Радиоактивно меченный белок

Лабильные белки метят также при помощи реакций с 12 (проводимой в мягких условиях). Не вступивший в реакцию иод чаще всего восстанавливается до иодида, который затем нужно удалить из реакционной массы. Для этой цели часто применяют гель-фильтрацию на сефадексах G-25 и G-50 (см. литературу, приложение II). (Здесь не рассматривается в принципе аналогичное применение радиоактивного иода для анализа функции щитовидной железы этот важный аналитический метод клинической химии обсуждается в гл. V.) Следует помнить, что при работе с радиоактивными анионами могут в значительной степени проявляться ионообменные свойства сефадекса, нарушающие нормальный ситовой эффект. Поэтому особенно важно по возможности работать в разбавленных солевых растворах. [c.144]

Из таблицы видно также, что радиоактивность расщепляющихся катехинов внедряется в самые разнообразные соединения углеводы, аминокислоты, белки, органические кислоты, терпеноиды и пластидные пигменты. Следовательно, катехины подвергаются глубокому расщеплению до фрагментов, которые способны включаться в основной обмен растения. Любопытно, что наименьшая активность была обнаружена во фракции аминокислот, причем метились только ароматические аминокислоты. [c.121]

ДНК сосредоточена в хромосомах, и одной из замечательных черт этой кислоты является ее устойчивость в процессах обмена. Природа словно боится затронуть это важнейшее соединение, и реакции обмена веществ (метаболизма) как будто и не касаются драгоценной молекулы ДНК, в которой на таинственном языке записан весь план строительства будущего организма. В сложных молекулах биологически активных соединений часто наблюдается обмен групп или крупных фрагментов, если молекула находится в среде, содержащей эти группы. Так, белки, помещенные в среду, содержащую определенные аминокислоты, обменивают свои аминокислотные остатки на остатки аминокислот, имеющихся в окружающей среде. Это явление изучается с помощью изотопных методов. В вещества среды вводится какой-либо радиоактивный атом — молекула метится, и ее включение в состав белка удается зарегистрировать по появлению радиоактивности у белковых молекул. В молекуле ДНК содержится аденин. Если поместить ДНК в среду, содержащую меченый аденин, то можно убедиться, что аденин из среды не включается в молекулу ДНК— обмен не происходит. Если клетки начинают делиться, то меченая молекула входит в состав ДНК, но в дальнейшем остается в ней п не в какие обменные процессы не вступает. [c.78]

Особенно плодотворно изотопы применяются для исследования обмена веществ. Изучаемое вещество метят (поэтому метод получил название метод меченых атомов ), вводя в него радиоактивный изотоп меченое вещество вводят в организм. После его ассимиляции исследуют присутствие меченых атомов в различных химических фракциях в организме. Концентрация вводимого в организм радиоактивного изотопа должна быть небольшой, чтобы не нарушался обмен веществ, но такой, при которой, несмотря на разведение, изотоп мог бы быть обнаружен во всех выделяемых фракциях. Например, применение СОг с меченым углеродом позволило показать широкое участие двуокиси углерода в реакциях метаболизма бактерий и тканей живого организма, расширить наши представления о механизме фотосинтеза. Изотопный метод применяется в биохимии для количественного определения аминокислот в гидролизатах белков, содержания калия, натрия и других элементов в крови, для определения общего количества воды в живом организме, объема эритроцитов и плазмы в кровотоке и т. д. [c.12]

Характер расположения в мембране того или иного белка можно определить несколькими способами. Один из них основан на том, что меченные (флуоресцентными красителями или радиоактивными изотопами) водорастворимые реагенты не способны проникать через мембрану и поэтому ковалентно связываются со специфическими группами только на ее наружной стороне. После этого мембраны растворяют, белки разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле, а меченые белки идентифицируют либо по радиоактивности (радиоавтография гелей), либо по флуоресценции в ультрафиолетовом свете. Используя такое направленное мечение, можно определить, как конкретный белок (полоса в геле) ориентирован в мембране если он метится одновременно и на внешней стороне (вместе с нативными клетками и тенями без разрывов), и на цитоплазматической стороне (вместе с замкнутыми вывернутыми наизнанку пузырьками), то это, несомненно, трансмембранный белок. Альтернативный подход состоит в обработке либо наружной, либо внутренней поверхности мембраны не проникающими через нее протеолитическими ферментами если какой- [c.363]

Молекула ДНК обладает высоким отрицательным зарядом и, следовательно, в электрическом поле быстро движется к положительному электроду. При электрофорезе в полиакриламидном геле молекулы ДНК разделяются по размеру, так как меньшие молекулы легче и быстрее проходят через поры геля. Молекулы белка, связавшись с ДНК, вызывают уменьшение подвижности ее молекул в геле. Чем больше связавшийся белок, тем медленнее движется связанная с ним ДНК. Это явление лежит в основе метода, регистрирующего сдвиг подвижности в теле. С помощью этого метода удается обнаруживать даже следовые количества сайт-специфического ДНК-связывающего белка. Короткие фрагменты ДНК, длина и последовательность которых известна (полученные либо при клонировании ДНК, либо путем химического синтеза), метят радиоактивной меткой и смешивают с экстрактом клеток полученную смесь наносят на полиакриламидный гель и проводят электрофорез Если фрагмент ДНК соответствует области хромосомы, с которой связываются многие сайт-специфические белки, то при радиоавтографии выявляется серия полос, обладающих разной подвижностью. Белки, связанные с ДНК в каждой из полос геля, можно отделить, фракционируя затем клеточные экстракты (рис. 9-9). [c.102]

А. Белки в теле нейрона метят путем одноразового введения меченой аминокислоты (импульсная метка). Б. Некоторые из радиоактивных белков перемещаются по аксону с постоянной скоростью от 1 до 5 мм в сутки. В. Через несколько дней выявляются два пика радиоактивности, содержащие различные компоненты цитоскелета. Более быстрый пик содержит актин, а также много других белков, в том числе такие, которые обычно считают растворимыми белками цитоплазмы. [c.128]

Для оценки радиоактивности нуклеиновых кислот после электрофореза используют те же приемы, что были описаны в главе 3 для белков (счет радиоактивности жидких элюатов, растворение геля, авторадиография и непрямая авторадиография с интенсифицирующими экранами и, наконец, флюорография). В подавляющем больщинстве случаев нуклеиновые кислоты метят радиоактивным фосфором. Ввиду высокой энергии его -излучения для регистрации положения полос в геле пользуются авторадиографией или непрямой авторадиографией. [c.165]

Уменьшение количеств белков и пептидов, необходимых для анализа их структуры, является одной из центральных проблем, стоящих перед исследователями. С целью ее решения ведется поиск новых методов изучения структуры, в частности более чувствительных способов идентификации производных аминокислот (см. с. 61). Один из перспективных подходов заключается в широком использовании радиоактивных методов анализа. В ряде лабораторий при деградации пептидов в секвенаторе применяется радиоактивный или С-ФИТ1Д. Можно вводить радиоактивную метку непосредственно в анализируемый белок. Для многих белков это достигается добавлением радиоактивно меченных аминокислот непосредственно в питательную среду, на которой выращивается культура, являющаяся источником исследуемого белка. Таким же путем оказывается возможным радиоактивно метить белок избирательно по определенным аминокислотным остаткам. Если белок, радиоактивно меченный, например, по остаткам лейцина, анализировать с помощью секвенатора, то простое измерение радиоактивности экстрактов, содержащих анилинотиазолиноны, позволяет безошибочно определить, в каких положениях полипептидной цепи в N-концевой области белка расположены остатки лейцина (рис. 31). Аналогичным образом можно определить положение и других аминокислотных остатков. Такой прием используется для анализа N-koh-цевой последовательности предшественников белков, доступных лишь в ничтожно малых количествах. Для исследования полной структуры он, однако, не применяется из-за дороговизны и трудоемкости. [c.79]

Меркаптогруппа легко реагирует с различными ртутьорганиче-скими соединениями с образованием связи типа —Hg—5—, и из всех имеющихся реагентов для анализа меркаптогруппы в белках эти соединения являются, вероятно, наиболее специфичными по отношению к тиоспиртам. В результате реакции ртуть и органический остаток молекулы ртутьорганического соединения связываются с серой, и потому обе эти части можно метить радиоактивными изотопами. В случаях, когда эффекты внутреннего поглощения или интенсивная окраска образцов мешают измерению радиоактивности жидкостным сцинтилляционным счетчиком, удобно применять изотоп 2 Hg. Этот изотоп является источником -излучения и имеет период полураспада, равный 47 дням. Реагент, меченный этим изотопом, обеспечивает более чувствительный [c.355]

Возможность применения фeнилмepкyp-2 Hg-aцeтaтa и метил-меркур- С-иодида в определении меркаптогруппы в нерастворимом белке была изучена подробно [41]. В анализах, в которых не требовалось определять полумикроколичества этой группы, применим упрощенный метод, основанный на измерении уменьшения радиоактивности раствора какого-либо из этих реагентов после обработки им анализируемого образца. Были разработаны также методы определения изотопов и введенных в образцы, [c.356]

В анализе этим методом, описанном в работе [10], использовались и фeнилмepкyp-203Hg-aцeтaт, и метил- С-меркуриодид. До сих пор этот метод применяли лишь для анализа нерастворимых белков он включает в себя обработку образца водно-диметил-формамидным раствором с буфером (pH 9), содержащим большой избыток сульфита и меньший избыток радиореагента. Поскольку анализируемые образцы содержали также и меркаптогруппы, отдельно проводили анализ на содержание этих групп (см. гл. 15) и по разности результатов обоих анализов определяли содержание дисульфида в образце. Были разработаны три способа оценки суммарного содержания групп —S—S— и —S—И, аналогичные способам определения только группы —S—Н. Как и прежде для измерения радиоактивности реагента, меченного изотопом в анализе полумикроколичеств соединений предпочитали пользоваться счетчиками с твердыми сцинтилляторами. [c.366]

Что происходит с белковой оболочкой вируса после того, как он выпустил свою ДНК в бактерию Херши и Чейз заражали живых бактерий вирусом, но на этот раз метили радиоактивной серой белок. Затем они встряхивали зараженных бактерий в гомогенизаторе Уорин-га — аппарате, который служит для перемешивания смесей в лаборатории. В результате встряхивания в смесителе от бактерий отделялось более 80% меченого белка. Однако это воздействие не удаляло сколько-нибудь значительного количества ДНК и не нарушало размножения вирусов внутри бактерий. Этот опыт показал, что вирусный белок остается снаружи бактерии и его функция заканчивается после того, как ДНК вошла в клетку кроме того, он позволяет считать, что ДНК скорее всего связана с размножением. [c.141]

Итак, мы узнали, что ДНК исходного заразившего вируса вызывает образование в клетке и самой ДНК и белка. Как же она осуществляет эту задачу Путнэм и Козлов метили вирусы радиоактивным фосфором и наблюдали за радиоактивностью для того, чтобы узнать, что происходит с фосфором после того, как вирусы заражают бактерии. Они нащли, что примерно 40% меченого фосфора обнаруживается в потомстве вируса, а остальное остается в среде. В опытах с радиоактивным углеродом было показано, что это относится и к другим составным частям ДНК. Другими словами, 40% ДНК исходного вируса переходит к потомкам. [c.145]

Для многих исследований можно подобрать такой предшественник, который будет весьма специфичным ддя определенного класса макромолекул (например, лейцин для белка). В таких случаях меченые молекулы можно определить по их радиоактивности в присутствии других немеченых веществ. Однако для изучения различных вопросов метаболизма желательно использовать неспецифический предшественник, который будет включаться в пуклеиновые кислоты, белки и другие клеточные компоненты и метить их. В этом случае необходимо отделять и очищать каждый класс изучаемых молекул. Обзор методов химического фракционирования различных биополимеров приведен в ряде работ [2, 3]. Первая попытка использовать фильтры для улучшения фракционирования была сделана при разделении радиоактивности разных биополимеров после включения в них 1-С -глицина. Однако в этом случае полученные фракции нуклеиновых кислот были загрязнены пептидами, которые требовалось удалять [4]. [c.138]

Результаты экспериментов по репликации бактериофагов также свидетельствуют о генетической функции ДНК. Особенно показательными в этом отношении были опыты Херши и Чейза. Они метили или только белок или только ДНК вирусных частиц, инкубируя инфицированные бактерии в среде, содержащей соответствующие радиоактивные предшественники. Используя меченые по белку или по ДНК вирусные частицы, Херши и Чейз показали, что только вирусная ДНК (но не вирусный белок) проникает в бактериальную клетку. Позднее эти исследователи показали, что очищенная от примесей белков вирусная нуклеиновая кислота обладает инфекционностью, т. е. при введении в бактериальную клетку приводит к образованию полноценных вирусных частиц. В пользу генетической функции ДНК говорят также следующие аргументы [c.390]

Если бикарбонат метить С , то включение радиоактивности будет мерой индуцированного излучением карбок-силиро ания. После облучения из ядер печени крысы выделяли белки, нуклеиновые кислоты и липиды и в каждой фракции измеряли С . Обнаружено, что только 3—4% общей активности ассоциировано с ДНК, в то время как липидная фракция, составляющая только 2 вес. % ядра, содержала 30% всей активности. Это дает основание предполагать, что ДНК хорошо защищена от атаки радикалов, однако об этом следует пока говорить осторожно, так как нет уверенности в эффективности применяемого метода. Некоторые карбоксильные группы могли быть лабильными и поэтому выпадать из измерения после изолирования, и радиоактивность в липидной фракции могла быть просто связана с большой поверхностью внешних мембран, соприкасающихся с окружающей средой. Однако этот метод следует считать многообещающим для обнаружения местоположения радикалов, образованных в биологическом веществе. [c.126]

Радиоактивный фосфор применяется для исследования образования и роста костей и зубов. Поскольку изотоп Р быстрее усваивается растущими красными кровяными шариками, чем зрелыми, его применяют для лечения болезни крови, заключающейся в избыточном образовании красных кровяных шариков. Этот изотоп фосфора используют также для установления местонахождения раковых опухолей в области груди и опухолей мозга. Радиоактивный изотоп серы 8 вводят в белки и применяют для изучения процессов обмена последних его используют также для определения скорости обращения белков плазмы в организме. Радиоактивное железо Ре оказалось полезным при изучении образования красных кровяных шариков и гемоглобина при анемиях. Ацетилсалициловую кислоту, или аспирин,и другие салицилаты метят для исследования скорости гидролиза, поглощения и обмена салицилатов в организме. [c.57]

Связь постинфекционной РНК с рибосомами. Культуру . oli заражают фагом Т4 (в среднем на 30 частиц фага на клетку) и с 3-й по 5-ю минуту внутриклеточного развития фага метят С-урпци-лом. Затем рибосомы выделяют, очищают и центрифугируют в концентрированном растворе хлористого цезия, как описано выше. Максимум С-радиоактивности постинфекционной РНК находится непосредственно под максимумом поглощения. Следовательно, образовавшаяся под действием фага РНК связана только с рибосомами, дающими максимум Ь, т. е. теми рибосомами, которые (как выявлено в других опытах) активно участвуют в синтезе белка. [c.393]

Осп. работы посвящены химии белка. Изучал (с 1945) структуру инсулина. Разработал динитро-фторбепзольный метод идентификации концевых аминогрупп в пептидах, с помощью которого установил природу и последовательность чередования аминогрупп в инсулине, расшифровал его строение (1949—1954). Установил, что инсулин имеет общую формулу Сш Н ) )7 N6507580, три сульфидных мостика и состоит из двух цепей цепи А, содержащей 21 аминокислотных остаток, и цепи В, содержащей 30 аминокислотных остатков, Эти работы послужили основой для синт, получения инсулина и др. гормонов. Предложил (1965) метить РНК и ДНК, предназначенные для структурных исследований, радиоактивным изотопом фосфора Р, что позволило осуществлять работы с чрезвычайно малым колич-вом материала— 10 г. Установил структуру 58 РНК (120 оснований 1967) и ДНК фага ФХ174 (5375 основа- [c.403]

Были выявлены пять клонов, в которых степень устойчивости к колхицину варьировала от 3 до 180 раз. Плазматические мембраны метили метаболически радиоактивным глюкозамином полностью или только их поверхность с помощью галактозоксидазы — В Н4. Выделяли их из лекарственно чувствительных клеток и сравнивали белковый состав с помощью электрофореза в ДНС-полиакриламидном геле. Гликопротеид с высокой молекулярной массой (165—170 кД) был обнаружен в мембранах лекарственно устойчивых клеток, но отсутствовал в мембранах чувствительных к препаратам клеток. Количество этого белка, именуемого р-гликопротеидом, коррелирует со степенью лекарственной устойчивости в некоторых, но не всех клонах. р-Гликопротеид может составлять не более чем 4 % общего белка плазматической мембраны и действует, как предполагается, путем изменения текучести окружающего его липидного домена [c.103]

При изучении иммунных систем широко используется стандартный метод двойной иммунодиффузии, однако для получения тонких характеристик антител и антигенов может потребоваться анализ иммуноглобулинов в культуральных жидкостях или в сыворотках крови. В этих случаях сывороточные белки метят радиоактивным иодом, а иммуноглобулины, продуцируемые клетками в культуре, — биосинтетически или также иодом. [c.489]

Первый этап — включение изотопной метки в клеточные макромолекулы путем химического присоединения, биосинтеза или ферментативного катализа. Обычно клеточные белки метят иодированием с помощью лактопероксидазы (разд. И, А) или включением радиоактивных аминокислот в процессе биосинтеза в кратковременной клеточной культуре (разд. И, Б). Гликопротеиды и углеводы можно пометить методом восстановления бор-гидридом (разд. II, В) или путем биосинтетического включения радиоактивных сахаров (используя процедуру, сходную с описанной для включения аминокислот). [c.181]

Рис. 6.7. Электрофорез вирусных РНК и белков, меченных радиоактивной меткой, как описано в разд. 7. а — вирус метили >[ Р]-ортофосфатом в течение 24 ч и из очищенных вирионов экстрагировали РНК б — ФЭК метили [ 5]-метионином в течение 30 мин на разных сроках после заражения вирусом чумы птиц (штамм 34/Росток). Клетки разрушали кипячением в содержа щем ДД -Na буфере для нанесения проб и анализировали белки электрофо резом в 15%-ном полиакриламидном геле. К — белки из незараженных клеток Цифры под остальными дорожками обозначают время (в часах) после зара жения, когда вносили [ З]-метионин

Высокая чувствительность метода флюорографии позволяет в сочетании с авторадиографией производить сортировку пятен или полос в ПААГ по содержанию в них двух долгоживущих изотопов— и С. Таким образом можно обнаружить различия в составе двух сложных белковых смесей, например генетических вариантов. Белки одной смеси метят Н, а второй — С. Обе смеси объединяют и подвергают двумерному фракционированию в ПААГ по методу О Фаррелла (см. часть I). Пластинку можно высушить, импрегнировать сцинтиллятором и путем флюорографии зарегистрировать суммарную радиоактивность ( Н-)- С) на пленку Kodak XR-5 . С негатива удобно сделать контактный отпечаток — пятна радиоактивности будут белыми на темном поле. С того же высушенного геля путем авторадиографии на пленке Kodak NS-5T при комнатной температуре регистрируют практически только С. Накладывают вторую пленку на первую. Не закрытые черным белые пятна указывают белки, меченные [c.232]

Ж. Радиоактивно меченные фрагменты ДНК можно использовать пр выявлении сайт-специфических ДНК-связывающих белков мето дом торможения в геле, при очистке белков методом аффиннс хроматографии ДНК и при отборе бактерий, экспрессирующв определенный белок. [c.128]

Y-Радиоактивные препараты в последнее время приобрели большое значение в биохимии и особенно в радиоиммунологических исследованиях гл. 10), при которых антитела или другие белки часто метят радиоактивным Этот вид излучения легко регистрируют и измеряют радиоактивность у-излучателей с помощью производимых серийных у-счетчиков, где применяется внешний сцинтилляционный детектор, который работает по следующему принципу. Образец помещают в стеклянный или пластмассовый флакон и вводят внутрь большого кристалла Nal, активированного таллием [Nal(Tl)] это носит название счета в колодце (рис. 5-8). Поскольку у- 1учи имеют очень высокую энергию, они выходят за пределы образца и флакона без заметной потери энергии. С выходом в несколько процентов за время прохождения через кристалл они приводят к появлению электронов. Эти электроны в свою очередь возбуждают близлежащие части кристалла, в результате чего возникает флуоресценция, регистрируемая фотоумножителями. Как и в жидкостном сцинтилляционном методе, соответствующая электронная аппаратура превращает свет в регистрируемые электрические импульсы. При измерении 7-радиации нет необходимости в схеме совпаде- [c.120]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология