы хроматографии, электрофореза, фракционирования с использованием молекулярных сит) и дальнейшему развитию методов рентгеноструктурного анализа и других физико-химических методов исследования органических соединений стало возможным определение строения сложнейших природных высокомолекулярных соединений. Изучено строение ряда белков (работы Фишера, Сейджера, Стейна и Мура). Установлен принцип строения нуклеиновых кислот (работы Левина, Тодда, Чаргаффа, Дотти, Уотсона, Крика, Белозерского) и экспериментально доказана их определяющая роль в синтезе белка и передаче наследственных признаков организма. Определена последовательность нуклеотидов для нескольких рибонуклеиновых кислот. Широкое развитие получили работы по изучению строения смешанных биополимеров, содержащих одновременно полисахаридную и белковую или липидную части и выполняющих очень ответственные функции в организме. [c.53]

Бариевые соли адениловой, гуаниловой, уридиловой и ци-тидиловой кислот являются наиболее удобной формой для выделения, хранения и применения нуклеотидов. Последние находят все больщее применение как для препаративных целей (синтез нуклеозидов, коферментов и т. д.), так и для биохимических исследований и в медицинской практике. Нуклео-зид-2 (3")-фосфаты бария могут быть получены из рибонуклеиновой кислоты щелочным гидролизом с последующим разделением методом ионообменной хроматографии и осаждением в виде бариевых солей. [c.93]

При проведении щелочного гидролиза в осадок выпадают различные примеси ненуклеотидного характера. Количество осадка зависит от чистоты исходного образца рибонуклеиновой кислоты н не оказывает существенного влияния па дальнейшее разделение. [c.99]

Все перечисленные изомеры мононуклеотидов хорошо известны. Смесь 2 - и З -фосфатов образуется при гидролизе рибонуклеиновых кислот наилучшим с препаративной точки зрения является щелочной гидролиз. Как будет подробно рассмотрено ниже, образование смеси 2 - и З -фос-фатов является следствием механизма гидролиза нуклеиновых кислот, и поэтому принципиально невозможно направить этот процесс таким образом, чтобы получить только 2 - или только З -замещенные изомеры. Эти изомеры с чрезвычайной легкостью переходят один в другой, и их разделение стало возможным лишь в последнее время в связи с развитием техники ионообменной хроматографии. [c.215]

Современную синтетическую и теоретическую органическую химию отличает широкое применение физических методов, которые облегчают выяснение структуры соединения и исследование механизма реакции. Современная органическая химия вооружена множеством специфических приемов для введения определенных групп в органические соединения, эффективными методами для разделения смесей и очистки веществ. Стабильной теоретической базой органической химии являются электронная теория и представления квантовой химии. В настоящее время можно синтезировать почти любое сложное органическое соединение, теоретически можно предсказать существование новых необычных соединений. Синтезированы природные соединения с очень сложной структурой алкалоиды стрихнин и морфин, зеленый пигмент растений хлорофилл, витамин В12 (Р. Вудворд), полипептиды с более чем 30 остатками аминокислот например, гормон инсулин человека, состоящий из 51 остатка аминокислот (П. Зибер), рибонуклеиновые кислоты, состоящие из 50 и более нуклеозидов (Г. Корана). [c.12]

Ионообменная хроматография в колонках со смолой дауэкс привела к открытию и разделению изомерных 2 - и 3 -мононуклеотидов [18]. Таким же образом были найдены и другие новые мононуклеотиды [18, 20, 27, 28]. Смилли [79] фракционировал мононуклеотиды из рибонуклеиновой кислоты на ионообменной бумаге. Он применил целлюлозную бумагу, пропитанную обменником амберлит . [c.446]

Большое количество полинептидов и биологических молекул, таких, как рибонуклеиновая кислота (РНК), дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), коллаген и вирус табачной мозаики (ВТМ), сушествуют в различных растворителях в- виде клубков из спиралей. Отношение главных полуосей таких молекул велико, что позволяет рассматривать их с гидродинамической точки зрения как палочкообразные. По достижении критической концентрации с в результате энергетически более выгодной упаковки палочкообразных молекул в растворителе происходит самопроизвольное образование упорядоченной фазы. Теория разделения системы палочкообразных молекул на упорядоченную и неупорядоченную фазы представляется хорошо обоснованной [13]. [c.257]

Стехелин и сотр. [162] частично деполимеризовали рибонуклеиновую кислоту из дрожжей при помощи рибонуклеазы поджелудочной железы. Затем пропускали образец через колонку длиной 30СМС диэтиламинозтилцеллюлозой и вымывали раствором бикарбоната аммония, постепенно повышая концентрацию аммиака. На элюентной кривой получается двадцать один пик не полностью разделенных компонентов. Первые тринадцать из них идентифицировали как нуклеотиды состава Ц, У, АЦ,, АУ, ГЦ, ГУ 4 ААЦ, ААУ, ГАЦ, АГЦ, ГАУ, АГУ, ГГЦ и ГГУ, где использованы следующие обозначения А — аденин, Г — гуанидин, У — уридин и Ц — цитидин. Последние восемь пиков на хроматограмме принадлежали, по-видимому, неидентифициро-ванным тетрануклеотидам. [c.335]

Прибор применялся для разделения белков, нуклеиновых кислот и нуклеопро-теидов бактериальных клеток. На рис. И приведен пример электрофореза растворимой рибонуклеиновой кислоты из клеток Es heri hia со и, меченной фосфором Р [c.75]

Электрофоретически можно разделять также и нуклеиновые кислоты, например, отделять рибонуклеиновую кислоту от дезоксирибонуклеиновой. Используя гель в качестве поддерживающей среды, можно увеличить эффективность разделения, так как размеры молекул рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот сильно отличаются друг от друга. [c.104]

Проба 0,3 мкг гидролизата рибонуклеиновой кислоты хроматограф мо дели ЬС8-1000 с ультрафиолетовым детектором шкала самописца соответствует 0,08 ед. оптической плотности способ разделения — анионообменная хроматография с использованием градиентного элюирования колонка длиной 300 см, внутренним диаметром 1 мм заполнена твердыми инертными частицами, покрытыми тонкой пленкой анионообменной смолы температура колонки 80 °С подвижная фаза — раствор КН2РО4, концентрация которого изменяется во времени от 0,01 М (pH 3,30) до 1,0 М (pH 4,3) скорость потока 12 мл/ч давление перед колонкой 35 ат [4]. [c.205]

Применение методов хроматографии на бумаге для быстрого анализа пуриновых и пиримидиновых оснований [76, 77] в гидролизатах небольших количеств рибонуклеиновых кислот вскоре показало, что молярная эквивалентность этих оснований скорее была исключением, чем общим правилом. Еще более важным было наблюдение, что разделение смеси нуклеотидов в щелочном гидролизате рибонуклеиновой кислоты при помощи ионообменной хроматографии дает изомерные пары нуклеотидов, являющихся, как позже было показано, нуклеозид-2 - и пуклеозид-З -фосфатами [78]. Хотя эти изомеры не подвергались взаимопревращению в щелочи, кислота легко катализировала миграцию фосфатного остатка между 2 - и З -гидроксильными группами. Таким же методом были обнаружены 5 -фосфаты аденозина, цитидина, гуанозина и уридина (среди прочих продуктов) после гидролиза кишечной фосфодиэстеразой рибонуклеиновых кислот, предварительно обработанных рибонуклеазой [79]. Со значительно более высокими выходами нуклео-зид-5 -фосфаты получены при действии диэстеразы змеиного яда на рибонуклеиновые кислоты из дрожжей и печени теленка гидролизаты содержали также свободные нуклеозиды и нуклеозид-2 (3 ),5 -ди-фосфаты [80]. [c.373]

Рандерат [42, 43] показал эффективность применения этого ионообменного вещества для разделения нуклеотидов. Довольно хорошее разделение на нем получено с 0,02 н. соляной кислотой. Аденозиндифосфат (ADP) нельзя отделить от 5 -уридинмоно-фосфата (UMP), а цитидиндифосфат ( DP) в какой-то степени перекрывает зоны этих двух соединеиий. Чтобы разделить эти соединения, которые остаются вблизи стартовой линии, можно провести элюирование 0,03 н. соляной кислотой. Этот элюат позволяет добиться лучшего разрешения СТР, UDP, АТР, GTP и иТР, хотя пятна в какой-то степени перекрываются. Хорошее разделение трифосфатов получают при повышении концентрации элюирующего растворителя до 0,04 н. и удлинении пути хроматографирования от примерно 9 до 12,8 см. Дайер [44] использовал двустадийное элюирование для разделения гуаниловой, ури-диловой, адениловой и цитидиловой кислот — продуктов щелочного гидролиза рибонуклеиновой кислоты. Перечисленные соединения были получены в результате 18-часового, гидролиза РНК дрожжей илн проростков ржи 0,3 н. раствором гидроксида калия при 37°С. Гидролизат освобождали затем от калия, пропуская через катионообменную смолу или осаждая калиевую соль хлорной кислотой. Первое элюирование проводили смесью [c.122]

После того как настоящая статья была уже написана, внимание автора привлекли две работы, посвященные использованию ионного обмена для разделения пиримидиновых нуклеозидов [62]. Эльмор, автор этих работ, пропускал водные растворы цитидина и уридина через колонки с сорбентом зеокарб 215 (сульфоуголь). В то время как цитидин задерживался катионным обменником благодаря наличию в своем составе основной аминогруппы, урндин не задерживался. Цитидин извлекался из колонки водным раствором аммиака. Смесь двух нуклеозидов была разделена, причем выход уридина был равен 99%, а цитидина 71—78в/о. Харрис и Томас применили тот же метод для выделения гуанозина и аденозина из гидролизата 20 дрожжевой рибонуклеиновой кислоты. Из фильтрата было получено [c.291]

Георгиев Г. П., Мантьева В. Л. 1982. Инфор.мационная и рибосомаль-ная рибонуклеиновые кислоты хромосомно-ядрышкового аппарата. Методы разделения и нуклеотидный состав.— Биохимия, 27, 5, 949—957. [c.21]

Первый эксперимент с применением метода центрифугирования в градиенте плотности [461] особенно наглядно продемонстрировал значение этого метода. В этом эксперименте бактерии выращивались на среде, богатой № , и поэтому дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) организмов, меченных изотопом тяжелого азота, обладала несколько большей плотностью, чем обычная ДНК. Через определенное время бактерии переносили в среду с обычным распределением изотопа азота и методом центрифугирования в градиенте плотности анализировали изменения плотности ДНК, выделенной из ряда последовательных генераций клеток. На основе предположения Уотсона и Крика [30] было принято, что редупликация ДНК во время деления клеток включает разделение двух цепей двойной спирали (см. стр. 130), причем каждая цепь служит матрицей для синтеза дополняющей ее цепи. Если этот механизм достоверен, то вторая генерация клеток, происходящих от клеток, меченных N , должна содержать ДНК, в которой изотопом тяжелого азота мечена одна из цепей каждой двойной спирали. В последующих генерациях должно возрастать количество ДНК с обычным распределением изотопов азота, однако при этом сохраняется также некоторое количество наполовину меченной ДНК. В любой данный момент времени в растворе должны присутствовать молекулы ДНК только с тремя четко определенными плотностями и никаких компонентов с промежуточной плотностью обнаруживаться не должно. Это предположение было полностью подтверждено данными по ультрацентрифугированию в градиенте плотности (рис. 55), и поэтому механизм редупликации ДНК, который раньше был лишь плодом смелых теоретических представлений, можно считать в настоящее время окончательно установленным. В относительно короткое время после этого классического эксперимента метод центрифугирования в градиенте плотности различными путями способствовал развитию биохимических исследований. Можно привести несколько примеров, иллюстрирующих это положение. Методом меченых атомов, подобным описанному выше, было установлено, что некоторая часть рибонуклеиновой кислоты (РНК) переходит в последующие генерации клеток в нативной форме [468]. Было найдено, что плотность ДНК является линейной функцией содержания гуанина и цитозина в различных микроорганизмах, и, таким образом, ДНК, выделенная из какого-либо вещества, образует в градиенте плотности полосу с характерным расположением [469, 470]. На диаграмме градиента плотности ДНК, полученной из тканей высших организмов, периодически обнаруживаются сателлит-ные полосы [471], которые могут быть обусловлены симбиозными организмами или другими, еще неизвестными причинами. Типичный пример этого эффекта изображен на рис. 56, который, между прочим, наглядно свидетельствует также о чувствительности метода обнаружения малых [c.165]

Окрашивание. В большинстве случаев перед анализом гели окрашивают. При разделении белков обычно применяют амидовый черный 10В, процион яркий синий RS и кумасси яркий синий R250 (последний обладает особенно большой чувствительностью). В продаже имеется много других красителей [66] для белков, дезокси-рибо- и рибонуклеиновых кислот. В литературе можно [c.268]

Бреслер С., Рубина X., Граевская Р., Васильева H., Разделение рибонуклеиновой и аденозинтрифосфорной кислот при помощи хроматографии на молекулярных ситах, Биохимия, 26, вып. 4, 745 (1961). [c.241]

Для выделения нуклеиновых кислот можно применять несколько методов (Шнайдер Огур и Розен Дейли и сотрудники). Огур и Розен разделяют уже при экстракции рибонуклеиновую (РНК) и дезоксирибонуклеиновую (ДНК) кислоты (Я 114). Для разделения нуклеиновых кислот в последнее время с успехом начинают примепять ионообменники на основе целлю- [c.507]